人类巨细胞病毒对人胚肺细胞HOX基因表达的影响

应用半定量RT PCR技术研究人胚肺 (HEL)细胞HOX基因的表达状态及人类巨细胞病毒 (HCMV)感染对HEL细胞HOX基因表达的影响。结果发现 :HEL细胞表达HOXB7基因 ;HCMV感染后 ,其表达上调 ;用全反式维甲酸 (ATRA)处理HEL细胞 ,HCMV对HOXB7基因表达的上调作用更强。提示HCMV可能通过影响HOXB7基因的表达导致胚胎发育畸形。 更多还原     

中药金叶败毒制剂体外抗人巨细胞病毒作用观察

目的：研究中药金叶败霉制剂(JYBD)抗人巨细胞病毒(HCMV)感染的可能机制。方法：采用体外细胞培养技术建立HCMV感染细胞模型，应用更昔洛韦(GCV)和JYBD进行干预，采用定量RT-PCR法检测干预后不同时间感染细胞HCMV即刻早期基因IE86 mRNA的表达水平，观察感染细胞的病变进展情况，同时采用放射免疫法测定受染细胞细胞因子TNF-α和IL-6的分泌水平。结果：JYBD与GCV对HCMV IE86 mRNA的表达以及HCMV所致细胞病变有明显的抑制作用，降低受染细胞TNF-α、IL-6的分泌水平，JYBD作用弱于GCV。结论：JYBD可通过抑制HCMV IE基因的转录。促进细胞因子的分泌而发挥体外抗HCMV作用。     

大蒜新素对人巨细胞病毒感染的人胚肺成纤维细胞凋亡的影响

目的 研究大蒜新素对人巨细胞病毒(HCMV)诱导感染的人胚肺成纤维细胞(HELF)凋亡的动态变化及凋亡调控基因bcl-2和fas mRNA表达的影响。方法 用流式细胞术测定HELF在高、低感染复数(MOI分别为2．5、0．25)HCMV感染后1、12、24、36、48、72、96h凋亡细胞比率；大、中、小剂量大蒜新素(9、6和3μg／mL)处理正常的和感染的HELF细胞(MOI为2．5)后上述各时间点凋亡细胞比率。用原位杂交法检测大剂量大蒜新素处理感染细胞(MIO为0．25)72h后bcl-2和fas mRNA表达强度变化，并与正常细胞和感染细胞对比分析。结果 正常细胞凋亡比率保持恒定低水平(凋亡率平均2．68％)；低、高感染复数感染细胞随时间延长凋亡细胞逐渐增多，凋亡率峰值分别达8．85％(96h)和25．63％(72h)；各剂量大蒜新素处理的正常细胞凋亡率增加，呈剂量依赖性，峰值分别为4．88％、6．47％和8．35％；但各剂量药物处理感染细胞后却使细胞凋亡比率下降，大剂量药物处理72h时效应最为明显，凋亡细胞比率由25．63％降至16．24％。正常细胞高表达bcl-2，低表达fas基因；感染HCMV后，bcl-2表达显著下调，fas表达明显增强；大蒜新素处理感染细胞后使bcl-2表达强度明显高于感染细胞，fas表达水平明显低于感染细胞，但仍未恢复到正常细胞水平。结论HCMV是HELF凋亡的强诱导剂；病毒可通过下调凋亡抑制基因bcl-2和上调凋亡促进基因fas而发挥致凋亡作用。大蒜新素本身可诱导HELF凋亡，但却能明显抑制HCMV诱导的细胞凋亡，其抑制作用可能与药物干扰HCMV影响凋亡调控基因bcl-2和fas表达有关。     

HCMV感染对HEL细胞HOXB2,HOXB3,HOXB4及HOX8基因表达的影响

目的 :研究人胚肺 (HEL)细胞HOXB2 ,HOXB3,HOXB4及HOXB8基因的表达状态及人类巨细胞病毒(HCMV)感染对HEL细胞HOXB2 ,HOXB3,HOXB4及HOXB8基因表达的影响。方法 :采用半定量逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)技术。结果 :HEL细胞表达HOXB2 ,HOXB3,HOXB4及HOXB8;HOXB2基因于HCMV感染后 15h表达增加 ,4 8h达高峰 ,随后回落 ,至 12 0h再达高峰。HEL细胞HOXB3和HOXB4基因的表达在HCMV感染后不同时间无明显变化。HOXB8基因于HCMV感染后 15～ 4 8h表达轻微下调 ,72h回升 ,96h表达增加 ,12 0h达高峰 ;ATRA能轻微上调HCMV感染晚期HEL细胞HOXB8基因的表达 ,但对HCMV感染后HOXB2和HOXB4基因的表达无明显调节作用。结论 :HCMV能诱导HOXB2及HOXB8基因表达异常 ,这可能在先天性HCMV感染导致胚胎发育畸形中起重要作用。     

体外人巨细胞病毒感染与核转录因子AP-1活化及原癌基因c-jun表达的研究

目的　研究人胚肺成纤维 (HEL)细胞感染人巨细胞病毒 (HCMV)后 ,转录激活蛋白 1(AP 1)活化和原癌基因c junmRNA表达的时序性变化 ,探讨其在HCMV感染中的作用。方法　采用原位杂交法检测c junmRNA的表达 ,凝胶电泳迁移率改变试验 (EMSA)检测AP 1活性。结果　HEL细胞感染HCMV后 15min ,c junmRNA即有阳性表达 ,30～ 6 0min达高峰 (P <0 0 1) ,以后逐渐下降 ,正常对照组HEL细胞无c junmRNA表达。HCMV感染后AP 1亦迅速被活化 ,至 2h达高峰 (P <0 0 1) ,其后有所下降 ,维持于一定水平。结论　HEL细胞感染HCMV后 ,c junmRNA表达迅速增加 ,AP 1活化。提示HCMV可能通过刺激原癌基因过度表达而参与细胞的信号传导 ,以干扰细胞增殖和分化的调控 ;AP 1活化为早期病毒基因有效表达所必需 ,并可启动一系列前炎性细胞因子的基因转录与蛋白合成。     

人类巨细胞病毒感染对人胚肺细胞HOXB1,HOXB5,HOXB6及HOXB9基因表达的影响

目的 :研究人胚肺 (HEL)细胞HOXB1,HOXB5 ,HOXB6及HOXB9基因的表达状态及人类巨细胞病毒(HCMV)感染对上述基因表达的影响。方法 :采用半定量逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)技术。结果 :①HEL细胞表达HOXB5和HOXB6 ,但不表达HOXB1和HOXB9;②HCMV感染后 ,HEL细胞HOXB6基因的表达上调 ,且被HCMV诱导表达HOXB9T ,而HOXB5基因的表达无明显改变 ,HOXB1基因仍旧不表达 ;③全反式维甲酸 (ATRA)能上调HCMV感染后HOXB9基因的表达 ,但对HCMV感染晚期HOXB6基因的表达有抑制作用。结论 :HCMV能诱导HOXB6和HOXB9基因表达异常 ,这可能在先天性HCMV感染导致胚胎发育畸形中起重要作用     

HCMV感染对人胚肺成纤维细胞MCM2和MCM8表达的影响

目的研究HCMV感染对人胚肺成纤维（HEL）细胞微小染色体维持蛋白2（MCM2）和微小染色体维持蛋白8（MCM8）表达的影响，探讨HCMV感染可能的发病机制。方法用HCMV感染血清饥饿法同步化的HEL细胞。HCMV感染的HEL细胞作为HCMV感染组，同时设非感染组为对照组。于HCMV感染后12、24、48、72和96h收获细胞，提取总RNA，采用半定量逆转录-聚合酶链反应技术（RT-PCR）检测HEL细胞MCM2和MCM8 mRNA的表达水平。结果12、24、48、72、96h时2组细胞MCM2和MCM8 mRNA表达水平差异均有显著性（P均〈0.05），12h和24h时HCMV感染组表达水平低于非感染组，48、72、96h时HCMV感染组表达水平明显高于非感染组。非感染组MCM2、MCM8 mRNA表达水平的高峰出现在感染后24h，而HCMV感染组表达水平的高峰则出现在感染后48h，较之有明显滞后。结论HCMV能诱导HEL细胞MCM2及MCM8 mRNA表达异常．使MCM2及MCM8 mRNA表达水平迟滞，这可能是HCMV感染阻滞宿主细胞周期的发病机制之一。     

人巨细胞病毒对细胞周期调控靶点-p53的影响

目的:了解HCMV对细胞周期调控靶点p53的影响。方法:建立体外HCMV感染HEL模型，用倒置显微镜观察不同时间下各组HEL的病变效应和用S—P免组化法检测p53蛋白的表达并以FQ—PCR法检测HEL细胞内HCMVDNA拷贝数。结果:(1)HCMV感染使HEL细胞发生病变，细胞内HCMVDNA拷贝数随时间的延长逐渐增加。(2)S—P免疫组化结果提示HCMV感染使HEL细胞p53蛋白的水平升高。结论:HCMV的感染改变了细胞内p53的水平，可能影响其在细胞周期中的正常功能，营造可能有利于病毒复制的环境。     

人类巨细胞病毒对人胚肺细胞HOXB1，HOXB1，HOXB5，HOXB6及HOXB9基因表达的影响

目的：研究人胚肺（HEL）细胞HOXB1，HOXB5，HOXB6及HOXB9基因的表达状态及人类巨细胞病毒（HCMV）感染对上述基因表达的影响。方法：采用半定量逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）技术。结果：①HEL细胞表达HOXB5和HOXB6，但不表达HOXB1和HOXB9；②HCMV感染后，HEL细胞HOXB6基因的表达上调，且被HCMV诱导表达HOXB9T，而HOXB5基因的表达无明显改变，HOXB1基因仍旧不表达；③全反式维甲酸（ATRA）能上调HCMV感染后HOXB9基因的表达，但对HCMV感染晚期HOXB6基因的表达有抑制作用。结论：HCMV能诱导HOXB6和HOXB9基因表达异常，这可能在先天性HCMV感染导致胚胎发育畸形中起重要作用。     

重组人巨细胞病毒pp65蛋白与金叶败毒颗粒联合抗人巨细胞病毒效应

目的 比较重组人巨细胞病毒(HCMV)pp65蛋白与中药金叶败毒颗粒的抗HCMV作用并探讨二者间的关系.方法 用重组HCMV pp65蛋白刺激培养的人外周血单个核细胞,制备HCMV抗原特异性细胞毒T细胞,即pp65-CTL.分别将pp65-CTL、金叶败毒颗粒、pp65-CTL 金叶败毒颗粒、更昔洛韦作用于HCMV感染的人胚肺成纤维细胞(HEL),比较各组对HEL细胞病变的抑制作用,同时用RT-PCR法半定量检测作用前和作用不同时间点HCMV mRNA表达水平的变化.结果 pp65-CTL组在HEL细胞感染后72 h才开始出现少许细胞病变,有显著抗HCMV作用;pp65-CTL 金叶败毒颗粒组作用不同时间点对HCMV mRNA表达及HCMV所致细胞病变的抑制作用明显强于单一用药.结论 重组HCMV pp65蛋白刺激培养的pp65-CTL对HCMV有明显的抑制作用,与中药金叶败毒颗粒有显著的协同作用,可共同应用于HCMV活动性感染的治疗.     

中药金叶败毒制剂抗人巨细胞病毒感染作用机理的实验研究

目的探讨中药金叶败毒制剂拮抗HCMV感染的机理。方法采用体外实验的方法建立HCMV感染细胞膜型,给予金叶败毒制剂干预后,FQ-PCR法检测细胞内、维持液HCMV DNA拷贝数,放射免疫法测定TNF-α、IL-6蛋白含量,同时观察致细胞病变作用(CPE)的产生及传播,设立病毒对照组和更昔洛韦(GCV)药物对照组。结果分别于感染后24h、48h,实验组细胞内及维持液HCMV DNA拷贝数(5.35±0.581gGE/106HEL,2.78±0.32lgGE/106HEL)明显低于病毒组(6.12±0.65lgGE/106HEL,3.31±0.381gGE/106 HEL,P<0.05),持续至感染晚期,与药物对照组比较,感染晚期实验组细胞内病毒负荷量(7.97±0.81lgGE/106HEL)高于药物对照组(7.05±0.71lgGE/106HEL,P<0.05),但两者维持液内病毒量无明显差异(P>0.05)。分别于感染后12h、24h,实验组维持液TNF-α、IL-6蛋白含量(0.63±0.06pg/ml,38.26±4.19pg/ml)明显高于病毒组(0.55±0.04pg/ml,31.12±4.53pg/ml,P<0.05)和药物对照组(0.56±0.05pg/ml,32.40±4.97pg/ml,P<0.05),在感染后24～36h达高峰(P<0.01)。实验组和药物对照组CPE出现(感染后96h)均晚于病毒组(感染后48h),且发展缓慢,感染后168h仅为++,而病毒组则达到++++。结论金叶败毒制剂可有效抑制感染细胞内HCMV DNA复制及病毒自受染细胞内释放,并能促进     

二氯醋酸二异丙胺对LPS/D-GalN致小鼠肝损伤的保护作用研究

目的研究二氯醋酸二异丙胺(DADA)对脂多糖(LPS)加D-氨基半乳糖(D-GalN)诱导的小鼠肝细胞凋亡的作用及其机制。方法 D-GalN/LPS腹腔注射构建小鼠肝细胞凋亡模型。实验分为3组,各组注射D-GalN/LPS后6h,检测血清ALT、TBIL、TNF-α水平,TUNEL法与DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡,Western blotting检测Caspase-3、tBid、细胞色素C,在肝细胞浆中的表达。结果模型组与对照组相比,血中ALT、TBIL、TNF-α水平明显升高,肝细胞凋亡加重;肝细胞浆中,tBid、Caspase-3及细胞色素C的表达明显增加。与模型组相比,保护组肝功能改善,TNF-α水平明显降低;同时,肝细胞凋亡减轻,tBid、Caspase-3及细胞色素C的表达减少。结论 DADA可能通过下调TNF-α水平,抑制tBid的表达及细胞色素C的释放来减轻D-GalN/LPS诱导的肝细胞凋亡。     

不同核心启动子对中国仓鼠卵巢细胞重组蛋白表达的影响

目的 探讨不同核心启动子对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞重组蛋白表达的影响.方法 以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因为报告基因,分别构建以巨细胞病毒(CMV)启动子、Natural CMV启动子、超级核心启动子(SCP)2和SCP3驱动的表达载体并转染CHO细胞,根据转染表达载体的不同将细胞分为对照组、Natural C...     

更昔洛韦联合中药金叶败毒制剂体外抗人巨细胞病毒作用观察

目的：研究更昔洛节(GCV)联合中药金叶败毒制剂(JYBD)抗人巨细胞病毒(HCMV)感染的可能机制。方法：采用体外细胞培养技术建立HCMV感染细胞模型．应用GCV、JYBD及两药联用进行干预,采用定量RT-PCR法检测干预后不同时间感染细胞HCMV即刻早期基因IE72 mRNA的表达水平,观察感染细胞的病变情况,同时采用放射免疫法测定受染细胞TNF-α和IL-6的分泌水平。结果：JYBD与GCV对HCMV IE72 mRNA的表达以及HC-MV所致细胞病变有明显的抑制作用,降低受染细胞的TNF-α、IL-6的分泌水平,JYBD作用弱于GCV,2药联合作用最强。结论：GCV联合JYBD可通过促进细胞因子的分泌,调节免疫功能,具有良好的体外抗HCMV作用。     

FasL反义RNA抑制人T淋巴细胞致凋亡作用的研究

目的：探讨反义RNA抑制活化T淋巴细胞FasL的表达及其对Fas阳性细胞的致凋亡作用。为FasL反义RNA的应用提供实验依据。方法：获得FasL反义RNA重组逆转录病毒，调整感染滴度后转染活化人外周血单个核细胞(HPBMC)。采用流式细胞仪检测转染细胞表面FasL的表达以及对Fas^ IL-60细胞的致凋亡能力。结果：空病毒载体的重复转染上调活化HPBMC FasL的表达，但转染重组病毒能有效抑制活化HPBMC表达：FasL，表达率由13．93％下降至7．19％；FACS检测HL-60细胞的凋亡显示，转染重组病毒使活化：HPBMC对IL-60细胞的致凋亡作用明显下降，凋亡率由33．48％降为17．28％。结论：FasL反义RNA能有效抑制活化淋巴细胞表达FasL及由其介导的凋亡作用，但究竟采用何种载体转录FasL的反义RNA有待研究。     

Xaf1通过胱冬肽酶非依赖机制释放细胞色素C诱导凋亡

[目的]利用基因开关调节Xaf1-Saos诱导细胞株,检测Xaf1对肿瘤坏死因子受体(TNFR)(外源性)以及线粒体(内源性)凋亡信号通路的影响,研究Xaf1诱导肿瘤细胞凋亡的机制.[方法]流式细胞术DNA含量检测Xaf1诱导的细胞凋亡和Bcl2对Xaf1-Saos细胞凋亡的影响,Gel Mobility Shift Assay检测NFkB的DNA结合活性,激酶分析法检测SAPK/JNK激酶的活性,细胞色素C流式细胞术检测Xaf1对细胞色素C释放的调节.[结果]Xaf1与TNFα显著协同诱导细胞凋亡,凋亡峰值49%,Xaf1的表达抑制TNFα介导的NFkB的DNA结合活性(50%)和JNK/SAPK的活性,Xaf1可释放细胞色素C,而且不被胱冬肽酶抑制剂所抑制(Z-VAD).[结论]Xaf1通过胱冬肽酶非依赖机制释放细胞色素C而诱导肿瘤细胞凋亡.     

A20和Caspase 3在异基因CD8~+T细胞致人脐静脉内皮细胞凋亡中的表达及意义

目的 探讨异基因造血干细胞移植时,供体CD8 T细胞致受体人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡中A20蛋白及Caspase 3的表达及意义.方法 采用密度梯度法分离人周围血单个核细胞,CD8 T细胞亚群阴性分选柱试剂盒分选出CD8 T细胞.HUVEC细胞株经过5 ng/ml TNF-α处理后与CD8 T细胞进行混合培养.以AnnexinⅤ和PI双标后,流式细胞仪对HUVEC进行凋亡分析,用全波长荧光分光光度计测定凋亡相关蛋白Caspase 3的活性.Western blot法检测HUVEC中A20蛋白的表达.结果 异基因CD8 T细胞在与HUVEC混合后可引起HUVEC凋亡,流式细胞仪检测显示24 h时的早期凋亡率最高,达(83.6±0.42)%.而晚期凋亡相关蛋白Caspase 3活性在48 h时达高峰,荧光强度为(13.585±0.269), 此后显著降低,与对照组比较差异有极显著性意义(P<0.01).A20蛋白的表达与HUVEC的凋亡率呈负相关(r=-0.839, P<0.05).结论 体外供体CD8 T细胞致受体HUVEC凋亡过程中,信号蛋白Caspase 3的激活介导了凋亡的发生,而A20可能对其起负调节作用.     

人巨细胞病毒负荷量对细胞病变的影响

目的探讨感染后人巨细胞病毒负荷量与细胞病变的关系。方法采用不同滴定度的人巨细胞病毒感染传代培养的人胚肺成纤维细胞,建立人巨细胞病毒梯度感染细胞模型,荧光定量PCR法测定感染细胞内及其维持液病毒DNA量,光镜观察致细胞病变作用,电镜检查其超微结构的改变。结果人巨细胞病毒感染后,细胞内与其维持液病毒DNA量成正相关(r=0.83,P<0.01)。当细胞内病毒DNA量>105GE/106HEL时,病毒开始自细胞内释放;当维持液病毒DNA量>103GE/ml时,细胞出现病变。结论人巨细胞病毒感染后,受染细胞排放病毒致细胞外,且细胞内外病毒负荷量成正相关。细胞病变的发生情况与细胞内及其周围环境的病毒负荷量均密切相关。     

慢病毒介导HIF-1α沉默对缺氧肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响

目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,转染293T细胞包装产生慢病毒,转染人肝癌细胞株HepG2细胞,嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。将HepG2细胞分为正常对照组、干扰对照组(转染NC-shRNA)、干扰组(转染HIF-1α-shRNA),应用化学缺氧法(150μmol/L CoCl2)模拟肿瘤细胞缺氧微环境,应用Western Blot检测HepG2细胞中HIF-1α蛋白表达证实基因沉默效果,CCK-8检测沉默HIF-1α基因对HepG2细胞增殖的影响,Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测沉默HIF-1α基因对细胞凋亡的影响。Western Blot检测HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和细胞质细胞色素C(Cyt-C)表达的变化。结果:①成功构建HIF1α-shRNA慢病毒载体并转染HepG2细胞,缺氧培养细胞24h后,与正常对照组及干扰对照组相比,干扰组细胞内HIF-1α蛋白表达明显降低(P<0.01),证实慢病毒载体能够有效沉默HIF-1α基因。②沉默HIF-1α基因后缺氧培养的HepG2细胞增殖率下降(P<0.05),而细胞凋亡比例升高(P<0.01)。③Western Blot结果显示,与正常对照组及干扰对照组相比,沉默HIF-1α基因后细胞内凋亡相关蛋白Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和细胞质Cyt-C表达上调(P<0.05或P<0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.01),Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高。结论:通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默缺氧HepG2肝癌细胞HIF-1α基因,HIF-1α沉默能显著抑制缺氧HepG2细胞增殖活性,促进细胞凋亡,其凋亡途径可能与激活内源性线粒体凋亡通路有关。     

HCMV感染对HEL细胞MCM装载因子Cdt1的影响

目的 研究人类巨细胞病毒(HCMV)感染对人胚肺成纤维(HEL)细胞的MCM装载因子Cdt1表达的影响,从分子水平上探讨HCMV的发病机制.方法 用血清饥饿法同步化HEL细胞于G0/G1期,用HCMV感染同步化的HEL细胞作为感染组,同时设模拟感染组为对照组.于感染后12、24、48、72和96h收获细胞,用免疫细胞化学法检测两组细胞核内HCMV Cdt1蛋白.结果 12、24、和96 h两组HEL细胞Cdt1蛋白水平均差异有显著性(P<0.05),而48、72h两组HEL细胞Cdt1蛋白水平无明显差异(P>0.05).12和96h感染组较模拟感染组明显降低,24 h感染组较模拟感染组明显升高.模拟感染组在感染后12 h时Cdt1蛋白表达水平最高,然后逐渐下降,至24h时达最低水平,96 h又稍有回升;感染组在感染后12 h Cdt1蛋白表达水平较低,24 h达到最高峰,48 h时急剧下降,一直维持较低的稳定水平.结论 HCMV诱导Cdt1蛋白表达延迟,从而影响了MCM复合物的装载和pre-RC的形成,使细胞停滞在G1期,阻止DNA的复制.