应用焦磷酸测序法检测进展期结直肠癌中K-ras基因点突变

目的建立基于焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)的结直肠癌K-ras基因点突变的检测方法,并应用于进展期结直肠癌及其转移灶中K-ras基因突变的检测。方法提取116例Ⅳ期结直肠癌及11例转移灶中的DNA,进行PCR扩增后应用Pyrosequencing法检测K-ras基因12及13密码子点突变。结果 116例Ⅳ期结直肠癌中有29例检出K-ras基因点突变,突变率为25.0%,在所有29例突变病例中12密码子点突变率为82.8%(24/29),13密码子点突变率为17.2%(5/29),所有11例转移灶的K-ras基因均与其原发病灶相一致。结论 Pyrosequencing能准确、快速、高通量地进行K-ras基因点突变测定,适合大规模临床标本检测,有利于指导结直肠癌尤其是转移性病变的个体化治疗。     

结直肠癌患者BRAF,KRAS,NRAS和PIK3CA基因突变与其病理特征的关系

目的:探讨265例结直肠癌患者BRAF,KRAS,NRAS和PIK3CA基因突变及其病理特征关系。方法:选取2014年12月至2016年12月的265例结直肠癌患者肿瘤组织标本进行回顾性分析,采用PCR扩增–直接测序法检测BR AF基因(15外显子600密码子),KR AS基因(12,13,61密码子突变),NRAS(2号与3号外显子的12密码子、13密码子与61密码子常见的12个突变位点)及PIK3C A(第9,20外显子)基因的突变状态,分析其与结直肠癌临床病理特征的关系。结果:265例患者中存在BRAF基因突变率为6.8%(18/265),KRAS基因突变率为32.1%(85/265),NRAS基因突变率为5.7%(15/265),PIK3CA基因突变率为11.3%(30/265)。NRAS基因和KRAS基因突变与年龄有关(P0.05),与性别、原发部位、组织学类型、分化程度、TNM分期、区域淋巴结转移、远处转移、术后复发转移均无关(P0.05);BRAF,PIK3CA基因在原发部位为右半结肠患者中的突变率明显升高(P0.05),但与年龄、性别、组织学类型、分化程度、TNM分期、区域淋巴结转移、远处转移、术后复发转移均无关(P0.05)。结论:NRAS,PIK3CA基因在中国结直肠癌患者中的突变率较低。KRAS,NRAS基因突变与年龄相关,BRAF,PIK3CA基因与肿瘤原发部位相关,联合检测这些基因的突变情况可以判断疾病的发生发展。     

大肠癌患者K-ras基因突变情况及临床意义

目的研究大肠癌患者K-ras基因的突变情况及其与临床病理特征间的关系。方法应用RT-PCR方法检测148例大肠癌患者组织标本K-ras基因第12和13密码子的突变情况,并与其临床病理特征进行对照。结果 148例大肠癌患者K-ras基因突变率为31.8%(47/148)。K-ras基因第12和13密码子突变在不同性别、肿瘤直径、大体形态、肿瘤部位、远处及淋巴结转移方面差异无统计学意义(P>0.05),在不同年龄与不同临床分期上差异有统计学意义(P<0.05)。结论 RT-PCR可准确检测K-ras基因突变情况,K-ras基因突变与患者年龄、肿瘤临床分期关系密切。     

焦磷酸测序法检测结直肠癌患者K-ras基因外显子2第12和13密码子点突变

目的 探讨焦磷酸测序法检测结直肠癌患者肿瘤组织K-ras基因外显子2第12和13密码子点突变方法的临床应用价值.方法 以已知K-ras基因突变的结直肠癌细胞株SW480、DLD-1和野生型细胞株HT-29 DNA作为测序模板检验焦磷酸测序法的准确性.对含不同比例(2％、3％、5％、10％、20％、30％和50％)结直肠癌细胞株K-ras基因的DNA混合样本采用焦磷酸测序法进行基因突变率检测,并与Sanger测序结果平行进行Fisher精确检验比较,评价其灵敏度.同时用焦磷酸测序法检测分析30份临床结直肠癌患者石蜡包埋组织中K-ras基因第12和13密码子突变.结果 当混合已知突变类型的结直肠癌细胞株K-ras基因的DNA样本突变DNA比例在5％和10％浓度时,Sanger测序法检出K-ras基因突变率分别为33.3％ (4/12)和58.3％ (7/12),焦磷酸测序法分别为91.7％(11/12)和100％( 12/12),且2种方法检出K-ras基因突变率的差异有统计学意义(P＜0.05).此外,用焦磷酸测序法从30例结直肠癌患者石蜡包埋组织标本中检出K-ras基因外显子2第12和13密码子突变10例,均为杂合型突变,突变率为33.3％ (10/30).最常见的突变类型为G＞A转换[50％(5/1O)]和G＞T颠换[(30％(3/10)].结论 焦磷酸测序法检测结直肠癌K-ras基因外显子2第12和13密码子突变具有敏感、准确的优点,可用于临床个体化治疗中肿瘤基因突变检测.     

某地区结直肠癌患者KRAS基因及BRAF基因突变状态的检测分析

目的 检测某地区结直肠癌患者KRAS基因和BRAF基因的突变状态及其与年龄、性别的关系.方法 由某地区30例结直肠癌患者石蜡组织中提取DNA,通过直接测序法及荧光定量PCR法检测KRAS基因及BRAF基因突变状态.结果 KRAS基因突变率为43.3%,共发现6种突变类型,主要位于12、13密码子,其中以c.38G>A突变率最高(38.5%).单因素及多因素分析均提示KRAS突变与年龄或性别无相关性.BRAF基因突变率为0.结论 某地区结直肠癌患者KRAS基因突变率高,靶向治疗前进行突变状态检测具有重要临床价值.     

结直肠癌患者组织中K-ras和BRAF基因突变与不同病理特征的相关性分析

目的分析K-ras基因、BRAF基因突变在结直肠癌(CRC)不同病变中的特点,从而探索CRC基因治疗的靶点。方法采用实时荧光定量PCR法检测130例CRC患者肿瘤标本的K-ras基因、BRAF基因突变情况,并按不同的临床特征进行分析。结果 K-ras基因突变率在所有CRC患者中为36.15%(47/130),其在直肠癌患者中的突变率明显高于结肠癌患者[47.62%(30/63)vs 25.37%(17/67)],差异有统计学意义(χ~2=6.691,P0.01),直肠癌患者Gly12ASP位点的突变率显著高于结肠癌患者[46.03%(29/63)vs 26.87%(20/67)],差异有统计学意义(χ~2=5.167,P0.05);在Ⅰ+Ⅱ期CRC患者中的突变率显著低于Ⅲ+Ⅳ期CRC患者[15.28%(11/72)vs 62.07%(36/58)],差异有统计学意义(χ~2=30.469,P=0.000)。BRAF基因突变率在所有CRC患者中为6.92%(9/130),其在结肠癌患者中的突变率明显高于直肠癌患者[11.94%(8/67)vs 1.59%(1/63),使用Fisher确切概率法P0.05];BRAF基因突变率在CRC患者术前血清CA199水平升高者明显高于水平正常者[11.59%(8/69)vs 1.64%(1/61),使用Fisher确切概率法P0.05]。K-ras基因突变率与具体的病理学特征如性别、年龄、组织学分型等无统计学相关性(P0.05)。结论在CRC患者中,K-ras基因突变较BRAF基因突变更为常见,且直肠癌患者较结肠癌患者更易表现为K-ras基因突变;K-ras基因突变率越高,CRC患者的TNM分期就越高;K-ras基因上Gly12ASP位点的突变与直肠癌的发生发展密切相关,血清CA199水平可作为BRAF基因突变的标志性物质。K-ras和BRAF基因突变靶点的相关研究有望为CRC的分子靶向治疗提供有力的理论支持。     

同时性结直肠癌原发灶和肝转移灶中KRAS基因突变的一致性分析

目的:比较KRAS基因突变率在结直肠癌原发灶和肝转移灶之间的差异,并探索KRAS突变对初始可切除同时性结直肠癌肝转移患者同期切除术后预后的影响。方法:回顾性分析同期切除的139例同时性结直肠癌肝转移患者的临床病理资料。运用Pyrosequencing焦磷酸测序法检测原发灶和转移灶中KRAS基因的突变情况,比较两者之间KRAS突变率的差异;同时采用Kaplan-Meier生存分析和Cox回归模型分析KRAS突变对预后的影响。结果:139例患者的围手术期死亡率为0%,并发症发生率为28.1%。28.8%(40/139)的患者原发灶中KRAS发生了突变;KRAS突变和临床病理因素无明显相关性。KRAS突变率在原发灶中为29.5%(28/95),在转移灶中为31.6%(30/95),两者间差异无显著统计学意义(P=0.157)。KRAS突变与总生存时间无相关性,与较短的无疾病生存时间相关(P=0.041),且是短的无疾病生存时间的独立预后因素(P=0.012)。结论:KRAS突变率在原发灶和转移灶中存在高度一致性,且与短的无疾病生存时间相关,在决定同期手术决策时需要考虑KRAS状态。     

560例中国结直肠癌患者K-ras基因突变研究

目的探讨结直肠癌患者K-ras基因突变状态并为个体化治疗提供指导。方法采用嵌套和COLD-PCR的方法分析560例结直肠癌患者K-ras基因突变状态。结果 560例患者K-ras基因总体突变率27.08%,128例血浆标本突变率为0,432例组织标本突变率为27.08%。突变类型包括G12S、G12C、G12D、G12A、G12V、G13R、G13C、G13D、Q61K、Q61L,2种不同K-ras基因突变率比较,差异有统计学意义(P0.000 1)。362例男性患者的突变率为20.44%,包括G12S、G12C、G12D、G12V、G13R、G13C、G13D、Q61K、Q61L;198例女性患者的突变率为21.72%,包括G12S、G12C、G12D、G12A、G12V、G13R、G13D,不同性别间K-ras基因突变率比较,差异无统计学意义(P=0.722 7)。80例年轻患者的突变率为20%,包括G12S、G12C、G12D、G12V、G13D;127例中年患者的突变率为33.07%,包括G12S、G12D、G12A、G12V、G13R、G13C、G13D、Q61K、Q61L;353例老年患者的突变率为16.71%,包括G12C、G12D、G12V、G13R、G13D,不同年龄间K-ras基因突变率比较,差异有统计学意义(P=0.000 5)。结论 560例结直肠癌患者K-ras基因突变类型主要为G12D、G12V、G13D,K-ras基因突变在不同标本类型、不同年龄间存在差异,不同性别间无差异。     

磷脂酰肌醇3—激酶在结直肠癌肝转移原发灶及转移灶中的表达及临床意义

目的 探讨磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PIK3CA）与结直肠癌肝转移的相关性及临床意义。方法 收集2020—2022年内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院经外科手术切除且病理类型为腺癌的结直肠癌肝转移患者30例,不伴有肝转移结直肠癌患者30例,通过免疫组织化学染色法检测PIK3CA蛋白在结直肠癌患者原发病灶、结直肠癌肝转移患者原发灶及肝转移灶组织中的表达情况,同时分析PIK3CA蛋白表达与结直肠癌肝转移患者临床病理特征之间的关系。结果 (1)试验组与对照组患者性别、年龄、原发肿瘤位置、大体类型差异无显著性（P>0.05）,两组患者在PIK3CA蛋白表达水平、T分期和N分期方面的差异有显著性（P<0.05）;(2)结直肠癌原发灶和肝转移灶中PIK3CA的表达差异无显著性（P>0.05）;结直肠癌原发灶与肝转移灶PIK3CA高表达结果一致性较好（κ=0.842,P<0.001）;(3)结直肠癌伴肝转移患者PIK3CA蛋白的表达水平与T分期（P<0.05）、病理大体类型（P<0.01）、肿瘤细胞分化程度（...     

吸烟指数与肺癌患者支气管肺泡灌洗液中的K-ras基因突变

背景肺癌的高发与许多因素有关,吸烟是重要原因之一,及早诊断对肺癌治疗尤其重要.目的探讨肺癌患者吸烟与支气管肺泡灌洗液中细胞K-ras基因突变的关系.设计以患者为研究对象的随机对照实验研究.单位一所大学放射医学与公共卫生学院卫生毒理学教研室,一所大学医院呼吸内科.对象选择在苏州大学第二附属医院1999-07/2001-09住院及门诊接受经纤维支气管镜行支气管肺泡灌洗术并取得细胞学或病理学确诊的肺癌、良性疾病患者.方法应用聚合酶链反应结合限制性片段长度多态性分析法,检测37例吸烟肺癌患者、25例非吸烟肺癌患者以及20例肺良性疾病患者支气管肺泡灌洗液中细胞K-ras基因第12位密码子突变的情况.主要观察指标K-ras基因第12位密码子突变.结果肺癌患者K-ras基因突变率为36%(22/62),肺良性疾病患者中未发现K-ras基因突变.重度吸烟者的突变率(69%)显著高于中度(31%)和轻度吸烟者(25%),以及非吸烟者(20%).突变的发生与患者的年龄及吸烟史相关,而与性别、TNM分型无关.结论吸烟可能是导致K-ras基因突变的诱因之一;支气管肺泡灌洗液中K-ras基因突变的检测对预测吸烟者肺癌的发生和早期诊断,具有重要的临床价值.     

p53基因在大肠癌发生转移及预后过程中的动态变化

背景肿瘤相关基因在癌瘤发生、发展、转移及预后过程中的作用如何一直是医学界研究的难点.目的了解变性梯度凝胶电泳(DGGE)和自动DNA序列分析方法检测肿瘤基因变异及p53基因、p53蛋白在大肠癌发生、转移过程中的动态变化,为大肠癌预后评估提供依据.设计以组织标本为研究对象的单一样本研究.单位一所军医大学医院肿瘤科.对象收集1994-01/2000-12解放军第一军医大学南方医院住院治疗的41例因大肠癌接受大肠根治性切除并于手术后5个月至5年内因肝转移接受肝切除术患者的大肠癌原发灶及肝转移灶标本.方法以DGGE及自动DNA序列分析法检测41例大肠癌原发病灶和肝转移灶p53外显子5～11的基因突变.以免疫组织化学方法检测p53蛋白表达.主要观察指标①p53基因突变在DGGE中的检出情况及突变.②p53基因的序列分析.③p53免疫组织化学染色结果.结果41例中24例有p53基因突变(62%),其中6例仅在肝转移灶发现p53基因突变,其余均为原发灶、转移灶有一致性的突变.另有3例原发灶即有p53基因突变的患者,在转移灶除保留原有突变外,还出现新增加的突变.在原发、转移灶同时有突变的16例中,14例呈现突变的p53碱基峰和正常峰之比在肝转移灶明显高于大肠癌原发灶(P＜0.001).p53免疫组织化学染色结果和DGGE,DNA序列分析结果高度一致.但在基因分析呈无义突变的癌灶,免疫组织化学显示p53蛋白的过度表达.结论在大肠癌肝转移过程中,p53基因突变主要开始于肠癌原发灶,并被保持于转移至肝脏的癌细胞内,在转移灶其含量或含突变型p53癌细胞量明显增加.p53基因突变与p53蛋白过度表达呈正相关关系.     

Regulation by vascular endothelial growth factor of human colon cancer tumorigenesis in a mouse model of experimental liver metastasis.

To investigate the relationship between angiogenesis and hepatic tumorigenesis, we examined the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in 8 human colon carcinoma cell lines and in 30 human colorectal cancer liver metastases. Abundant message for VEGF was found in all tumors, localized to the malignant cells within each neoplasm. Two receptors for VEGF, KDR and flt1, were also demonstrated in most of the tumors examined. KDR and flt1 mRNA were limited to tumor endothelial cells and were more strongly expressed in the hepatic metastases than in the sinusoidal endothelium of the surrounding liver parenchyma. VEGF monoclonal antibody administration in tumor-bearing athymic mice led to a dose- and time-dependent inhibition of growth of subcutaneous xenografts and to a marked reduction in the number and size of experimental liver metastases. In hepatic metastases of VEGF antibody-treated mice, neither blood vessels nor expression of the mouse KDR homologue flk-1 could be demonstrated. These data indicate that VEGF is a commonly expressed angiogenic factor in human colorectal cancer metastases, that VEGF receptors are up-regulated as a concomitant of hepatic tumorigenesis, and that modulation of VEGF gene expression or activity may represent a potentially effective antineoplastic therapy in colorectal cancer.     

肝脏慢性病毒感染对结直肠癌肝转移发生及生存影响

目的探讨肝脏慢性病毒感染对结直肠癌肝转移发生率影响,分析感染者和无感染者病例总体生存情况。方法回顾性研究2868例结直肠病例,根据外周血检测结果分为感染组和无感染组,比较两组患者肝转移发生率,分析两组患者总体生存情况及比较两组肝转移患者生存时间。结果两组病例肝转移发生率比较差异有统计学意义(P<0.05),5年总体生存率感染组优于无感染组,肝转移伴病毒感染组中位生存期26个月,无感染组20个月,两组比较差异有统计学意义(P<0.001)。结论肝脏慢性病毒感染可降低结直肠癌肝转移发生率,有肝脏慢性病毒感染者病例总体预后优于无感染组,肝转移患者伴肝脏慢性病毒感染预后较好。     

结直肠癌肝转移的手术治疗及预后分析

目的探讨结直肠癌肝转移患者手术治疗的指征、相关病理因素及手术治疗对预后的影响。方法回顾性分析本院2000年1月至2007年12月间经手术治疗的75例结直肠癌肝转移患者的临床资料。结果本组同时性肝转移62例,异时性肝转移13例,均在结直肠癌原发灶根治性切除基础上,行肝叶规则或不规则切除70例,结节切除活检5例。术后出现并发症10例。术后1年,3年,5年累积生存率分别为74．67％,58．67％,28．00％。生存分析显示：肝切除术后的生存率与原发灶的分化程度、术前CEA、Duke’s分期、肝转移数目、组织分型及淋巴结受侵有关。结论临床病理分期早,肿瘤分化程度高,转移灶数目≤2．术前CEA水平低的患者预后好：手术治疗是结直肠癌肝转移的首选治疗方法。     

Nature of Doppler perfusion index changes in patients with colorectal cancer liver metastases.

OBJECTIVE: Occult hepatic metastases from colorectal cancer result in an increase of the ratio of arterial hepatic blood flow to total hepatic blood flow, described as the Doppler perfusion index. Whether this alteration is due to an increase in arterial blood flow or a decrease in portal venous inflow has not yet been unequivocally determined. The purpose of this study was to analyze changes in hepatic perfusion in patients with liver metastases from colorectal cancer by standardization of hemodynamic parameters to body surface area. METHODS: Hemodynamic parameters (crosssectional area, blood flow, and congestive index) were measured for the common hepatic artery and portal vein with duplex color Doppler sonography in 20 patients with liver metastases and 20 healthy control subjects and evaluated relative to body surface area. RESULTS: No statistically significant differences in age, body surface area, cross-sectional area of the common hepatic artery, and congestion index of the common hepatic artery and portal vein were observed between control subjects and patients with liver metastases. Patients with liver metastases had significantly greater arterial hepatic blood flow and Doppler perfusion index and significantly smaller portal cross-sectional area portal blood flow as well as total liver blood flow (P <.001). CONCLUSIONS: This study supports the theory that the primary mechanism of alteration in liver perfusion is the reduction of portal inflow with subsequently increased arterial hepatic blood flow.     

Hepatic intra-arterial delivery of a retroviral vector expressing the cytosine deaminase gene, controlled by the CEA promoter and intraperitoneal treatment with 5-fluorocytosine suppresses growth of colorectal liver metastases

Targeting of colorectal liver metastases by regional gene therapy was tested in a clinically relevant syngeneic model. First, the CEA-CD-113 retroviral vector containing the cytosine deaminase gene controlled by the CEA specific tumour cell promoter, was shown in vitro to convert 5-fluorocytosine to 5-fluorouracil, resulting in cancer cell killing with a large bystander effect. Second, 10 days after the establishment of liver metastases, retroviral vectors were delivered to the liver by hepatic artery injection. After 5-fluorocytosine administration for 7 days, most surface metastases disappeared and tumour volumes were suppressed up to 8.2-fold. The results support the development of this approach for patient treatment.     

结直肠癌确诊时合并肝转移危险因素分析

目的：分析结直肠癌确诊时合并肝转移的临床和病理危险因素,为结直肠癌肝转移的早期诊断和进一步治疗提供参考。方法：对2006年1月—2008年6月宁波市第一医院普外科收治的247例结直肠癌手术患者临床和病理资料进行回顾分析,根据术前检查和术中探查,分为合并肝转移组与无肝转移组,用单因素和多因素回归分析方法分析两组的年龄、性别、有无肝炎病史、肝功能指标、肿瘤指标、肿瘤部位、浸润深度、淋巴结有无转移、肿瘤标本巨检和分化程度、是否合并急性肠梗阻等与肝转移的相关性,从而得出肝转移的相关危险因素。结果：247例患者中有22例合并肝转移,占8.9%。单因素分析提示,结直肠癌确诊时合并肝转移的危险因素有：女性患者、有急性肠梗阻、盆腔腹膜或大网膜有转移结节、低或未分化肿瘤、肿瘤大小和浸润程度及术前血清CEA水平。多因素Logistic回归分析表明,肿瘤浸润深度、区域淋巴结转移、术前血CEA水平、肿瘤标本巨检、腹膜和大网膜转移结节与肝转移密切相关。术前血清CEA大于27.75ng·mL^-1结直肠发生肝转移的发生率明显增高。结论：结直肠癌确诊时合并肝转移与肿瘤浸润深度、区域淋巴结有无转移、术前血CEA、肿瘤标本巨检、腹膜及大网膜转移结节相关。     

影响结直肠癌肝转移预后的因素

目的 探讨影响结直肠癌肝转移预后的相关因素。方法 回顾性分析115例结直肠癌肝转移患者的临床资料,先采用生存分析Kaplan-Meier法对15项指标进行单因素分析,再采用Cox回归分析对单因素分析有意义的指标进行统计处理。结果 115例患者的平均生存时间为（17.9±2.8）个月,其累积一、二年生存率分别为（40.4±6.7）%及（22.5±6.0）%。Kaplan-Meier单因素分析结果显示肝转移部位、肝转移灶数目、最大肝转移灶大小、原发肿瘤病理类型、原发肿瘤分化程度、原发肿瘤浸润深度、区域淋巴结转移情况、有无肝外转移、腹腔内种植及针对肝转移灶治疗方式10个因素对结直肠癌肝转移患者的预后有显著影响。Cox比例风险模型分析结果显示原发肿瘤分化程度、最大肝转移灶大小、原发肿瘤浸润深度、有无肝外转移及针对肝转移灶治疗方式是影响患者预后的独立指标。结论 原发肿瘤分化越差、原发肿瘤局部浸润越深的结直肠癌肝转移患者远期生存率越低,最大肝转移灶大小〈5 cm的患者预后较≥5 cm的患者好,同时合并有肝外其他脏器转移的患者预后差,对结直肠癌肝转移患者,采取积极的治疗能够显著延长患者的远期生存时间。