脂质体介导的huIFN—β基因转染对胶质瘤细胞侵袭力抑制作用研究

目的探讨人β-干扰素（huIFN—β）基因脂质体pSV2IFN—β对人脑胶质瘤细胞体外侵袭力的抑制作用。方法用含huIFN—β基因的脂质体体外转染人脑胶质瘤细胞系SHG44，用Westernblot和细胞免疫荧光染色法检测目的基因的蛋白表达。通过Boyden小室法检测SHG44转染前后细胞体外侵袭力的变化，同时采用明胶酶谱法分析基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）的比活性。结果转染pSV2IFN—β后，SHG44细胞中的目的基因蛋白有显著表达；磷酸盐缓冲液（PBS）对照组、空载体转染组、pSV2IFN—β脂质体转染组的侵袭性细胞数分别为49．26±14．67、54．63±12．27和18．17±5．42，转染靶基因后SHG44细胞的体外侵袭力受到明显抑制，这与MMPs活性下降的改变相一致。结论转染huIFN—β基因脂质体pSV2IFN—β使脑胶质瘤细胞系SHG44的侵袭力受到明显抑制，提示脂质体介导的huIFN—β基因治疗可能是抗神经胶质瘤侵袭的一个有效的方法。     

人IFN-β基因脂质体对胶质瘤裸鼠移植模型及其血管生成的抑制作用

目的探讨人β-干扰素(IFN-β)基因脂质体pSV2IFN-β对人胶质瘤裸鼠移植模型生长及其血管生成的影响。方法将30只裸鼠随机分为3组,以人脑胶质瘤细胞系SHG44建立荷瘤裸鼠动物模型。治疗组隔天给予pSV2IFN-β基因脂质体瘤内注射,对照组瘤内注射同体积的PBS或空载体,观察和比较各组裸鼠肿瘤的体积、重量和肿瘤的微血管密度(MVD)。结果在肿瘤细胞种植28d时,裸鼠肿瘤体积:空白对照组(1742.3±354.3)mm3,空载体组(1632.4±358.6)mm3,治疗组(482.6±45.3)mm3;肿瘤重量:空白对照组(6.1±0.6)g,空载体组(6.0±0.5)g,治疗组(2.2±0.5)g;肿瘤MVD:空白对照组51.2±6.4,空载体组49.3±7.0,治疗组26.1±4.3。治疗组裸鼠肿瘤体积、重量和MVD显著小于空白对照组和空载体组(P=0.000),肿瘤的抑制率达72.3%。结论人IFN-β基因脂质体pSV2IFN-β对胶质瘤裸鼠移植模型的肿瘤生长及血管生成有显著的抑制作用。     

脂质体转染人IFN-β基因诱导胶质瘤细胞SHG44凋亡的实验研究

目的探讨人β干扰素(IFN-β)与胶质瘤细胞凋亡的关系及意义.方法利用脂质体转染方法将IFN-β真核表达载体pSV2IFN-β导入SHG44胶质瘤细胞.细胞免疫荧光和免疫组化检测IFN-β基因的稳定转染及表达,利用流式细胞仪、透射电镜观察细胞凋亡情况.结果IFN-β基因成功转染SHG44胶质瘤细胞并得以表达.转染细胞的凋亡细胞数与未转染细胞相比有显著性差异.结论IFN-β能够诱导人SHG44胶质瘤细胞凋亡.     

IFN-β裸DNA对人脑胶质瘤生长的抑制作用

目的探讨β干扰素(IFN-β)基因对人脑胶质瘤生长的抑制作用,以及人IFN-β裸DNA治疗人脑胶质瘤的可行性.方法建立裸鼠SHG44胶质瘤模型,用脂质体包埋法将含IFN-β基因的真核表达载体(pSV2IFN β)注入裸鼠皮下SHG44脑胶质瘤,观察肿瘤生长情况并计算肿瘤体积,通过免疫组化、原位末端转移酶标记(TUNEL)染色以及瘤体坏死区计数检测,了解IFN-β基因对人脑胶质瘤生长的抑制作用.结果 IFN-β在荷瘤裸鼠瘤体内获得表达,裸鼠皮下胶质瘤生长受到抑制,并诱导SHG44胶质瘤细胞凋亡.结论 IFN-β裸DNA能够抑制人脑胶质瘤生长,该实验为IFN-β基因治疗人脑胶质瘤的应用奠定了初步基础.     

外源性IFN—β基因稳定转染对胶质瘤细胞凋亡的影响

目的研究外源性干扰素—β(IFN-β)基因对胶质瘤细胞系SHG-44的诱导凋亡作用，探索胶质瘤基因治疗的新途径。方法利用脂质体转染方法将IFN-β真核表达载体pSV2IFNβ导入人SHG44胶质瘤细胞。应用流式细胞仪和免疫荧光法检测IFN-β基因的稳定转染及表达，利用Hoechst染色、透射电镜观察细胞凋亡情况。结果IFN-β基因成功转染SHG44胶质瘤细胞并得以表达，并诱导SHG44胶质瘤细胞凋亡。结论IFN-β能够诱导入SHG44胶质瘤细胞凋亡，本实验为IFN-β基因治疗人脑胶质瘤的应用奠定了初步基础。     

外源性TRAIL基因转染对胶质瘤C6细胞凋亡的实验研究

目的探讨外源性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）基因对大鼠C6胶质瘤细胞的凋亡作用。方法C6细胞在杜伯改良的Eagle培养基（DMEM）,37℃,5％CO2条件下培养;质粒提取与转染;用HoeChst试剂盒检测C6细胞凋亡。结果转染重组质粒PDC315-TRAIL的C6细胞组凋亡率明显高于未转染的C6细胞组及转染空载体PDC315的C6细胞组（P〈0．05）。结论外源性TRAIL基因可引起C6细胞凋亡。     

阳离子脂质体转染Hela细胞的实验

背景：基因载体是基因治疗中重要的影响因素,阳离子脂质体细胞毒性低,转染效率高,是一种很有前景的基因转染载体。 目的：评价两种阳离子脂质体介导基因转染宫颈癌细胞的转染效果,优化它们对宫颈癌细胞的转染条件。 设计、时间及地点：以Hela细胞为观察对象,分组设计。实验于2008-03/06在大连民族学院生命科学学院国家民委－教育部重点实验室完成。 材料：质粒pGFP-N2购自Clontech公司,Hela细胞由大连民族学院的实验室保存。 方法：首先采用DNA延滞实验考察阳离子脂质体与DNA的结合能力,然后用进行细胞转染实验研究脂质体的转染效率,最后通过四甲基偶氮唑盐法考察脂质体对细胞的毒性。 主要观察指标：采用DNA延滞实验观察阳离子脂质体Lipofectamine 2000和DOTAP与DNA的结合能力,以报告基因（绿色荧光蛋白基因pGFP-N2）,分析阳离子脂质体Lipofectamine 2000和DOTAP转染Hela细胞转染效率和细胞毒性。 结果：Lipofectamine 2000和DOTAP与DNA均有很强的结合力;以绿色荧光蛋白基因为报告基因,Lipofectamine 2000转染率较高;当Lipofectamine 2000与DNA质量比为3∶1时,转染效率最高,约72%,是DOTAP转染细胞最高活性的2.5倍;在最佳转染剂量时,2种试剂的细胞存活率均在75%以上,Lipofectamine 2000的毒性相对较小。 结论：对Hela细胞而言,Lipofectamine 2000较DOTAP具有更高的转染效率和较低的细胞毒性。     

p16基因抑制脑胶质瘤细胞恶性增殖并诱导细胞凋亡

目的：探索p16基因在脑胶质瘤发生过程中的作用及其与脑胶质瘤细胞凋亡的关系。方法：采用脂质体,磷酸钙＋DMSO休克转染的方法,分别将外源野生型p16基因导入胶质瘤细胞株U251,SWO,观察p16基因短暂转染与长期稳定转染对胶质瘤细胞的作用,并筛选阳性克隆。同时以空载体质粒pCDNA3为对照,免疫组化,Northern杂交检测p16基因表达,对转染后细胞生长的抑制,细胞周期,凋亡及裸鼠致瘤能力的变化进行分析,结果：外源p16基因的高水平表达显著抑制了胶质瘤U251,SWO细胞的生长,克隆形成率减少,肿瘤细胞发生了G1期阻滞,p16基因短暂转染可诱导胶质瘤细胞凋亡,而长期稳定转染无明显的凋亡诱导作用。结论：外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖并诱导细胞凋亡,肿瘤细胞的异质性特点与p16基因转染后的“自然选择”作用可能是p16基因长期稳定转染无明显凋亡诱导作用的主要机制。     

TGF—β1基因转染对未成熟树突状细胞表型和功能的影响

目的探讨转化生长因子（TGF）-β1基因转染对未成熟树突状细胞（imDC）细胞表型和功能的影响。方法分别从Wistar大鼠骨髓培养imDC及成熟树突状细胞（mDC），用TGF-β1-pcDNA3质粒转染imDC，透射电镜观察细胞超微结构，流式细胞术检测其细胞表型，ELISA法检测IL-10、IL-12、TGF-β1水平，观察其对脂多糖（LPS）刺激的反应，混合淋巴细胞反应比较其在体外刺激抗原特异性T淋巴细胞增殖的能力。结果TGF-β1-imDC在LPS刺激后仍能保持未成熟的细胞形态，表面抗原CD86，CD80，CD40及MHC Ⅱ表达都有明显下降（P〈0．01），分泌TGF-β-1水平为（793．82±206．38）ng／L，明显高于imDC和mDC（P〈0．01），分泌IL-10、IL-12明显低于mDC（P〈0．01），而与imDC无显著差异（P〉0．05），LPS刺激TGF-β1-imDC 24h后分泌IL-10、IL-12的能力显著低于imDC（P〈0．01），在体外刺激抗原特异性T淋巴细胞增殖的能力明显低于imDC和mDC（P〈0．01）。结论TGF-β1-imDC的表面抗原表达明显下降，抗原递呈能力降低，分泌免疫抑制因子增加，能够维持细胞于未成熟状态。     

转染TNFα基因诱导恶性胶质瘤细胞凋亡的研究

目的:运用MoMLV载体转导TNFα基因至SHG-44人胶质瘤细胞,检测生长抑制和凋亡。结果:转基因细胞培养上清液中TNFα蛋白分别为(5198.7±3757.4)pg·ml~(-1)和(3217.4±1180.6)pg·ml~(-1)(P＜0.05),其活性达320.0u·ml~(-1),表达特异的mRNA。转基因细胞G_2~M期缩短而G_0~G_1期延长。凋亡率8%~9%。流式细胞检测到亚G_1期峰。电镜中出现染色质固缩成块状和新月小体。DNA电泳现“梯状”条带。结论:转染TNFα基因造成的细胞生长抑制可能与凋亡有关。     

人外周血内皮祖细胞转染自杀基因杀伤恶性胶质瘤细胞的体外研究

目的观察5-氟胞嘧啶诱导基因修饰型内皮祖细胞群发生自身死亡及其旁效应对共培养人脑胶质瘤细胞系U251的杀伤作用。方法采用密度梯度离心法分离经体外诱导培养的人外周血内皮祖细胞,经转染获得基因修饰型内皮祖细胞。RT-PCR法鉴定胞嘧啶脱氨酶(CD)基因在基因修饰型内皮祖细胞中的表达变化,观察野生型和基因修饰型内皮祖细胞在不同浓度5-氟胞嘧啶作用下的细胞存活率,以及基因修饰型内皮祖细胞所诱导的旁效应。结果真核细胞表达载体pCEA-CD-CAUP转染成功,CD基因在基因修饰型内皮祖细胞中表达阳性;在不同浓度5-氟胞嘧啶(0.01～1000.00μg/ml)作用下,基因修饰型内皮祖细胞存活率低于野生型内皮祖细胞,组间差异有统计学意义(均P<0.05)。不同比例的基因修饰型内皮祖细胞与人脑胶质瘤细胞系U251共培养72h后,其细胞生长抑制率均高于基因修饰型内皮祖细胞所占的比例,当基因修饰型内皮祖细胞比例占细胞总数的50%时,细胞生长抑制率即已>80%。结论人外周血内皮祖细胞转染CD基因后,在5-氟胞嘧啶的作用下可发生自身死亡并触发旁效应而杀伤共培养的人脑胶质瘤细胞系U251细胞,为抗血管生成药物与自杀基因联合应用治疗恶性胶质瘤的体内实验及后续研究提供了依据。     

三氧化二砷脂质体的制备及其对鼠脑胶质瘤的影响

目的研究三氧化二砷（As2o3）脂质体注射液对大鼠体内C6胶质瘤细胞凋亡的影响。方法采用超声薄膜分散法制备As籼脂质体，将126只成瘤大鼠分为As2O3脂质体组、As2O3组、生理盐水组。原子荧光法检测注射As2O3脂质体和As2O3后大鼠脑组织中As2O3浓度。从电镜、TUNNEL和大鼠生存时间等方面研究As2O3脂质体对C6胶质瘤的影响。结果As203，脂质体提高了As2O3的血-脑屏障通过。电镜和TUNEL检测显示：As203脂质体组细胞凋亡率给药后3d为（13．53±1．68）％，7d为（20．03±0．79）％，多于As2O3组和盐水组。动物生存时间亦优于其他两组。结论超声薄膜分散法是制备As2O3脂质体的较好方法。As203脂质体可较As203更明显地诱导鼠脑胶质瘤细胞凋亡，延长载瘤鼠的生存期。     

胶质细胞及胶质瘤细胞分泌β-微量蛋白

目的探索神经胶质细胞及人脑胶质瘤细胞是否能分泌β-tp。方法用ELlSA方法分析了胶质瘤病人脑脊液中和细胞培养液中β-tp水平。结果3种胶质细胞瘤和患者脑脊液中均能测得β-tp,其浓度是正常人的10～12倍。培养的大鼠胶质细胞随细胞数增加而β-tp水平增高。在胶质瘤细胞株(SHG-44,U-251,BT-325)培液中β-tp浓度与细胞增殖的增加成正比。但在非胶质瘤细胞株,如卵巢癌细胞,神经母细胞瘤细胞及前列腺癌细胞株等,β-tp的浓度与细胞增殖的趋势相反。结论胶质细胞和人脑胶质瘤细胞能分泌β-tp,细胞分泌β-tp水平的高低由细胞类型及细胞的多寡决定。     

TGF—β1基因修饰的树突状细胞移植对EAMG大鼠T淋巴细胞IFN-γ／IFN-γR表达的影响

目的 探讨TGF-β1基因修饰的树突状细胞(DC)移植对实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)大鼠T淋巴细胞IFN-γ分泌及其表面IFN-γ受体(IFN-γR)表达的影响.方法 近交系、8～10周龄、健康雌性Lewis大鼠25只,随机分为健康对照组、EAMG组、DC对照组、pcDNA3-TGF-β1表达质粒转染的DC(pcDNA3-TGF-β1-DC)组与生理盐水对照组5组.除健康对照组外,各组均采用丁氏双鳍电鳐电器官乙酰胆碱受体(AChR)蛋白二次免疫方法复制EAMG大鼠模型.初次免疫后第5天分别皮下注射2×106 DC、pcDNA3-TGF-β1-DC及等体积生理盐水,健康对照组和EAMG组不接受任何治疗.初次免疫后7周,分离脾脏T淋巴细胞,分别应用酶联免疫吸附试验和免疫组化方法检测T淋巴细胞IFN-γ分泌及其表面IFN-γR表达水平.结果 (1)体外培养48 h后,健康对照大鼠T淋巴细胞上清液中IFN-γ水平很低,而EAMG组大鼠T淋巴细胞上清液中IFN-γ水平显著升高(P<0.001).pcDNA3-TGF-β1-DC治疗组IFN-γ水平与EAMG组差异无统计学意义(P>0.05).(2)健康对照大鼠T淋巴细胞经体外培养后可见少量IFN-γR阳性细胞,而EAMG组大鼠T淋巴细胞经体外培养后可见较多IFN-γR阳性细胞,其阳性细胞数及平均吸光度均明显高于健康对照组(P<0.001);pcDNA3-TGF-β1-DC组IFN-γR阳性细胞数较EAMG组明显增多,其阳性细胞平均吸光度亦明显高于EAMG组(均P<0.01).结论 EAMG组大鼠T淋巴细胞IFN-γ分泌及其表面IFN-γR表达水平明显提高;pcDNA3-TGF-β1-DC治疗可进一步诱导IFN-γR表达,调节T淋巴细胞IFN-γ/IFN-γR表达可能是TGF-β1基因修饰的DC治疗EAMG的机制之一.     

基因转染神经干细胞移植治疗脑胶质瘤的研究进展

脑胶质瘤发病率占颅内肿瘤的第一位,目前采用手术、放疗、化疗等综合治疗,但其预后仍差。其治疗难点在于肿瘤细胞的浸润性生长方式,而基因治疗将成为将来治疗方案的最佳选择之一。神经干细胞具有在中枢神经系统内迁移分化能力,是基因治疗的良好载体细胞。胞嘧啶脱氨酶基因和自介素-4基因、白介索-12基因、TRAIL基因修饰神经干细胞移植治疗脑胶质瘤是当前脑胶质瘤基因治疗的前沿。     

他莫昔芬对SHG-44人胶质瘤细胞BKCa通道的抑制作用

细胞膜钾离子通道的活动与胶质瘤的增殖与侵袭特性有密切关系[1].人恶性胶质瘤细胞株SHG-44经常被用于各种研究.鉴于SHG-44细胞株上钾离子通道的重要意义,我们以全细胞膜片钳记录方式来研究此细胞膜上钾离子通道的特性及药物调控研究.     

携带hIFN-β的骨髓间充质干细胞体外抑制C6胶质瘤细胞

目的研究携带人β干扰素基因（hIFN-β）的重组腺病毒转染骨髓间充质干细胞（MSCs-hIFN-β）以及其在体外抑制大鼠C6胶质瘤细胞。方法转染的MSCs行PT-PCR检测细胞内hIFN-βmRNA的表达;ELISA法检测培养液上清hIFN-β的分泌情况;MTT法检测细胞活力并绘制转染后MSCs生长曲线,MSCs-hIFN-β和C6胶质瘤细胞体外共培养,检测C6胶质瘤细胞活力和共培养液上清hIFN-β含量。结果 Ad-hIFN-β转染的MSCs分化后有绿色荧光蛋白表达,RT-PCR证实MSCs中有hIFN-βmRNA表达,ELISA测定显示MSCs分泌hIFN-β,而且转染MSCs的增殖能力无改变。体外共培养发现C6胶质瘤细胞的生长被不同程度的抑制,C6胶质瘤细胞培养上清hIFN-β的含量随着MSCs-hIFN-β的密度增加而增加。结论在体外MSCs-hIFN-β能抑制大鼠C6胶质瘤细胞的增殖。     

蒿甲醚对C6胶质瘤细胞的抑制作用

目的 研究蒿甲醚对大鼠C6胶质瘤细胞的抑制作用.方法 C6胶质瘤细胞经培养后,按是否加入蒿甲醚分为实验组和对照组,均采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞技术(FCM)及Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡情况.结果 MTT法检测显示:24、48、72h3个时间组蒿甲醚对C6胶质瘤细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为(195.08±3.27) μmol/L、(119.64±4.06) μmol/L、(87.84±0.93) μmol/L.FCM法检测显示:24、48、72 h3个时间组C6胶质瘤细胞凋亡率分别为:7.95％、22.01％、31.22％;且G0-G1期细胞比例增加,S期和G2-M期细胞比例降低.荧光染色显示:实验组细胞内出现凋亡小体;而对照组细胞呈弥散均匀荧光.结论 蒿甲醚能抑制C6胶质瘤细胞生长,且其抑制作用呈现时间依赖性和浓度依赖性;蒿甲醚能干扰C6胶质瘤细胞的细胞周期,可将其阻滞在G0-G1期并诱导其凋亡.     

电针对阿尔茨海默病血清中IL-1βIFN-γS100B水平的影响

目的观察电针对阿尔茨海默病(AD)患者血清白细胞介素-1β(IL-1β)、干扰素-γ(IFN-γ)、S100B水平的影响。方法选取63例AD患者,采用随机数表法分为2组,观察组32例患者在运动锻炼、饮食控制、心理治疗、营养脑神经治疗基础上加电针治疗,对照组31例患者未加用,采用ELISA测定治疗前、治疗70 d后血清IL-1β、IFN-γ、S100B水平,同时应用简明智力状态检查量表(MMSE)及日常生活活动能力量表(ADL)评估患者的智能状况及日常生活能力。结果 2组IL-1β、IFN-γ、S100B、MMSE、ADL治疗前比较无明显差异(P0.05),治疗70 d后上述指标较治疗前降低或升高(P0.01),但观察较对照组降低或升高更显著(P0.05或P0.01)。结论电针刺激可显著抑制AD患者外周血IL-1β、IFN-γ、S100B的表达,改善AD患者的认知功能,提高其日常生活质量。     

脂质体介导pBLAST2-hHGF质粒转染Lewis大鼠肝卵圆细胞

背景：在体外将外源基因导入肝细胞相当困难,而利用肝脏干细胞导入外源性基因较为容易。目前大鼠肝卵圆细胞增殖模型的建立已较为成熟,但作为原代细胞,肝卵圆细胞的稳定培养和传代是较为困难的。 目的：建立pBLAST2-hHGF质粒稳定转染大鼠肝卵圆细胞的细胞株,观察转染细胞的生物学特性。 方法：取稳定培养的第4代雄性Lewis大鼠肝卵圆细胞,采用脂质体介导DNA转染的方法将pBLAST2-hHGF质粒转染到肝卵圆细胞,然后在倒置显微镜下观察转染细胞的形态变化、细胞增殖情况,检测细胞转染后的增殖分化能力,确定转染细胞的稳定培养条件,使用western blot和ELISA方法检测转染细胞hHGF蛋白的表达。 结果与结论：第4代以脂质体介导成功转染pBLAST2-hHGF质粒的肝卵圆细胞在培养基中添加不同剂量和种类细胞因子的条件下转染细胞可稳定传代14代,其形态与未转染细胞比较无明显变化,但生长增殖速度明显快于未转染细胞,去除培养液中的生长因子后pBLAST2-Hhgf/肝卵圆细胞迅速分化为肝细胞和胆管上皮细胞,western blot方法检测转染细胞有hHGF蛋白表达,ELISA法检测培养液中hHGF蛋白含量高。结果提示,使用脂质体介导pBLAST2-hHGF质粒转染肝卵圆细胞方法可靠,转染细胞稳定培养并传代次数长于肝卵圆细胞,转染细胞具备分泌hHGF的能力,可用于后续研究。