石蜡包埋组织中结核杆菌DNA不同提取方法比较

目的探讨结核患者石蜡包埋组织中简易有效的结核杆菌DNA提取方法并进行验证。方法 20份4%甲醛固定石蜡包埋的肺或淋巴结结核组织标本,分别以氯化钠盐析法、酚-氯仿抽提法、一步法、试剂盒法提取其DNA,并通过琼脂糖凝胶电泳、聚合酶链反应(PCR)及膜芯片法分析所提取DNA的质量。结果氯化钠盐析法提取的DNA〔(19.338±6.270)μg〕和一步法提取的DNA〔(20.050±5.591)μg〕最多(P<0.001),一步法的A260/A280比值(1.044±0.137)明显低于其他3种方法(P<0.001);电泳结果显示4种提取方法均得到了基因组DNA;PCR与膜芯片验证显示除一步法外其余3种方法提取的DNA中均检测到结核杆菌DNA。结论氯化钠盐析法提取石蜡包埋组织结核杆菌DNA具有高效简便的特点,是较为理想的方法。     

石蜡包埋的石棉肺癌组织的基因组DNA的快速提取法

建立了从少量石蜡包埋的组织切片中快速提取石棉肺癌组织中的基因组ＤＮＡ的水煮脱蜡法，克服了传统的二甲苯脱蜡法的周期长、成本高和毒性大的缺点。所得到的基因组ＤＮＡ中，长片段占较大的比例，总量可足够用作１０～２０次ＰＣＲ扩增反应的模板，并可用于其它分子生物学研究     

一种从蠕虫组织切片中提取DNA作PCR鉴定虫种的简便方法

目的建立一种实用于临床病理鉴别诊断组织切片内蠕虫虫种的分子病理学方法。方法制作已知的和从临床收集的多种蠕虫和宿主组织病理切片标本,用改良蛋白K消化法对各种蠕虫切片的白片、HE染色片和免疫组化片组织提取DNA;设计合成检测并殖吸虫、曼氏裂头蚴和猪囊虫各自特异性基因片段的引物,分别对各DNA提取物作PCR扩增,经凝胶电泳观察目的基因片段;比较分析三种蠕虫各自最小组织量检测的敏感性和特异性。结果对三种蠕虫所选用的引物均可扩增出清晰的特异性目的条带。用改良蛋白K消化法提取蠕虫DNA可PCR扩增出目的片段的敏感性均优于商品化试剂盒提取法,可提出DNA的最小组织面及厚度为:肺吸虫的为1.50 mm2,10μm;曼氏裂头蚴的为4.87 mm2,5μm;猪囊虫的为5.80 mm2,5μm。经10个临床标本检测均获得理想结果。结论本研究成功地探索出一种对病理切片中微量组织提取DNA作PCR鉴定虫种的简便方法,为病理诊断提供了进一步鉴别此3种蠕虫的分子病理学手段。     

PCR扩增石蜡包埋小鼠组织p53基因突变热点片段

目的 扩增石蜡包埋小鼠组织p53基因第5、7外显子。方法 用3种方法提取DNA，比较提取效果，用聚合酶链式反应（PCR）扩增相应片段。结果 用二甲苯脱蜡，蛋白酶K消化120小时可获得较好的DNA提取物。结论 用该提取物为模板扩增小鼠p53基因突变热点片段成功率高。     

石蜡包埋组织中甲基化特异性PCR全程的质量控制

近年来有关DNA甲基化与肿瘤发生的关系日益受到人们的重视,成为肿瘤分子生物学研究热点之一.而现在对DNA甲基化状态的检测方法不多,Herman等(1996年)在黍亚硫酸盐处理的基础上提出了甲基化特异性的PCR,(methyrlafion-specific PCR.MSP)是一个快速敏感的基因甲基化分析方法.它将DNA先用重亚硫酸盐处理,使未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的不变.     

抗酸染色与PCR-荧光探针法在石蜡包埋组织结核分枝杆菌检测的比较

目的 比较抗酸染色与PCR-荧光探针法检测在福尔马林固定、石蜡包埋组织中结核分枝杆菌(Mycobaeterium tuberculosis,MTB)检测的应用.方法 收集西京医院2018年1月至2019年10月共543例疑似结核患者,所有组织标本均经10％中性福尔马林固定,常规石蜡包埋、切片,HE染色,行抗酸染色及PC...     

固定剂和固定时间对石蜡包埋组织RT-PCR检测病毒RNA的影响

目的　探讨固定剂及固定时间对石蜡包埋RNA病毒感染组织中RNA降解及标本病理形态学的影响。方法　取汉坦病毒 76～ 118株接种的乳鼠感染组织 ,以沉淀脱水类固定剂 10 0 %甲醇、75 %乙醇、10 0 %丙酮以及醛类固定剂 4 %的多聚甲醛磷酸缓冲液 (PFA)、10 %福尔马林共 5种固定剂 ,在室温下固定病毒感染组织 6h、12h、2 4h和 4 8h后 ,将各种方式固定后的病毒感染组织标本进行石蜡包埋 ,组织包埋块在室温下保存 1年～ 1 5年 ,然后进行切片HE染色 ,镜下观察各种固定剂对组织病理形态学的影响。各种方式固定后石蜡包埋组织中以RT_PCR扩增出不同片段长度的病毒RNA及 β_actinRNA序列 ,以判断各种固定方式对病毒RNA和细胞总RNA降解的影响。每种固定方法对RNA的影响是通过获得产物最大长度或对长片段扩增的可重复性及假阴性结果的多少来反映。结果　病理切片结果显示 ,经 10 %福尔马林和 4 %PFA固定的石蜡切片 ,组织结构完整清晰 ,组织经其他三种沉淀脱水类固定剂固定后有不同程度收缩 ,但不影响组织病理形态学检测 ,其中甲醇固定的收缩程度最小。从固定后石蜡包埋组织中提取RNA进行RT_PCR扩增时 ,扩增的效果受固定剂类型和固定时间的影响 ,同时也受扩增的基因片段长度的影响。在可达到固定作用的前提下 ,同一固定     

4种核酸提取方法在流行性感冒病毒核酸检测中的比较

目的：比较常见的4种核酸抽提方法，比较其对流行性感冒（流感）病毒检测的敏感性差异，为实验室应用和结果的评价提供依据。方法：对已确定效价的甲1型流感病毒，作10^-2～10^-5系列稀释，选用Roche公司Hish Pure Viral RNA Kit、QIAGEN公司的Rneasy mini Kit、国产Z生物公司RNA提取试剂盒和Invitrogen公司Trizol试剂等4种核酸提取方法提取上述标本核酸模板，采用罗氏公司的RT-PCR试剂盒，用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）对其进行评价。结果：在对不同病毒拷贝数流感病毒的检测中，4种核酸提取方法以Roche公司High Pure Viral RNA Kit提取效率最高，以此提取效率作为100％，则QIAGEN Rneasy mini Kit、Invitrogen Trizol和国产Z生物公司RNA提取试剂盒的平均提取效率依次为89．71％、75．30％、68．00％。经方差分析及t检验，4种方法之间存在显著性差异（P均〈0．05）。对临床标本的检测，也获得相似结果。结论：各试剂之间提取核酸的效率存在差异，应该选择性价比较好的方法进行临床标本的实验室RNA提取。     

实时荧光定量PCR比较分析miRNA在胃癌新鲜组织与石蜡包埋组织中的表达

目的研究miRNA在胃癌石蜡包埋组织和新鲜组织的表达。方法应用实时荧光定量PCR检测23例石蜡包埋胃癌组织及与其配对的新鲜冷冻胃癌组织的miR-30c表达,以U-6为内参对照。结果胃癌石蜡包埋组织中的miRNA可以成功扩增出来,胃癌石蜡包埋组织与胃癌新鲜组织中miR-30c表达呈平行性表达(配对t-检验P=0.81)。miR-30c在石蜡包埋组织中的表达量与临床病理因素的关联似乎更紧密。结论可以利用便利获得的存档石蜡组织进行miRNA相关指标表达研究。     

多重荧光PCR-熔解曲线法检测福尔马林固定石蜡包埋肺组织样本中病原真菌的价值

目的比较多重荧光PCR-熔解曲线法与病理诊断法检测福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肺组织样本中病原真菌的价值。方法选择2014—2019年本院病理科病原真菌阳性患者的42份肺组织样本(念珠菌8份、曲霉菌23份、隐球菌11份)作为阳性组,病原真菌阴性的肺组织样本50份作为阴性组,均进行多重荧光PCR-熔解曲线法检测,并应用配对χ2检验和Kappa值对两种方法的检测结果进行比较。结果阳性组42份样本多重荧光PCR-熔解曲线法检出23份阳性,并可分辨至种水平,其中念珠菌4份(白色念珠菌2份、热带念珠菌1份、克柔念珠菌1份)、曲霉菌13份(烟曲霉11份、黄曲霉2份)、新型隐球菌6份。阴性组50份样本多重荧光PCR-熔解曲线法检测均阴性。Kappa值0.568,以病理诊断法为"金标准",多重荧光PCR-熔解曲线法检测病原真菌的灵敏度为54.8%(23/42)、特异性为100.0%(50/50)。结论多重荧光PCR-熔解曲线法检测FFPE样本中病原真菌的灵敏度不高,但可以将病原真菌鉴定至种,是病理诊断法的补充。     

转基因食品DNA提取技术研究

目的：建立从食品中提取DNA的方法。方法：采用CTAB法、酶裂解法、SDS沉淀法3种方法提取转基因相关食品中的：DNA，用核酸蛋白分析仪测定核酸的纯度和浓度、PCR扩增真核生物的18S rDNA基因评价提取核酸的质量。用转基因植物通常含有的CaMV35S启动子作为转基因成分的指示标记。结果：3种方法得到的DNA提取物OD260／OD280比值均接近1．6-1．9，CTAB法获得的DNA量较少，酶提取法所得的DNA提取物的量多，但扩增条带荧光较暗。SDS法能收获较多的DNA，PCR扩增效果好。用SDS法提取的DNA进行35S启动子检测，3份转基因样品均出现强阳性结果，而10份非转基因食品均未产生阳性条带。结论：SDS沉淀法提取DNA，具有经济、简便的特点，所提的DNA量适用于PCR检测。     

腹泻新病原艰难梭菌DNA提取方法的比较研究

目的:比较提取高质量艰难梭菌基因组总DNA的方法。方法:采用4种不同方法提取艰难梭菌基因组DNA,比较作为模板用于扩增艰难梭菌看家基因磷酸丙糖异构酶(tpi)基因的优缺点。结果:除沸水浴法,其他3种方法制备的艰难梭菌DNA均能成功用作PCR扩增的模板。CTAB/NaCl法进行提取可有效去除多糖成分,但操作要求较高。碱裂解法操作简便、省时、成本低经济可靠,提取的DNA量及纯度较合适;试剂盒抽提出的产物纯度和产量明显高于CTAB/NACL、碱裂解法(P<0.05),但成本高。结论:四种方法各具优缺点,应根据实验室条件和实验要求进行选择。     

Chelex-100法和碱性裂解法提取细菌DNA的比较

目的:通过对两种DNA提取方法的比较,寻找一种灵敏、快速、经济实用的提取方法.方法:采用Chelex-10{3法和碱性裂解法分别提取不同浓度大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923的DNA,利用通用引物扩增16SrDNA片段检测两种方法的灵敏度.结果:碱性裂解法提取的不同浓度的两种细菌DNA,经PCR扩增均未显出目的条带;chelex-100法提取不同浓度的两种细菌DNA均扩增出目的条带,PCR检测大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的灵敏度均为1.2×101cfu/ml,电泳结果提示相同浓度的大肠杆菌被提取到的DNA含量比金黄色葡萄球菌的含量高.结论:Chelex-100法操作简便,可用于细菌DNA的快速提取.     

鱼肉中甲基汞不同提取方法的比较

目的:比较不同方法对甲基汞提取回收率的影响,优化甲基汞的提取方法。方法:采用鱼肉甲基汞标准物质,分别用水浴振荡、超声提取和微波消解三种提取方式,分别以5 mol/L HCl、冰乙酸、25%NaOH溶液和25%四甲基氢氧化铵溶液(TMAH)提取后,经液相-原子荧光光谱联用仪(LC-HG-AFS)测定。结果:水浴、超声和微波提取获得最高回收率所需时间分别为12 h,4 h,10 min;酸和碱均可提取甲基汞,酸提取的最高回收率高于碱。结论:三种提取方法均可用于甲基汞的测定,其中微波提取时间最短。     

5种德国小蠊全虫蛋白提取方法的效果比较

目的寻找一种适合德国小蠊全虫蛋白提取的方法,为德国小蠊蛋白质组研究提供依据。方法以丙酮为溶剂对德国小蠊雌雄成虫进行脱脂,并利用TCA/丙酮、RIPA裂解液、TrisHCl、1%SDS和裂解液5种蛋白提取液提取全虫蛋白,通过Bradford法测定蛋白浓度,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳比较脱脂前及脱脂后各种蛋白提取方法的提取效果。结果脱脂处理有助于德国小蠊成虫蛋白的提取;5种蛋白提取方法中,RIPA裂解液对2种成虫蛋白提取效果最好,电泳后雌雄成虫蛋白条带分别为13条和16条,其次分别为1%SDS、TrisHCl及裂解液,TCA/丙酮提取法效果最差。结论丙酮脱脂可以明显提高德国小蠊成虫蛋白的提取效果;RIPA裂解液相对更适合于提取德国小蠊雌雄成虫的全虫蛋白质。     

不同液化处理及核酸共提取方法对痰样本中病毒核酸的提取效果比较

目的 比较不同痰液液化方法及不同核酸提取方法共提取痰液中病毒RNA和DNA的效果,并比较其优劣.方法 将痰液样本分为二硫苏糖醇(DTT)、氢氧化钠(NaOH)液化痰液组,以生理盐水为对照,分别使用TTIANamp Virus DNA/RNA Kit(方法1)、KBW酶法(方法2)、KBW通用法(方法3)和单一核酸提取试剂盒(方法4)提取核酸,微量核酸分析仪检测核酸纯度,多重定量PCR方法检测核酸的浓度.结果 核酸纯度测定结果:生理盐水组中方法2和方法3,DTT处理组中方法1和方法2,NaOH处理组中方法3所提DNA纯度略大于1.8;各组中采用方法1所提RNA纯度均明显超过2,方法4及NaOH处理组中方法3所提RNA纯度均低于1.8,其余纯度均在正常范围内.PCR浓度测定结果:腺病毒(DNA)Ct值:生理盐水组＜NaOH处理组(q=35.09,P＜0.05),生理盐水组和DTT处理组间差异无统计学意义(q=2.54,P＞0.05);提取方法1＜方法3(q=12.68,P＜0.05),方法1、方法2与方法4之间差异无统计学意义(q=0.84、1.69、2.53,P＞0.05);呼吸道合胞病毒(RNA)Ct值:生理盐水组＜DTT组＜NaOH组(F=152.76,P＜0.01);提取方法1＜方法2＜方法3(q=6.98、3.75,P＜0.05),方法2与方法4之间差异无统计学意义(q=1.28,P＞0.05).结论 痰液液化前处理会影响病毒RNA和DNA的共提取,TIANamp Virus DNMRNA Kit和KBW酶法对痰样本中病毒核酸共提取效果较好.     

人血凝块提取基因组DNA碘化钾法建立

目的 通过与酚/氯仿法比较,建立一种快速、经济、高效从人血凝块提取基因组DNA的简易方法.方法采用双蒸水低渗破碎红细胞,碘化钾直接、快速裂解白细胞及其核膜,氯仿/异戊醇沉淀蛋白质及残存细胞碎片,最后经异丙醇和乙醇沉淀基因组DNA.结果 采用该法提取的基因组DNA浓度为(46.4±8.8)mg/L,吸光度值A260/A280为(1.79±0.23),与酚/氯仿法(46.1±8.3,1.78±0.22)比较差异无统计学意义(P>0.05);2种方法 提取基因组DNA凝胶电泳条带完整,PCR扩增目的 条带完整,能够满足分子生物学实验要求.结论 碘化钾法是一种快速、简便、经济、高效提取人血凝块基因组DNA的方法,可以广泛运用于大规模人群基因组学研究.