黄芩苷对肺炎衣原体诱导的内皮细胞粘附因子表达的影响

【目的】观察黄芩苷对肺炎衣原体诱导的内皮细胞粘附因子表达的影响。【方法】体外培养人脐静脉内皮细胞(ECV-304)。待长成单层后加入肺炎衣原体(CP)为模型组,加入肺炎衣原体和黄芩苷0．4、0．2、0．1g／L分别为黄芩苷高、中、低剂量组,不加任何刺激者为正常组,每组设4个复孔,24孔板培养5d后,检测培养上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和细胞表面细胞间粘附因子(CD54)、血管间粘附因子(CD106)的表达。【结果】经肺炎衣原体刺激的ECV-304分泌TNF-α增加．细胞表面CD54、CD106表达增加;黄芩苷高、中、低剂量组均可下调TNF-α水平;高剂量可抑制CD54、CD106的表达。【结论】黄芩苷对肺炎衣原体感染血管内皮细胞的炎症反应具有一定的阻抑作用。     

多种中药单体对人结肠癌HT-29细胞株TLR4 mRNA表达和IL-8分泌的影响

【目的】观察不同中药单体对人结肠癌细胞株HT-29细胞Toll样受体信使核糖核酸(TLR4 mRNA)表达及白细胞介素8(IL-8)分泌的影响。【方法】选用人结肠癌细胞株HT-29细胞,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HT-29细胞的TLR4 mRNA的表达;酶联免疫吸附法(ELISA)检测HT-29细胞的IL-8分泌。【结果】黄芪甲苷组和大黄素组可抑制干扰素-γ(IFN-γ)诱导的TLR4 mRNA表达,而姜黄素组、柚皮苷组和栀子苷组则对TLR4 mRNA表达无显著性影响;大黄素能显著性降低IFN-γ 脂多糖(LPS)所诱导的HT-29细胞IL-8的产生。【结论】大黄素抗炎细胞分子机制可能与其能抑制IFN-γ诱导的HT-29细胞TLR4 mRNA表达和IFN-γ LPS诱导的IL-8分泌有关。     

黄芩抑制脂多糖/三磷酸腺苷诱导的内皮细胞NIMA相关蛋白激酶7(NEK7)表达和Nod样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体激活

【目的】观察黄芩和黄芩苷对脂多糖(LPS)/三磷酸腺苷(ATP)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)NIMA相关蛋白激酶7(NEK7)和Nod样受体蛋白3(NLRP3)小体表达的影响。【方法】将HUVECs随机分为空白对照组、模型组、阿托伐他汀组、黄芩苷组和黄芩血清组,按分组相应药物预处理细胞24 h,然后用1μg/mL LPS刺激细胞24 h,再用5.5 mmol/L ATP刺激细胞4 h后检测各指标。四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活力,均相竞争法测定细胞上清液中内皮素1(ET-1)的含量,硝酸还原酶法测定细胞上清液中总硝酸盐(NOx)水平,蛋白免疫印迹法检测细胞内NEK7、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、裂解型胱天蛋白酶1(cleaved-Caspase-1)、白细胞介素1β(IL-1β)蛋白的表达。【结果】与模型组比较,黄芩血清组、黄芩苷组、阿托伐他汀组LPS/ATP诱导的细胞活力升高,ET-1水平降低、NOx水平升高,NEK7、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1、IL-1β的蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01),且黄芩血清组、黄芩苷组的作用效果优于阿托伐他汀组。【结论】黄芩和黄芩苷可以抑制LPS/ATP诱导HUVECs的NLRP3炎症小体激活引起的细胞焦亡而保护内皮,其机制可能与调控NEK7表达有关。     

Lipopolysaccharide upregulates the expression of Toll-like receptor 4 in human vascular endothelial cells

目的：探讨内皮细胞TLR2和TLR4的表达以及内毒素对其表达的影响。方法：按RNA提取试剂盒说明书提取内毒素作用后的ECV-304(人脐静脉内皮细胞株)和人脐静脉内皮细胞总RNA,运用逆转录PCR(RT-PCR)检测细胞TLR2和TLR4mRNA的表达。结果：人脐静脉内皮细胞和ECV304细胞株均能表达TLR2和TLR4mRNA,但是,TLR4的表达水平明显强于TLR2的表达,LPS能明显上调TLR4的表达,但对TLR2的表达无影响。结论：本研究提示TLR4能明显上调LPS作用的信号转导分子,在LPS对内皮细胞的激活效应中具有重要的作用;ECV-304是内皮细胞研究的良好的实验模型,可代替人脐静脉内皮细胞而较为广泛应用。     

黄芩苷对巨噬细胞产生抵抗素和白细胞介素-1β的影响

【目的】观察黄芩苷对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞产生抵抗素和白细胞介素-1β(IL-1β)的影响。【方法】体外培养小鼠巨噬细胞RAW 264.7,取生长良好的细胞进行接种。模型组加入LPS(终浓度为0.1μg/mL或5μg/mL)或重组抵抗素(终浓度为100 ng/mL);中药组加入不同浓度黄芩苷(终浓度为50、100μmol/L),预处理1 h,后加入LPS或抵抗素。24 h后吸取上清,采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组IL-1β和抵抗素浓度,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR法检测抵抗素mRNA表达。【结果】与正常组比较,LPS组促进了巨噬细胞分泌抵抗素,抵抗素mRNA表达上调,LPS和重组抵抗素均促进了巨噬细胞产生IL-1β(P<0.05或P<0.01)。黄芩苷高、低剂量组均可显著抑制IL-1β和抵抗素的浓度,且抑制抵抗素mRNA表达(P<0.05或P<0.01)。【结论】黄芩苷可明显降低促炎因子产生的炎症反应,这可能是其抗动脉粥样硬化的机制之一。     

黄芩苷对体外培养神经干细胞分化的影响*

【目的】探索黄芩苷对体外神经干细胞分化的影响。【方法】培养胎鼠脑皮质神经干细胞，应用细胞免疫化学方法，以神经元特异性的微管相关蛋白-2（MAP-2）和星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）为标记，对分化后的神经干细胞进行区分，评价黄芩苷对神经干细胞分化的影响。【结果】黄芩苷可以促进神经干细胞向神经元分化，其中高剂量组明显优于对照组。【结论】黄芩苷具有促进神经干细胞分化为神经元的作用。     

八肽胆囊收缩素对脂多糖诱导ECV-304一氧化氮合酶表达的分子抑制作用

目的 探讨CCK-8抑制LPS诱导ECV-304 iNOS表达的分子机制.方法 培养ECV-304,用溶剂、CCK-8、LPS及CCK受体拮抗剂丙谷胺分别或联合孵育细胞,用Western blot检测iNOS蛋白表达,用免疫细胞化学方法检测NF-κB P65蛋白表达与核移位,用RT-PCR检测CCK-AR和CCK-BR mRNA表达.结果 ①溶剂对照组ECV-304 iNOS蛋白呈低表达;LPS诱导iNOS表达明显上调,CCK-8剂量依赖性抑制LPS的作用,单独CCK-8对其无影响.②ECV-304存在CCK-AR和CCK-BR mRNA表达,其中CCK-BR mRNA表达稍强.LPS可诱导CCK-AR和CCK-BR mRNA表达明显增强.③溶剂对照组NF-κB P65蛋白主要分布于细胞质;LPS孵育1 h后细胞核中NF-κB P65表达明显增加,CCK-8剂量依赖性抑制LPS的作用;单独CCK-8对其无影响.④丙谷胺可翻转CCK-8的抑制作用.结论 ECV-304存在CCK-AR和CCK-BR mRNA表达;CCK受体和NF-κB参与介导CCK-8抑制LPS诱导ECV-304 iNOS蛋白表达上调.     

从丹皮酚对TLR-NF-κB信号通路的影响探讨高血压病血瘀证的形成机制

【目的】通过观察活血化瘀中药牡丹皮的提取物丹皮酚(paeonol,Pae)对高血压病血瘀证患者血清损伤的血管内皮细胞TLR-NF-κB信号通路的影响,探讨高血压病血瘀证的形成机制。【方法】以体积分数10%的高血压病血瘀证、非血瘀证患者及健康人(正常组)血清干预人脐静脉内皮细胞(HUVEC-C)24 h,采用实时荧光定量(PCR)法检测Toll样受体4(TLR4)mRNA表达。以不同浓度的丹皮酚(大、中、小剂量分别为400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL)干预脂多糖(LPS)诱导的HUVEC-C TLR4表达(24 h)及核转录因子(NF-κB)活化(2 h)。采用PCR法检测TLR4 mRNA及NF-κB mRNA的表达,免疫印迹(Western blot)技术检测TLR4蛋白及NF-κB蛋白(以I-κBα蛋白的降解反映)的表达。【结果】血清作用24 h后,TLR4 mRNA的表达按正常组、非血瘀证组、血瘀证组的顺序逐渐增高,组间差异有统计学意义(P0.01)。丹皮酚可呈剂量依赖性减少LPS诱导的TLR4 mRNA高表达(P0.001),抑制LPS诱导的TLR4蛋白高表达和I-κBα蛋白的降解。【结论】TLR-NF-κB信号途径介导的炎症反应和免疫紊乱是高血压病血瘀证形成的机制之一。     

ox-LDL对内皮细胞CD40信号表达的影响及黄芪甲苷的抗炎作用

[目的]观察氧化修饰的低密度脂蛋白(ox-LDL)对体外培养的血管内皮细胞(ECV-304)CD40信号的影响及黄芪甲苷的抗炎作用。[方法]100 mg/L ox-LDL刺激ECV-304细胞24 h后,以实时定量聚合酶链式反应(Realtime PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)测定细胞CD40 mRNA和蛋白的表达,酶联免疫吸附(ELISA)法测定细胞上清液肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、可溶性血管细胞间黏附因子-1(sVCAM-1)、白介素-6(IL-6)和白介素-8(IL-8)的含量。以拮抗性抗CD40抗体,抑制CD40的作用后,再次观察上清液TNF-α、sVCAM-1、IL-6和IL-8的含量变化。20μg/mL的黄芪甲苷预孵育4 h,再以100 mg/L ox-LDL刺激ECV-304 24 h,测定细胞CD40 mRNA、CD40蛋白的表达及上清液TNF-α、sVCAM-1、IL-6和IL-8的含量。[结果]1)ox-LDL上调细胞CD40 mRNA和CD40蛋白的表达。2)ox-LDL促进细胞分泌TNF-α、sVCAM-1、IL-6和IL-8;而抑制CD40蛋白则抑制细胞分泌TNF-α、sVCAM-1、IL-6和IL-8。3)黄芪甲苷下调CD40 mRNA、CD40蛋白表达,抑制内皮细胞分泌TNF-α、sVCAM-1、IL-6和IL-8。[结论]黄芪甲苷通过抑制CD40信号下调ox-LDL所致内皮细胞炎症介质的表达,是其抗动脉粥样硬化的潜在机制。     

巨噬细胞对血管内皮细胞增殖、Hoxb2、血管内皮生长因子受体和整合素αvβ3表达的影响

目的建立人巨噬细胞系U937与人脐静脉血管内皮细胞系ECV-304体外共培养模型,以刀豆蛋白A(ConA)作为U937激活剂,研究巨噬细胞调节血管生成的机制.方法实验分4组ECV-304、ConA+ECV-304、U937+ECV-304和ConA+U937+ECV-304.将ECV-304细胞接种,待60%融合时按照不同的分组进行共培养48 h后,流式细胞仪检测细胞周期的变化采用3H-TdR掺入试验检测内皮细胞DNA合成变化;RT-PCR技术检测内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR和同源盒(homebox)Hoxb2基因mRNA表达水平的变化;免疫荧光在流式细胞仪上检测整合素受体αvβ3表达的变化.结果ConA激活的U937细胞可使内皮细胞S期、DNA合成明显增加(P＜0.01);ConA刺激的U937细胞使内皮细胞VEGF受体KDR(0.879±0.003)、Hoxb2基因mRNA的表达水平(0.947±0.003)和整合素受体αvβ3的表达水平(10.26±1.73)明显上调(P＜0.01).结论ConA活化的巨噬细胞可通过影响内皮细胞的细胞周期、DNA合成、VEGF受体KDR、Hoxb2及整合素受体αvβ3的表达来促进内皮细胞的增殖、迁移及与基质的黏附,从而调节血管的生成.     

黄芪苷对脂多糖诱导巨噬细胞一氧化氮和一氧化氮合酶表达的影响

[摘要] 目的：研究黄芪苷对小鼠巨噬细胞一氧化氮（NO）生成和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响。方法：体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,取生长良好的细胞分别加入LPS（终浓度1μg/ml）和不同浓度黄芪苷（终浓度10,50,100μM）进行干预,并设空白对照组。取培养24h细胞上清,用Griess法检测NO生成量;取培养8h和24h细胞,分别提取细胞总RNA和蛋白,用RT-PCR法和Western Blot法检测iNOS基因和蛋白水平表达情况。结果：与空白对照组相比,LPS明显促进了RAW264.7细胞iNOS表达和NO的生成;加入黄芪苷可抑制 LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS mRNA和蛋白表达,减少NO的生成,与LPS组有显著性差别。结论：黄芪苷可明显降低LPS诱导的巨噬细胞iNOS表达和NO生成,这可能是其抗动脉粥样硬化斑块形成的作用机制之一。     

黄芩苷对体外培养神经干细胞分化的影响

[目的]探索黄芩苷对体外神经干细胞分化的影响。[方法]培养胎鼠脑皮质神经干细胞,应用细胞免疫化学方法,以神经元特异性的微管相关蛋白-2(MAP-2)和星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)为标记,对分化后的神经干细胞进行区分,评价黄芩苷对神经干细胞分化的影响。[结果]黄芩苷可以促进神经干细胞向神经元分化,其中高剂量组明显优于对照组。[结论]黄芩苷具有促进神经干细胞分化为神经元的作用。     

泛素在高糖诱导的血管内皮细胞凋亡中的表达

目的检测高浓度葡萄糖对血管内皮细胞凋亡的影响和泛素表达的变化.方法ECV-304细胞在高糖(25 mmol/L)和正常糖浓度(5.5 mmol/L)DMEM培养液中分别培养24、48、72 h,用MTT法检测细胞活力,用琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡特异性的DNA片段,并用Northern blot检测泛素mRNA的变化.结果高糖24、48、72 h组细胞OD值比正常浓度组均显著下降(P＜0.05);1.8%琼脂糖凝胶电泳在高糖48、72 h组检测到细胞凋亡特异性DNA片段;泛素mRNA在高糖24、48、72 h组分别增加25.37%、53.47%和63.93%(P＜0.05).结论高浓度葡萄糖可增加血管内皮细胞凋亡,泛素mRNA在高糖诱导的内皮细胞凋亡中表达上调,且发生在凋亡形态学改变之前,泛素参与调节高血糖诱导的细胞凋亡.     

Role of baicalin in regulating Toll-like receptor 2/4 after ischemic neuronal injury

Background  Baicalin has a significant anti-inflammation effect and is widely used in the clinical treatment of stroke. Most of the studies of Toll-like receptor 2/4 (TLR2/4) during cerebral ischemia had defined their specific expressions in microglia in hippocampus tissue. To explore the targets of baicalin in stroke, we detected the expressions of TLR2/4 in vitro/vivo.

Methods  By constructing a cerebral ischemia-reperfusion model in vivo and glucose oxygen deprivation model, we successfully induced neuron damage, then added baicalin and detected expressions of TLR2/4, nuclear factor-kB (NF-kB), tumor necrosis factor-alpha (TNFα), and interleukin-1β (IL-1β) in mRNA level and protein level.

Results  We found distinct upregulations of TLR2/4 and TNFα in both mRNA level and protein level in PC12 cells and primary neurons. Moreover, TLR2/4 and TNFα expressions were significantly higher in mice hippocampus treated with cerebral ischemia-reperfusion. Baicalin could downregulate the expressions of TLR2/4 and TNFα in the damaged cells and mice hippocampus effectively.

Conclusions  Neurons could respond to the damage and activate the related signal pathway directly. TLR2/4 responsed to the damage and sent the signal to downstream factor TNFα through activating NF-kB. Baicalin could inhibit the inflammatory reaction in neuron damage and TLR might be its targets, which explained why baicalin could widely be used in the clinical treatment of stroke.

     

抗P-选择素功能域单抗体外抗黏附作用的实验研究

目的 观察针对P-选择素的抗P-选择素ktin-EGF功能域单抗(PsL-EGFmAh)体外抗黏附功能。方法 常规培养或制备人脐静脉内皮细胞(ECV-304)、中性粒细胞及肾小管上皮细胞(HK2细胞)，并对ECV-304和HK2细胞行炎症因子TNF-d刺激，然后观察和比较经PsL-EGFmAh和抗P-选择素全长单抗以及配体拮抗剂Ⅳ一去硫酸肝素处理前后，中性粒细胞与ECV-304细胞黏附变化，以及HK2细胞的黏附分子(P-选择素)和共刺激分子(CD80)表达情况。结果 经PsL-EGFmAb等三种药物处理后，中性粒细胞与受刺激ECV-304细胞黏附量随药物浓度均下降，受刺激后HK2细胞的P-选择素表达及CD 80mRNA转录水平也均受到抑制，其中尤以PsL-EGFmAh抗黏附抑制效应更明显。结论 抗P-选择素功能域单抗较其他两种药物更具体外抗黏附靶向抑制效应，为进一步研究针对P-选择素抗黏附作用提供了基础。     

终末糖基化产物、高脂诱导内皮细胞凋亡的作用途径及葛根素的保护作用

[目的]探讨葡萄糖和高脂诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的作用途径及葛根素的保护作用。[方法]采用终末糖基化产物、高脂共同诱导内皮细胞凋亡建立模型，并用葛根素进行干预。采用免疫细胞化学法检测Gaspase3阳性细胞数。流式细胞分析仪检测终末糖基化产物及高脂预处理后内皮细胞凋亡百分率。[结果]中浓度终末糖基化产物（AGE50ug／mol）以及氧化低密度脂蛋白（ox—LDL50mg／L）36h作用于人脐静脉内皮细胞与正常水平的内皮细胞相比，凋亡细胞数量显著增加P〈0．05，葛根素预处理12h后显著降低高糖诱导的凋亡率P〈0．05。[结论]葛根素可以抑制高糖高脂诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡，这在防治糖尿病及动脉粥样硬化并发症的过程中起到一定作用。     

黄芩苷对创伤性脑损伤模型大鼠的治疗作用及Akt/Nrf2信号通路的影响

目的 探讨黄芩苷对创伤性脑损伤（TBI）模型大鼠的治疗作用及蛋白激酶B(Akt)/核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路的影响。方法 建立TBI模型大鼠,按照随机数字表法分成模型组、阳性对照组（单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液14 mg/kg）及黄芩苷低、中、高剂量组（50、100、200 mg/kg）,每组12只;另取12只大鼠设为假手术组。检测大鼠神经功能缺损评分（mNSS）、脑组织含水量、脑组织Akt、Nrf2 mRNA和蛋白表达水平,并观察大鼠脑组织病理结构。结果 假手术组大鼠脑组织细胞结构完整、排列整齐,未见出血及水肿;模型组大鼠脑组织细胞排列松散,且部分细胞点状坏死,大量炎性细胞浸润,出血和水肿明显;黄芩苷低、中、高剂量组大鼠脑组织出血、水肿面积和点状坏死细胞数量逐渐减少;阳性对照组和黄芩苷高剂量组效果相近。与假手术组比较,模型组大鼠mNSS评分[（8.43±1.72）分比（0.37±0.04）分,P<0.05]、脑组织含水量[（82.93±2.19）%比（68.72±1.36）%,P<0.05]升高,脑组织Akt、Nrf2 mRNA[Akt mRNA:(0....     

黄芩苷对D-氨基半乳糖致大鼠急性肝衰竭的保护作用

目的观察黄芩苷对大鼠急性肝衰竭的保护作用并探讨可能机制。方法 86只大鼠随机分为正常对照组、模型组和黄芩苷组,模型组和黄芩苷组再分为1、3、5、7天4个亚组。采用腹腔注射D-氨基半乳糖建立大鼠急性肝衰竭动物模型,黄芩苷组于造模后每隔12h腹腔注射黄芩苷(120mg/kg)1次。全自动生化仪检测血清ALT、AST和TBil水平;HE染色观察肝组织病理学变化;RT-PCR法检测肝组织Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA表达;蛋白免疫印迹法检测肝组织Bax、Bcl-2蛋白表达量。统计学处理采用方差分析。结果黄芩苷组肝组织损伤程度明显轻于模型组。黄芩苷组大鼠各时间点血清ALT、AST、TBil水平较模型组明显降低(t=18.85,15.63,8.86;P均<0.01)。黄芩苷组肝组织Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA的表达趋势与模型组一致,随时间延长3天时达高峰,5、7天时逐渐降低,与模型组相比Bax、caspase-3 mRNA表达量明显降低(t=-55.51,-16.20;P均<0.01)、Bcl-2 mRNA表达量较模型组升高(t=51.91,P<0.01)。黄芩苷组Bax、Bcl-2蛋白表达趋势与模型组一致,Bax蛋白表达量较模型组明显降低(t=-21.32,P<0.01),Bcl-2蛋白表达量较模型组明显升高(t=50.91,P<0.01);黄芩苷组各时间点Bcl-2/Bax蛋白比率明显高于模型组(t=68.08,58.11,64.04,17.50;P均<0.01)。结论黄芩苷可以通过上调抗凋亡基因Bcl-2的表达和下调促凋亡基因Bax,进而减少caspase-3的表达,保护D-GalN诱导的大鼠急性肝衰竭。     

高糖环境对血管内皮细胞增殖和氧化应激的影响

目的探讨不同浓度的葡萄糖对体外培养的ECV-304细胞增殖和氧化应激的影响。方法体外培养人脐静脉内皮细胞株ECV-304细胞,用浓度为5.5mmol/L(正常对照组)、15mmol/L(HG15组)、25mmol/L(HG25组)、35mmol/L(HG35组)、45mmol/L(HG45组)的葡萄糖培养液分别干预培养48、72和96h。采用MTT法检测不同干预组的细胞增殖能力;硫代巴比妥酸盐法测定细胞中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量;采用二硫代双硝基苯甲酸比色法测定细胞中还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量。结果随着葡萄糖浓度和暴露时间的增加,细胞增殖明显被抑制,细胞内GSH含量显著降低,与正常对照组比较各组细胞间差异有统计学意义(P<0.01)。同时,高浓度葡萄糖组MDA含量显著增加,与正常对照组比较各组细胞间差异有统计学意义(P<0.01)。结论葡萄糖可以明显抑制体外培养的人脐静脉内皮细胞株ECV-304细胞增殖,并造成显著的细胞内氧化应激,并且随着葡萄糖浓度的升高和暴露时间的延长,上述效应呈现出向严重发展的趋势。