人脐带源间充质干细胞体外成脂、成骨、成软骨诱导分化

目的体外分离培养脐带来源间充质干细胞,确定其向脂肪、骨、软骨细胞的分化能力。方法取新鲜的脐带组织,剔除脐动静脉,剩余部分剪成极为细小的组织块,02%Ⅱ型胶原酶37℃静止消化17 h,用含10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基/Ham′s F12培养基终止消化,培养3~5 d后得到较为均一的贴壁细胞。取第3代细胞做流式检测,并定向诱导分化,14 d后成脂、成骨染色鉴定,21 d后取诱导分化的细胞团做冰冻切片,阿尔法蓝染色软骨鉴定。结果体外培养的间充质干细胞高表达CD29、CD13、CD90、CD105、CD44等间充质细胞标志物,不表达CD34、CD45、人类白细胞抗原DR等造血细胞标志物;诱导分化后油红O染色、冯库萨染色均为阳性,冰冻切片阿尔法蓝染色呈明显阳性。结论人脐带间充质干细胞在体外能够培养并定向分化为脂肪、骨、软骨细胞。     

脐带间充质干细胞与类风湿性关节炎

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种病因不明的慢性、消耗性、反复发作、以关节症状为主的自身免疫性疾病。多发于女性,其发病率国内尚无精确的统计,估计在1.08%左右,欧美国家的发病率约为0.5%～3.0%。典型的临床表现为反复发作的对称多发性小关节炎,以手、腕、足、膝等关节最常受累。早期可有红、肿、热、痛和关节功     

人脐带间充质干细胞的生物学特性、分化及应用研究

间充质干细胞是一类存在于多种组织、具有高度自我更新能力和多向分化潜能的细胞。由于作为间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）经典来源的骨髓组织,可随老化而致干细胞含量及其增殖能力显著降低^[1],而且其标本需要通过骨髓穿刺来获取,是一个侵袭性、有创伤、易污染的过程。因此,寻找新的MSC来源有着重要意义。     

人骨髓间充质干细胞的培养及向软骨细胞分化

为建立分离纯化、大鼠扩增人骨髓间充质MSC，改进其冰冻保存的方法，并初步探索其体内向软骨细胞分化的最佳方法，以Percoll(1.073g/ml）密度梯度离心法分离人骨髓中单个核细胞，用含经筛选的10％的胎牛血清的低糖DMEM体外培养扩增骨髓干细胞（MSC），FCM鉴定细胞纯度，传代2次以后的细胞吸附于明胶海绵内，以TGF－β为主要刺激因子体外诱导1周，植入裸鼠皮下。在不同的时间取出组织块，甲苯胺蓝染色显示细胞外基质。结果发现，体外培养扩增的人间充质MSC表达CD166、CD29、CD44等表面抗原，不表达CD34、CD45、HLA－DR等抗原；MSC可以不经消化，直接在原培养瓶内冻存在－70℃低温冰箱，3个月后复苏的细胞生物学特性没有明显改变；体外诱导的细胞植入裸鼠皮下4周后即出现软骨细胞特有的结构。说明骨髓MSC具有独特的生物学特征，体外培养的MSC具有体内成软骨能力，应用MSC构建软骨组织具有一定的可行性。     

人脐带源和胎盘源间充质干细胞的生物学特性比较

目的：探讨人脐带和胎盘来源间充质干细胞（ MSCs）的分离培养和生物学性状的差异,为MSCs的临床应用提供选择依据。方法利用组织贴壁法分离培养脐带MSCs,酶消化法分离培养胎盘MSCs。传代培养后于倒置显微镜下观察两种不同来源的MSCs的细胞形态,流式细胞仪检测两者表面标志物表达的差异,通过细胞周期和群体倍增时间测定比较两者生长增殖能力,体外成骨和成脂诱导比较其分化能力。结果胎盘MSCs和脐带MSCs为贴壁生长、形态均一的成纤维样或长梭形外观,两种细胞均高表达CD90、CD105,不表达CD34、CD45、HLA-DR。胎盘MSCs的群体倍增时间为40．8 h,52．12％处于G0／G1期,脐带MSCs的群体倍增时间为39．5 h,57．50％处于G0／G1期,表明两者增殖能力旺盛,且无明显差异;两者在体外均可诱导分化成骨细胞和脂肪细胞。结论胎盘源MSCs具有与脐带源MSCs相似的生物学特性,两者均可作为临床治疗用细胞或组织工程的种子细胞。     

体外连续传代培养脐带间充质干细胞染色体核型的稳定性

目的分析不同代次人脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stern cells,UC—MSCs）的染色体核型,初步评价UC—MSCs在体外连续传代培养过程中染色体结构的稳定性。方法采用胶原酶消化法分离UC—MSCs,贴壁培养传代,通过细胞形态、免疫表型及多向分化潜能等生物学特性进行鉴定,利用G显带分析第3、5、7代细胞的染色体核型。结果染色体核型分析显示,第3、5、7代UC-MSCs为正常二倍体核型,G显带未见染色体结构异常。,UC—MSCs呈成纤维样形态生长,高表达CD73、CD90、CDl05,不表达CD34、CIM5、CD40、CD80、CD86、CDl54、HLA—DR;在特定的体外诱导条件下可以向骨、脂肪、软骨分化。结论UC-MSCs在体外连续传代培养7代以内染色体结构稳定,为临床应用UC—MSCs的安全性提供了遗传学方面的实验依据。     

真皮来源间充质干细胞的分离培养及成神经分化的研究

目的：研究真皮来源间充质干细胞的分离培养方法及其向神经细胞分化的条件及可行性。方法：取大鼠真皮组织，采用贴壁传代培养筛选法，分离培养真皮间充质干细胞，流式细胞术检测细胞周期，经β-巯基乙醇诱导，倒置显微镜下观察细胞形态变化，免疫细胞化学方法对分化细胞进行鉴定。结果：分离的早期贴壁的真皮来源间充质干细胞经过连续传代培养至第4代，细胞形态较为均一，86％的细胞处于G0／G1期，细胞表面波形蛋白表达阳性，但因子Ⅷ和角蛋白表达阴性。经β-巯基乙醇诱导，真皮间充质干细胞可向神经细胞分化，细胞突起增多，具有神经元的形态学特征，分化后的细胞表达神经元标志物——神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经微丝（NF-200）。结论：大鼠真皮组织中存在着成体多能干细胞，一定条件下可分化为神经元。提示真皮可能是成体多能干细胞的又—来源，有望在神经组织修复和再生中发挥作用。     

3D培养人脐带间充质干细胞来源的外泌体对成骨细胞分化的作用

目的 比较三维立体(3D)培养与传统贴壁培养(2D)人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)来源的外泌体促进成骨细胞分化能力的差异,探索前者在促进骨形成相关治疗中应用的可能性。方法 将hUC-MSCs分为2D组与3D组分别进行培养,在普通光学显微镜下观察细胞的形态特征,同时应用钙黄绿素-AM/PI活死细胞双染法检测3D组细胞的活性;通过转录组测序筛选两组差异表达基因并进行GO富集分析。提取2D组与3D组细胞分泌的外泌体并分为2D外泌体(2D-Exo)组与3D外泌体(3D-Exo)组,通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析及Western blotting对外泌体进行表征。在体外应用2D-Exo及3D-Exo干预乳鼠颅骨成骨细胞并进行成骨诱导分化,通过茜素红染色、碱性磷酸酶染色及RT-qPCR鉴定2D-Exo、3D-Exo对成骨分化能力的影响。结果 与2D组比较,3D组细胞大小均等,聚拢成球形生长;钙黄绿素-AM/PI活死细胞双染可见3D培养的hUC-MSCs具有较高活性;转录组测序结果显示,与2D组比较,3D组上调基因富集于骨矿化、软骨发育、细胞外基质的组成、成骨细胞分化、血管生成、细胞增...     

人脐带间充质干细胞的高效分离及对小鼠免疫功能的影响

目的建立一种从健康人脐带中分离间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的简单、经济、高效方法,并探讨其对小鼠免疫细胞的影响。方法取经剖宫产获得的健康人脐带血管与外膜之间的胶状物并剪切成小于1 mm3的小块,用组织块贴壁法直接培养MSCs,并用获得的MSCs注射于健康C57 BL/6小鼠皮下。结果获得的MSCs高表达CD105、CD73、CD44和CD90,不表达CD34、CD45和人类白细胞抗原 DR,符合干细胞的各种生物学特性。结论用简便、经济的方法获得了健康人脐带间充质干细胞,注射C57 BL/6小鼠体内后,小鼠的血细胞及T细胞亚型未改变,自身免疫系统稳定,为进一步的研究奠定了实验基础。     

人脐带Wharton胶中间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的研究人脐带Wharton胶中间充质干细胞(MSCs)的生物学特性。方法去除新鲜人脐带动静脉和脐带外膜组织,获得Wharton胶,分别采用酶消化法和组织块培养法获得脐带Wharton胶中的干细胞,通过细胞传代培养、生长曲线测定、活细胞鉴定进行细胞生长动力学研究,流式细胞仪分析细胞表面分子特点,组织化学和免疫组化染色鉴定软骨特征性标志物表达情况。RT-PCR检测Sox-9及Col-2A1mRNA表达情况。结果采用酶消化法可以快速分离Wharton胶中MSCs,且细胞迅速贴壁生长;组织块法培养获得种子细胞时间较长。流式细胞仪检测显示所获得的细胞表达CD44、CD105等MSCs标志物,HLA-ABC表达阳性,HLA-DPDQDR表达阴性。经过冻存复苏后免疫表型无显著变化。组织化学和免疫组化染色显示脐带Wharton胶MSCs弱表达软骨特征性标志。RT-PCR显示Wharton胶MSCs表达Sox-9和Col-2A1。结论人脐带Wharton胶MSCs不向造血系分化,且具有前软骨细胞的特性,有望作为软骨组织工程新型的种子细胞。     

人脐带间充质干细胞来源的外泌体促进小鼠成骨前体细胞增殖与分化

 

目的 提取人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hucMSCs)来源的外泌体(hucMSC-exo),观察其对小鼠成骨前体细胞(mouse osteoblast progenitor cells, mOPCs)的作用。方法 体外分离培养hucMSCs,超速离心法收集外泌体;采用CCK8试剂盒检测不同浓度梯度hucMSC-exo对mOPCs增殖的影响,碱性磷酸酶活性检测以及茜素红染色观察不同浓度梯度hucMSC-exo对mOPCs矿化的影响。结果 成功提取hucMSCs,呈现旋涡状贴壁式生长,形态呈长梭形,具有多向诱导分化潜能。HucMSCs来源的外泌体呈圆形、椭圆形,大小在80 nm左右最多,阳性表达CD9,CD63。CCK8法结果显示5、10 μg/ml的hucMSC-exo可以显著地促进mOPCs在体外的增殖(P<0.05),碱性磷酸酶和茜素红染色结果发现5、10 μg/ml的hucMSC-exo组可以明显提高mOPCs碱性磷酸酶活性及钙化结节的形成,且10 μg/ml的外泌体浓度作用强于5 μg/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 成功提取了hucMSCs及hucMSC-exo,hucMSC-exo可以以浓度依赖的方式促进mOPCs的增殖与成骨分化。

     

成人骨髓间充质干细胞培养上清对人脐血间充质干细胞体外培养及扩增的支持作用

目的：研究人骨髓间充质干细胞培养上清对人脐带血（HUCB）中所含有间充质干细胞（MSCs）的影响。方法：取脐带血，肝素抗凝，Percoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，低糖DMEM培养获得贴壁细胞层。与人骨髓间充质干细胞培养上清共孵育。流式细胞仪检测表面抗原。结果：脐带血的单个核细胞与人骨髓间充质干细胞培养上清共孵育经体外培养贴壁后出现形似纤维状细胞形态并表达与MSCs相关的抗原（CD13，CD44，CD71，CD166）。但不表达造血细胞抗原（CD34，CD45），这与源于骨髓的MSCs一致。结论：人脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞培养上清共孵育，对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用。     

人脐带组织间充质干细胞研究进展及应用前景

近年来对间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的研究越来越多,MSCs可以从骨髓、脂肪组织、肾和各种胎儿组织中提取,并能横向分化成成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等不同胚层的细胞。人脐带组织间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞,与其他来源的MSCs相比,具有来源广泛,易于采集、保存和运输,无异体排斥,避免伦理争议等诸多优点。本文就其生物学特征、优势以及临床应用前景等予以综述。     

脐带间充质干细胞鞘内移植治疗不完全性颈髓损伤的疗效和安全性

 目的 评估脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSCs)移植治疗不完全性颈髓损伤的疗效和安全性。方法 对39例不完全性颈髓损伤患者进行4次鞘内UC-MSCs移植术, 术前及术后6个月应用美国脊髓损伤协会(American Spinal Injury Association, ASIA)制定的神经功能评分标准、日常生活活动能力评分标准(Barthel指数评分),对患者移植前后运动、感觉功能、肌张力及日常生活活动能力的改善情况进行评估。记录治疗期间的不良反应。结果 干细胞移植后6个月,患者感觉、运动功能、肌张力及日常生活活动能力,与术前相比均具有统计学差异,其中运动功能方面改善最为明显,ASIA评分治疗前61±22,治疗后70±18。均未发生术区感染、脑脊液漏、中枢神经系统感染等并发症,但有6例(15.4%)于术后24 h内出现发热,3例(7.7%)术后出现低颅压症状,2例(5.1%)术后出现腰部及下肢疼痛、麻胀感。结论 UC-MSCs鞘内移植可以改善不完全性颈髓损伤患者的感觉、运动、二便及自主神经功能等多方面的神经缺失症状,疗效较理想且安全。     

特定微环境诱导人脐带沃顿胶间充质干细胞向汗腺样细胞分化的实验研究

目的鉴定人脐带沃顿胶间充质干细胞(hUCWJ-MSCs)经汗腺诱导培养基培养后向汗腺样细胞分化的潜能。方法酶消化法分离培养人正常汗腺细胞,热休克汗腺细胞后收集培养基上清液,按10%的体积分数配制汗腺分化诱导培养基。酶消化法分离获取hUCWJ-MSCs,流式细胞仪分析细胞表型特征;成骨诱导培养基和成脂诱导培养基中培养2～3周后采用碱性磷酸酶染色和油红-O染色对其分化潜能进行鉴定;在汗腺诱导培养基中培养3周,倒置显微镜观察细胞形态变化,分别收集培养1、2、3周时的细胞,采用免疫组织化学和流式细胞术检测汗腺标记物CEA、CK14、CK19的表达,RT-PCR检测汗腺发育基因(EDA)的表达。结果正常汗腺细胞呈铺路石状克隆样增生。hUCWJ-MSCs呈梭形、成纤维细胞样,流式细胞分析显示其CD44、CD105、CD34、CEA阳性率分别为97.37%9、6.26%、0.56%0、.52%;经成骨诱导培养基和成脂诱导培养基培养2～3周后,可诱导成为油红-O染色阳性的脂肪细胞和碱性磷酸酶染色阳性的骨细胞;在汗腺诱导培养基中培养3周后,细胞具有类似汗腺样结构,免疫组织化学DAB显色结果显示分化后的hUCWJ-MSCs表达汗腺细胞标记物CEA、CK14、CK19,流式细胞仪检测其阳性率分别为54.37%、60.25%、62.13%,RT-PCR结果显示其可较高水平地表达EDA基因。结论 hUCWJ-MSCs具有向汗腺样细胞分化的潜能。     

低剂量X射线照射对脐带间充质干细胞增殖及成脂成骨分化的影响

目的 探讨低剂量照射对人脐带间充质干细胞(hucMSCs)增殖及成脂、成骨分化的影响.方法 采用组织块贴壁法从人脐带沃顿胶样组织中分离出hucMSCs,并采用流式细胞术检测表面特异性标记.随机分为未予照射的对照组,以及50、100和200 mGy照射组.采用MTT法检测hucMSC在不同照射剂量和不同时间(1～7 d)的增殖情况.取第3代细胞,随机分为照射组(给予200 mGy照射)和对照组(不予照射),在体外诱导其向脂肪、成骨细胞分化,并通过油红O染色、检测碱性磷酸酶(ALP)活性,用RT-PCR检测成骨细胞核结合因子α1的mRNA表达,比较照射组与对照组细胞成脂、成骨分化的不同.结果 9～12 d开始有成纤维细胞从组织块游出贴壁,2周左右达到80%.低剂量照射后2、3、4、5和6 d,不同照射剂量组的细胞增殖均高于对照组(F=159.17、448.81、265.15、183.93、181.83,均P＜0.01),其中以100 mGy组促进细胞增殖作用最明显.照射组成脂诱导2 d后细胞内即有脂滴出现,且第21天成脂率明显高于对照组(t=28.25,P＜0.01).成骨诱导后,照射组ALP活性明显高于对照组(t=16.87,P＜0.01),且成骨细胞核结合因子α1的mRNA水平明显增高(t=14.16,P＜0.01).结论 低剂量照射可以促进hucMSC增殖,并加速其向成脂、成骨细胞分化.

Abstract：

Objective To observe the effects of low dose irradiation (LDR) on proliferation,adipogenesis and osteogenic potential of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hucMSCs).Methods hucMSCs were isolated from Wharton's jelly tissue of human umbilical cord by modified tissuepiece inoculation,and flow cytometry was used to detect the expression of specific marker in the hucMSCs.The hucMSCs were randomly divided into two groups:irradiation group undergoing irradiation with the doses 50,100,or 200 mGy respectively,and control group without irradiation.MTT method was applied to evaluate the proliferation of the hucMSCs at different time points with various doses irradiation.The third passage hucMSCs were randomly divided into two groups:irradiation group undergoing low dose irradiation of 200 mGy,and control group without irradiation,and then underwent induction by adipocytic and oesteocytic differentiation induction fluids respectively so as to differentiate into adipocytes and osteoblasts.Oil red O staining was used to detect the activity of alkaline phophatase (ALP),and RT-PCR was used to detect the mRNA expression of core binding factor alpha 1 in human osteoblast.Results After 9-12days,fibroblasts began to swim out of the tissue piece with a confluence rate of 80% 2 weeks later.Within 7 days the absorption values of the hucMSCs undergoing different irradiation doses 2,3,4,5,and 6 days later were all significantly higher than those of the control group(F = 159.17,448.81,265.15,183.93,and 181.83 ,all P <0.01),with the proliferation rates of the 100 mGy subgroup being the highest.After being induced liquid,vacuoles were observed in the irradiated group 2 days later.21 days later,the adipogenic rates of irradiated group was significantly higher than that of the control group (t = 28.25,P <0.01).The ALP activity increased in the irradiated group compared with control group (t=16.87,P <0.01) .The expression level of Cbf-α1 mRNA was up-regulated obviously (t = 14.16,P＜0.01).Conclusions LDR promotes the proliferation of hucMSCs,and accelerates the hucMSCs' differentiation into adipocytes and osteoblasts.     

人脐带间充质干细胞来源的外泌体免疫调节功能异质性研究

目的 研究不同供者来源的人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)分泌的外泌体免疫调节能力的异质性.方法 培养5株不同供者来源的hUC-MSC,收集无血清培养上清提取外泌体,流式细胞术检测其表面特异性标志CD9、CD63、CD81、CD44的表达,BCA法测定总蛋白含量.将外泌体和脐带血单个核细胞(UBMC)共培养72 h,MTT实验检测细胞增殖活性, ELISA测定共培养上清中干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量.离心重悬UBMC和K562细胞按5∶1的比例共培养4 h,MTT实验检测细胞活性,计算UBMC的杀伤能力.结果 提取的外泌体表达CD9,CD63,CD81及CD44.不同供者来源hUC-MSC分泌的外泌体对UBMC的增殖、分泌细胞因子及K562细胞杀伤能力的作用不同.结论 不同供者hUC-MSC的外泌体免疫调节能力具有异质性.