靶向表达的逆转录病毒载体LN．ALBTRS．TK的构建

目的：构建出在肝细胞中具靶向表达潜能的逆转录TK基因载体。方法：用p2335A-l中的一段2．0Kb的人白蛋白组织特异性转录谓节序列(ALBTRS)取代pSTK中的SV40启动子，所构建的载体命名为LN．ALB-TRS．TK。结果：载体LN．ALBTRS．TK的结构中。含有ALBTRS启动子，具有在肝细胞中特异表达白蛋白的潜能，载体经酶切鉴定表明结构符合要求。结论；成功地构建出具靶向表达潜能的逆转录载体LN．ALBTRS．TK。     

逆转录病毒载体LN．ALBTRS．TK体外靶向表达研究

逆转录HSV—TK载体用于肝癌的转基因治疗已在动物实验证明有良好效果．但目前尚无满意的靶向表达载体可供使用,本研究采用PCR、Southern blot及Northern blot等方法．对本室构建的逆转录载体LN．ALBTRS．TK在体外对多种靶细胞进行转染和表达的检测．结果表明：LN．ALBTRS．TK能转染多种肿瘤细胞．包括肝癌细胞及非肝癌细胞．并在表达白蛋白的肝癌细胞中可检测到mRNA的转录和HSV—TK的表达产物,而在不表达白蛋白的非肝癌细胞中无HSV—TK的mRNA转录和HSV—TK的蛋白产物表达。这一结果表明：LN．ALBTRS．TK逆转录载体能正确的在期望的细胞中靶向表达．具备一定的组织特异性。     

靶向表达的逆转录病毒载体LN.ALBTRS.TK的构建

目的:构建出在肝细胞中具靶向表达潜能的逆转录 TK 基因载体。方法:用 p2335A-1中的一段2.0Kb的人白蛋白组织特异性转录调节序列(ALBTRS)取代 pSTK 中的 SV40启动子,所构建的载体命名为 LN.ALB-TRS.TK。结果:载体 LN.ALBTRS.TK 的结构中,含有 ALBTRS 启动子,具有在肝细胞中特异表达白蛋白的潜能,载体经酶切鉴定表明结构符合要求。结论:成功地构建出具靶向表达潜能的逆转录载体 LN.ALBTRS.TK。     

靶向表达的逆转录病毒载体LN.ALBTRS.TK的构建

目的构建出在肝细胞中具靶向表达潜能的逆转录TK基因载体。方法用p2335A-1中的一段2.0kb的人白蛋白组织特异性转录调节序列(ALBTRS)取代pSTK中的SV40启动子,所构建的载体命名为LN.ALBTRS.TK。结果载体LN.ALBTRS.TK的结构中,含有ALBTRS启动子,具有在表达白蛋白的肝细胞中特异表达的潜能,载体经酶切鉴定表明结构符合要求。结论成功地构建出具靶向表达潜能的逆转录载体LN.ALBTRS.TK。     

逆转录病毒载体LN．ALBTRS．TK体外转染伍用GCV对人肝癌细胞的体外杀伤研究

HSV—TK转基因治疗肝癌的效果取决于受转染的肝癌靶细胞是否对GCV敏感及其敏感的程度,体外研究的报道表明转染细胞对GCV的敏感性较未转染细胞增加100～1000倍以上,我们应用存活率曲线对LN．ALBTRS．TK转染的肝癌细胞进行研究,结果报告如下：     

VEGF基因治疗靶向载体的构建及其特异性表达分析

目的 :构建KDR启动子介导的VEGF逆转录病毒载体pLXSN D2 99 KDRp VEGF1 6 5,并对其内皮细胞特异性表达作用进行分析。方法 :将逆转录病毒载体 3’LTR的U3区缺失 2 99个碱基使其自身启动子失活 ,然后重组pLXSN D2 99 KDRp VEGF1 6 5载体。经PA317细胞包装 ,NIH3T3细胞测定其病毒滴度。用高病毒滴度细胞株产生的病毒上清分别感染ECV30 4人脐静脉血管内皮细胞和NIH3T3细胞 ,收集细胞培养上清经ELISA和westernBlot分析。结果 :VEGF1 6 5在内皮细胞ECV30 4中的表达量明显高于NIH3T3细胞。结论 :构建的pLXSN D2 99 KDRp VEGF载体 ,可在内皮组织细胞中特异性地表达VEGF。     

FZD2基因RNAi逆转录病毒载体的构建

设计含不同FZD2基因特异性序列的62bp寡核苷酸片段,将其构建到含有H1启动子并具有绿色荧光蛋白的逆转录病毒载体pQsupR／F中,将构建好的质粒转染293T细胞。通过酶切鉴定和测序分析,62bp寡核昔酸片段已经成功插入到RNA干扰（RNAi）的逆转录病毒载体中,转染293T细胞,通过绿色荧光可见其转染效率非常高。     

GATA-3基因反义逆转录病毒载体的构建

支气管哮喘(简称哮喘)是一种呼吸道慢性炎症性疾病。Ⅱ型辅助性T淋巴细胞(Th2)在起始和维持气道慢性炎症级联反应中具有重要作用。GATA-3为Th2淋巴细胞特异性转录因子，在Th2淋巴细胞分化及Th2类细胞因子基因转录中具有关键性作用^[1]。我们的实验应用反义真核表达载体构建技术，构建了GATA-3反义逆转录病毒载体．对进一步研究Th2淋巴细胞定向分化及Th2类细胞因子基因转录的分子机制和探讨哮喘治疗的新途径均具有重要意义。     

肝细胞生长因子受体靶向shRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建和鉴定人肝细胞生长因子受体（cMet）的shRNA的真核表达载体。方法：人工合成针对cMet的4对shRNA序列并定向克隆到siRNA（small interference RNA）真核表达载体RNAi-Ready pSIREN-DNA-DsRed-Express Vector上；采用双酶切和测序法鉴定。结果：酶切及测序鉴定得到的产物与预期的目的基因一致。结论：成功构建肝细胞生长因子受体靶向shRNA的真核表达载体。     

可溶性TGF-β1Ⅱ型受体逆转录病毒表达载体的构建

目的:构建表达人TGF-β1Ⅱ型受体细胞外结合区和人IgG1 Fc的融合蛋白逆转录病毒载体,为进一步肝纤维化的基因治疗奠定实验基础.方法:以RT-PCR方法扩增目的基因TβRⅡ-IgG1Fc,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM-T-Easy,挑取阳性克隆酶切鉴定后测序;利用重组DNA技术,将TβRⅡ-IgG1 Fc基因亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,测定病毒滴度.结果:经测序、限制性酶切分析及PCR方法鉴定,载体插入基因序列、大小、位置均正确,并用PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的感染性重组病毒产生细胞系.结论:成功构建了重组质粒pL(TβRⅡ-IgG1 Fc)SN,可望为肝纤维化的基因治疗提供有效途径.     

逆转录病毒载体感染原代大鼠肝细胞的研究

目的研究逆转录病毒载体高效转移并表达于大鼠原代肝细胞．方法采用表皮生长因子（ＥＧＦ）刺激大鼠原代肝细胞增殖,以表达β半乳糖苷酶的双顺反子逆转录病毒载体（ｐＧＣＥＮ／βｇａｌ）感染肝细胞．采用Ｘｇａｌ原位染色方法检测肝细胞内ＬａｃＺ的表达．结果肝细胞表达β半乳糖苷酶基因,转导效率为３％～２２％．结论双顺反子逆转录病毒载体（ｐＧＣＥＮ／βｇａｌ）可有效介导βｇａｌ基因表达于原代大鼠肝细胞,提示该载体可用于标记大鼠肝细胞,有利于研究肝细胞移植后在体内的生物学特性和肝病的体外基因治疗．     

凋亡素基因序列重组及其真核表达载体的构建

目的 构建携带Kozak序列的重组凋亡素基因VP3表达载体，为提高凋亡素基因在肿瘤细胞中的表达效率，增强其诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性奠定实验基础。方法 通过两次PCR，以pcDNA-VP3质粒为模板．扩增出带Kozak序列(真核核糖体结合位点)的凋亡素基因VP3。将其克隆到真核表达载体pRevTRE的多克隆位点，构建重组凋亡素的真核表达载体pRevTRE-VP3，将该重组表达载体分别以限制性内切酶BamHI和XhoI进行酶切鉴定，进一步将初步鉴定显示插入目的基因的质粒进行测序鉴定。结果 测序结果表明，本研究合成的凋亡素基因与Notebom报告的凋亡素基因序列一致，同源性为100％。在其起始密码子前添加了Kozak序列的凋亡素基因已成功克隆到真核表达载体pRevTRE。结论 采用两次PCR法可将提高表达效率的真核核糖体结合位点添加到凋亡素基因序列起始密码子前端，并构建成凋亡素真核表达载体。     

乙型肝炎病毒C基因逆转录病毒载体的构建及在永生化人外周？…

目的体外研究乙型肝炎病毒Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ）基因变异的生物学意义。方法 应用逆转 录病毒勒体ＰＸＴ１构建ＨＢＶ／Ｃ基因表达载体，并转染永生化人外周血Ｂ细胞使之稳定ＨＢｃＡｇ。结果 重组质粒ＰＸＴ１－ＨＢＶ／Ｃ经聚合酶链反应（ＰＣＲ）和ＢｇｌⅡ及ＸｈｏⅠ双酶切鉴定均阳性，转染后的永生化人外周血Ｂ细胞ＰＣＲ鉴定含目的ＤＮＡ，流式细胞仪分析显示，约４７．４％的细胞膜上表达了ＨＢｃＡｇ。结论ＨＢＶ／Ｃ基因逆转     

不同启动子驱动HDV核酶的逆转录病毒载体构建

目的分别构建CMV、H1、tRNA、U2、U3和U6启动子驱动反式丁型肝炎病毒核酶（HDV核酶）的逆转录病毒表达载体。在这些载体中,HDV核酶设计为靶向HBV基因序列PreS2和C区。方法用PCR技术分别扩增CMV、U2和U3启动子,并连入pMD18-T载体。合成靶向PreS2和C区HDV核酶并利用SalⅠ和H indⅢ的酶切位点分别连入逆转录病毒表达载体pLEGFP（pLEGFP-R z）。然后利用BamHⅠ和SalⅠ的酶切位点分别把CMV、H1、tRNA、U2、U3和U6启动子连入重组载体pLEGFP-R z。所有的重组载体经PCR和酶切的方法验证。结果成功地构建了分别含有6种启动子驱动HDV核酶的逆转录病毒载体。结论这些重组载体的构建为筛选高效表达核酶的启动子奠定基础。同时这些重组载体也可用于进一步研究HDV核酶抑制HBV复制的效率。     

丙型肝炎病毒cDNA与荧光素酶融合基因可调控逆转录病毒载体的构建

目的 构建丙型肝炎病毒(HCV)cDNA与荧光素酶(Luc)融合基因可调控逆转录病毒载体,以建立容易检测的HCV体外细胞模型。方法 利用基因重组技术,将HCV5’非编码区(5’NCR)和/或核心(C)区基因克隆于pGEM-Luc-DNA载体,使其与Luc基因相融合,然后再将融合基因插入可调控逆转录病毒载体(PBPSTR1)。结果pCEM-HCVl和pBPSTRl-HCV经酶切鉴定,HCV5’NCR和/或C区cDNA已与Luc基因融合,并被克隆于pBPSTRl。结论 通过体外分子克隆技术可使HCV基因cDNA带上Luc报告基因,并可克隆于逆转录病毒载体,为建立易检测的HCV细胞模型和进一步抗病毒基因治疗以及药物的筛选奠定了基础。     

人Tum-5基因逆转录病毒载体及包装细胞株的构建

目的 构建携带Tum-5基因的逆转录病毒载体并对其进行包装,获得稳定的产毒细胞系.方法 采用RT-PCR法从胎肾组织中扩增Tum-5基因片断,并将其定向克隆到逆转录病毒载体pLXSN中进行PCR、双酶切和测序鉴定.利用电穿孔方法 将获得的重组质粒转染PA317细胞,经G418 筛选抗性克隆,收集病毒上清后感染NIH3T3 细胞测定病毒滴度.结果 PCR、酶切证实Tum-5基因克隆至逆转录病毒载体pLXSN,Tum-5基因测序结果 和原始序列相同.重组逆转录病毒载体转染PA317 包装细胞,RT-PCR证实转染后的PA317细胞上清液中存在携带人Tum-5基因的病毒RNA,病毒滴度为2.05×104cfu/ml.结论 成功的构建了携带人Tum-5基因的逆转录病毒载体,获得了稳定的产毒细胞系.     

tPA基因逆转录病毒载体构建及纯包装细胞系培育

目的构建含人组织型纤溶酶原激活剂（tPA）基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因逆转录病毒载体及产高滴度病毒的纯包装细胞系。方法PCR技术扩增目的基因tPA,定向克隆人逆转录病毒载体pLEGFP- N1中,测序鉴定重组逆转录病毒载体pLEGFP-N1-tPA,将其转入包装细胞PT67,培育全EGFP纯包装细胞系;测定病毒滴度。结果证实pLEGFP-N1-tPA中含有tPA基因。转染有pLEGFP-N1-tPA的纯PT67细胞产病毒滴度为1×10^7 CFU/ml。结论成功构建了pLEGFP-N1-tPA载体,并培育了产高滴度病毒纯包装细胞系。