人PSCA基因真核载体的构建与表达

目的 克隆人PSCA(prosaae stem cell antigen)分子的cDNA,构建PSCA基因的真核表达载体,并在体外进行表达和鉴定.方法 从PSCA阳性细胞系LNCaP中提取总RNA,逆转录为cDNA.根据编码人PSCA的基因序列设计引物,以cDNA为模板,采用PCR技术扩增PSCA基因,将该基因插入到pcDNA3.1(+)真核载体,构建pcDNA3.1(+)-PSCA表达质粒.经限制性酶切鉴定和DNA序列测定结果证实后,将重组质粒pcDNA3.1(+)-PSCA转染Hela细胞,检测其体外瞬时表达.结果 测序证实得到人PSCA基因序列,序列分析显示没有发生无义突变.RT-PCR和免疫细胞化学分析结果分别表明转染细胞有目的 基因和分子的表达.结论成功克隆人PSCA基因,并在真核细胞中获得表达,为进一步构建基于PSCA的肿瘤疫苗奠定了基础.     

CXCR4基因慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定

目的构建CXCR4基因慢病毒过表达载体并对其进行包装、鉴定。方法首先设计合成引物,采用PCR法扩增目的基因CXCR4,将目的基因与酶切线性化的载体进行定向交换,成功构建重组载体慢病毒表达载体p GC-FU-CXCR4,将其产物转化大肠杆菌感受态细胞。对培养出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,最后将获得的病毒载体共同转染293T细胞,收集病毒颗粒,并采用Real time PCR法测定病毒滴度。结果 PCR鉴定结果显示扩增的目的基因已成功插入p GC-FU载体,Western Blot结果显示得到的片段与理论大小相符,阳性克隆测序结果与目的基因序列一致,说明重组慢病毒载体的插入序列完全正确。结论本实验成功构建了CXCR4慢病毒表达载体,并成功对慢病毒进行了包装及病毒滴度测定。     

hLMO3基因全长及截短序列原核表达载体的构建及蛋白诱导表达

目的构建hLMO3原核全长及5个截短表达载体并鉴定融合蛋白的表达。方法提取工具细胞HEK293的mRNA,反转录为cDNA,PCR扩增hLMO3全长及截短编码基因,亚克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-2中。在E.coli BL21中诱导GST-hLMO3全长及截短融合蛋白表达,并经免疫印迹鉴定结果。结果 hLMO3全长及5个截短基因序列克隆到了原核表达载体pGEX-5X-2中,并经测序鉴定正确。Westernblot在E.coli Bl21中检测到了相应融合蛋白的表达。结论成功构建hLMO3全长及5个截短基因序列原核表达载体,在E.coli BL21中诱导表达出GST-LMO3全长及截短融合蛋白。     

人IgG Fc基因的扩增及其在真核细胞中的分泌性表达

目的:通过扩增人IgG Fc基因并与人CD5基因信号肽序列融合,构建真核分泌型表达载体,实现在真核细胞中高效表达,为利用Fc基因制备融合抗原,研究抗原基因和抗原蛋白的免疫治疗奠定了基础.方法:从外科手术切除的扁桃体中分离人淋巴细胞,用Trizol试剂提取淋巴细胞的总RNA,通过RT-PCR方法从淋巴细胞中扩增人IgG Fc 片段的基因序列,并将其克隆到pMD-T18 质粒载体上.然后以上述含有Fc片段序列的质粒载体和含有人CD5基因的质粒为模板,通过重叠延伸PCR方法将Fc片段与CD5信号肽基因序列进行融合,并将其插入到pcDNA3.1A 真核表达载体上,构建成与CD5信号肽融合的Fc片段基因的分泌型表达载体.经磷酸钙介导转染293T细胞使其表达.结果:测序表明扩增的Fc基因序列与GeneBank发表的序列完全一致,Western blot检测结果表明,本实验构建的Fc基因分泌型表达载体能够在真核细胞进行高效分泌性表达,表达水平在转染后48小时可达50 μg/1×106细胞.结论:采用RT-PCR扩增了人IgG Fc cDNA 基因,经过与人CD5信号肽序列融合构建了分泌型表达载体,实现了在293T细胞中的高效表达,这为今后构建特定抗原基因与IgG Fc基因融合表达载体,研究DNA疫苗及Fc的生物佐剂提供了实验依据.     

人呼吸道合胞病毒F基因的克隆、真核表达与鉴定

目的 克隆人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus,HRSV）F基因,构建F基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）/F,并进行表达和鉴定。方法根据编码F蛋白的基因序列设计引物,通过RT-PCR从感染HRSV的HEp-2细胞中扩增获得F蛋白的基因,然后克隆到pGEM-3zf载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋）,行酶切鉴定,脂质体法转染COS-7细胞,应用Western blotting方法分析F基因表达情况。结果测序证实得到HRSVF基因序列,序列分析显示没有发生无义突变。转染COS-7细胞后,利用Western blotting方法检测到了F蛋白的特异性条带。结论成功克隆HRSVF基因,并在真核细胞中获得表达。     

人BLyS基因真核细胞表达载体的构建和鉴定

目的构建人BLyS基因真核细胞表达载体.方法采用RT-PCR方法,从激活的人外周血淋巴细胞的总cDNA中扩增得到876bp的人BLyS cDNA片段,再用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果人BLyS cDNA已经正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中.结论本实验结果为研制抗人BLyS单克隆抗体来研究BLyS与B淋巴细胞功能的关系以及进一步探索自身免疫性疾病的治疗新途径奠定了基础.     

CD146基因重组质粒的构建及蛋白表达

目的构建CD146原核、真核表达载体,证实融合蛋白在原核细胞的诱导表达以及在胃癌细胞内的表达和定位。方法提取人黑色素瘤细胞A875的总mRNA并进行反转。以反转录的cDNA为模板PCR扩增CD146全长编码基因,分别克隆至pCDNA3.1-myc/his以及pGEX-4T-3表达载体中。原核重组质粒鉴定后转入BL21细胞中并经了诱导表达及纯化,真核表达质粒转入胃癌MKN45细胞中,分别利用westernblot和激光共焦扫描显微技术检测了重组质粒的表达以及在胃癌细胞中的定位。结果 CD146全长基因序列克隆到原核、真核表达载体中,酶切鉴定片段为1930bp。原核诱导出了GST-CD146并进行了纯化,CD146在真核细胞中表达为113KD的糖蛋白,Westernblot检测到真核转染的myc/his-CD146表达,条带约为120KD,免疫荧光显示蛋白定位在胃癌MKN细胞膜。结论成功构建了CD146原核、真核表达载体,融合蛋白在胃癌MKN45细胞表达。     

人GDDR基因启动子的克隆和报告基因载体构建

目的:克隆人GDDR基因的启动子;构建GDDR启动子的报告基因载体并进行活性分析.方法:设计合成GD-DR启动子引物,采用PCR技术从人基因组DNA中扩增GD-DR启动子;将扩增片段插入T载体并利用酶切与测序进行鉴定;亚克隆该基因至pGL3-Basic荧光报告基因载体;瞬时转染细胞,用双荧光素酶报告基因系统检测报告基因载体的活性.结果:PCR扩增得到人GDDR基因启动子;成功构建pGL3-GDDR-promoter 报告基因载体,测序结果表明启动子序列正确;双荧光素酶报告基因检测系统证实构建的报告基因载体具有启动子活性.结论:成功地构建人GDDR基因启动子的克隆及其报告基因载体的构建,为深入研究GDDR转录表达的调控机制提供基础.     

肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人HSP70融合基因的构建及原核表达

目的:构建及原核表达肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因.方法:采用加端PCR方法,将EPVTKAEML的基因序列融合到人HSP70基因的3′端;将融合基因克隆入原核表达载体pET-28a( )中,构建重组质粒pET-28a( )/EPVTKAEML-HSP70.经限制性内切酶BamH I、Xho I双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE检测表达结果.结果:应用加端PCR方法扩增出约2.0 kb的目的片段,序列测定结果证实,EPVTKAEML的基因序列成功地融合到人HSP70基因的3′端.经BamH I、Xho I酶切鉴定证实,融合基因成功地克隆到原核表达载体pET-28a( )上;转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析发现在相对分子质量(Mr)约72 000处有表达量明显增多的蛋白条带.结论:成功地构建并表达了肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人HSP70的融合基因.     

MTS1／p16抑制基因的克隆及其对宫颈癌细胞系的影响

利用重组ＲＴ－ＰＣＲ方法从人胎盘中扩增多重肿瘤抑制基因（ＭＴＳ１）全长ｃＤＮＡ片断，克隆测序后，亚顾隆入哺乳动物高铲表达质粒ｐＣＥＰ中。将表达质业转染两种遗传背影不同的吕颈癌细胞系，发现外源基因ＭＴＳ１／ｐ１６基因的导入对ＨＰ〖Ｖ阳性的宫颈癌细胞系具有明显生长抑制作用，并出现细胞滞留Ｇ１期的特性。     

人KLF4基因克隆及重组KLF4慢病毒表达载体的构建?

背景：KLF4基因在细胞分化过程中有重要作用。 目的：构建KLF4基因慢病毒过表达载体。 方法：聚合酶链反应扩增(PCR)目的基因KLF4后插入慢病毒表达载体pCDH中,构建重组载体pCDH-KLF4。通过PCR、双酶切和DNA测序方法对其鉴定,共同转染293NT细胞包装病毒,荧光显微镜观察报告基因的表达情况,收集病毒上清,测定病毒的滴度。将重组的慢病毒感染5637细胞,RT-PCR检测KLF4 mRNA的表达。 结果与结论：重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实重组慢病毒载体pCDH-KLF4的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染5637细胞后,细胞内KLF4 mRNA高表达。结果证实,实验成功构建KLF4基因慢病毒过表达载体。     

小鼠催产素受体基因编码区全长的克隆和真核表达

目的 :为了获得小鼠催产素受体 (mouseoxytocinreceptor,mOTR)基因的全长编码区和构建mOTR的真核表达载体 ,以及在哺乳动物细胞中真核表达mOTR。方法 :采用RT PCR方法 ,获得有相互重叠序列的mOTR的羧基端和氨基端的cDNA片段并分别将其亚克隆入PMD 18 T载体。通过对这 2个片段加入酶切位点、双酶切和相互连接 ,获得全长的编码序列。然后将mOTR的全长的编码序列克隆入真核表达载体pEGFP N3,再用脂质体转染法将pEGFP N3 mOTR质粒转染到COS 7细胞中并进行了瞬时真核表达。结果 :将mOTR的羧基端和氨基端的cDNA片段亚克隆入了PMD 18 T载体。连接并最终获得了mOTR编码区的全长序列 ,构建了pEGFP N3 mOTR真核表达载体。将pEGFP N3 mOTR载体转染入COS 7细胞 ,并成功地进行了瞬时真核表达。结论 :成功构建了包含mOTR全长编码区序列的pEGFP N3 mOTR真核表达载体 ,并在COS 7细胞中进行了瞬时表达 ,为今后研究mOTR的功能打下了基础。     

iNOS基因和iNOS-VP1融合基因真核表达载体的构建及初步表达

目的 构建pcDNA3．1介导的诱导性一氧化氮合成酶（iNOS）的基因表达载体和pcDNA3．1介导的iNOS与柯萨奇病毒B组3型（CVB3）结构蛋白VP1融和基因的表达载体。方法 应用PCR扩增和DNA重组技术构建pcDNA3．1-iNOS和pcDNA3．1-iNOS—VP1表达载体；应用真核细胞转染技术及间接免疫荧光技术进行所构建的真核表达载体的初步表达和鉴定。结果 经PCR扩增技术用特异引物从质粒pKSiNOS分离编码iNOS开放阅读框架的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将插入片断亚克隆于表达载体pcDNA3．1；经PCR扩增技术用特异引物从质粒pCR2．1-VP1分离编码CVB3VP1结构蛋白的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将VP1亚克隆于iNOS的表达载体pcDNA3．1-iNOS，从而构建含有iNOS和VP1融合基因的真核表达载体。限制性内切酶分析、PCR鉴定和测序证实重组体peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iN—OS—VP1插入片断的大小和方向正确且开放阅读框架的读码框不变；重组质粒peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iNOS．VP1在HeLa细胞中均有表达，但表达效率较低。结论 获得含iNOS基因和iNOS—VP1融合基因的真核表达载体，并将重组质粒进行了初步表达，为体外iNOS抗CVB3作用的研究奠定了物质基础。     

Ad-EGFP-MCP-1腺病毒表达载体的构建与表达

背景：单核细胞趋化因子(monocyte chemotactic protein, MCP)可促进新生血管的动脉化,形成功能性微动脉,进而实现血管新生。 目的：构建Ad-EGFP-MCP-1腺病毒表达载体,包装、纯化并检测病毒滴度,观察其在体表达。 方法：PCR法钓取目的基因MCP-1,将其亚克隆入pDC315-EGFP载体,利用辅助包装质粒pBHG lox ΔE1,3 Cre进行病毒包装得到Ad-EGFP-MCP-1,经呼吸道途径转染至肺动脉高压大鼠。 结果与结论：通过PCR获得MCP-1全长cDNA,与GenBank比对,序列完全一致。荧光显微镜下可见所包装的Ad-EGFP-MCP-1腺病毒表达载体可在大鼠肺组织中稳定表达,1周时达高峰,持续约4周。证实实验成功构建并包装了Ad-EGFP-MCP-1,其在肺组织中可有效表达。     

pDC315-SPA-mCLCA3载体的构建及其在气道上皮细胞系的靶向表达分析

目的: 构建腺病毒穿梭质粒(pDC315)-肺表面活性蛋白A基因启动子(SPA)-小鼠钙激活氯通道3(mCLCA3)融合基因表达载体,分析其在气道上皮细胞系的靶向表达。方法: PCR法从 PGL-SPA 和 pCR-Blunt II-TOPO载体中克隆全长2 948 bp的SPA- mCLCA3 基因序列并将其亚克隆入pDC315-EGFP 载体,构建pDC315-SPA-mCLCA3靶向表达载体。测序鉴定正确后分别转染气道上皮细胞系(H441细胞)和非气道上皮细胞系(HEK293细胞)。每种细胞分pDC315-EGFP组(EGFP阳性,mCLCA3阴性)和 pDC315-SPA-mCLCA3组(mCLCA3阳性),分析 mCLCA3 在不同上皮细胞的表达水平。结果: 测序结果证实成功构建含有气道上皮细胞特异性启动子 SPA的mCLCA3 重组质粒。靶向表达分析表明mCLCA3 mRNA在高表达SPA的H441细胞中表达显著高于其在HEK293细胞的表达(P<0.05);免疫细胞化学表明H441细胞pDC315-SPA-mCLCA3组中mCLCA3蛋白表达阳性而pDC315-EGFP组表达阴性,HEK293细胞两种质粒转染组mCLCA3蛋白均阴性。结论: 成功构建气道上皮细胞靶向表达 mCLCA3 基因的重组腺病毒穿梭载体pDC315-SPA-mCLCA3, 为后续构建腺病毒靶向载体Ad -SPA-mCLCA3及研究mCLCA3在气道上皮缺陷中的作用提供实验基础。     

转录因子JunB在肝癌细胞中的表达、定位及其转录作用研究

目的:构建表达转录因子JunB的真核表达质粒,观察外源JunB分子在细胞中的表达、亚细胞定位及其对下游分子的转录调控作用。方法:采用PCR方法从人源肝cDNA文库中扩增JunB基因片段,克隆入T载体进行测序鉴定。而后将测序正确的基因片段分别亚克隆入pcDNA3.1(-)和pEGFP-C3真核表达载体中,获得重组载体pcDNA-JunB和pEGFP-JunB。采用脂质体瞬时转染法分别将pEGFP-JunB和pcDNA-JunB导入肝癌细胞HepG2中,用Westernblot法观察外源JunB在肝癌细胞中的表达;用荧光显微镜观察其在细胞内的定位;用双荧光素酶报告基因检测法观察JunB对下游靶分子VEGF的转录调控作用。结果:分别构建表达转录因子JunB和增强型绿色荧光蛋白融合JunB分子的重组表达质粒,并经KpnI/BamHI双酶切鉴定正确。将重组表达质粒转染HepG2细胞后,经免疫印迹法和荧光显微镜检测,可见外源导入的JunB分子在细胞中成功表达并特异性定位定位于细胞核内。荧光素酶报告系统检测显示:JunB对VEGF分子在转录水平具有明显的激活作用。结论:成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因和转录因子JunB基因融合表达的重组质粒。在肝癌细胞中观察到外源瞬时表达的JunB定位于细胞核中,提示其可能发挥转录因子的活性。报告基因结果显示其对肿瘤血管生成密切相关的分子VEGF发挥转录激活的作用,提示JunB分子有可能成为抑制肝癌血管生成的新靶点。     

mTSARG3真核表达载体的构建及其稳定转染细胞系的建立

目的:构建小鼠mTSARG3基因真核表达载体,转染小鼠精原细胞系GC-1,建立稳定转染mTSARG3的GC-1细胞系,利用流式细胞技术(FCM)进行初步功能研究。方法:应用RT-PCR从小鼠睾丸cDNA文库中扩增mTSARG3的开放阅读框(ORF),并将PCR产物插入到pGEM-TEasy载体中测序验证。随后,经NotI和Hind III酶切后将目的片段进一步克隆到pcDNA3.1 Hygro(-)真核表达载体中。将经过测序验证的pcDNA3.1 Hygro(-)/mTSARG3表达质粒转染GC-1细胞,通过潮霉素筛选建立mTSARG3稳定转染的GC-1细胞系。RT-PCR和Western blot检测mTSARG3在稳定转染的GC-1细胞系中的表达;FCM观察转染pcDNA3.1 Hygro(-)/mTSARG3重组质粒)对GC-1细胞周期和凋亡的影响。结果:成功构建了pcDNA3.1 Hygro(-)/mTSARG3表达质粒,建立了稳定转染的GC-1细胞系。RT-PCR和Western blot检测结果发现,mT-SARG3在GC-1细胞系中成功表达。进一步通过FCM检测分析发现,转染mTSARG3可促进GC-1细胞增殖,抑制细胞凋亡。结论:mTSARG3真核表达载体的成功构建和稳定转染重组质粒GC-1细胞系的建立为进一步体外研究mTSARG3的功能奠定了基础。     

hNaDC1基因5''''侧翼区转录调控序列系列载体构建与鉴定

目的构建hNaDC1基因5’侧翼区转录调控序列系列萤火虫荧光素酶报告基因表达载体。方法PCR扩增获得hNaDC1基因5’侧翼转录调控区不同长度片段:hNaDC1A(-2232/ 136,2368bp)、hNaDC1B(-1640/ 136,1776bp)、hNaDC1C(-1084/ 136,1221bp)、hNaDC1D(-253/ 136,389bp)、hNaDC1E(-2232/-12,2244bp),以pGL3-Basic为载体构建hNaDC1基因5’侧翼序列系列缺失质粒。重组体通过特异限制性内切酶酶切鉴定,并送样测序鉴定。结果成功构建hNaDC1基因5’侧翼区转录调控元件萤火虫荧光素酶报告基因表达载体5个:pGL3-hNaDC1A～E。结论为进一步研究NaDC1基因5’侧翼区转录调控元件的分布特点及转录调控元件与转录因子间的相互作用提供了基本实验条件。     

人白介素17F真核蛋白表达及促炎症作用的研究

利用真核表达载体pCEP4,在人肾上皮293T细胞中表达hIL-17F/mFc融合蛋白并初步研究IL-17F生物学特性。实验应用RT-PCR法克隆hIL-17F CDS段基因序列。将测序正确的hIL-17F序列插入pCEP4质粒构建pCEP4/hIL-17F真核表达载体。转染人肾上皮293T细胞后,筛选阳性表达细胞株。RT-PCR、ELISA和Western blot等法鉴定hIL-17F分子的mRNA和蛋白表达。体外实验验证其促炎症作用。结果表明,构建的pCEP4/hIL-17F重组表达载体,能在293T细胞中稳定表达。获得的hIL-17F重组蛋白能稳定结合Raji细胞上的IL-17RC受体。体外刺激ECV304细胞,能显著促进IL-2等炎症因子的分泌。稳定表达hIL-17F重组蛋白的293T细胞系的建立,为进一步研究hIL-17F的生物学功能奠定了良好的基础。