胃肠安诱导胃癌MKN45细胞自噬的机制

目的:观察健脾复方胃肠安对人胃癌MKN45细胞自噬的影响,探讨其抗肿瘤的作用机制。方法:体外培养人胃癌MKN45细胞,采用细胞活力检测法(CCK-8)检测不同质量浓度胃肠安(250,500,1000,2000 mg·L^-1)作用体外培养的人胃癌细胞MKN45细胞,共孵育24,48,72 h,检测细胞增殖活力的改变;采用吖啶橙(AO)染色和单丹磺胺戊二胺(MDC)染色观察胃肠安对胃癌MKN45细胞自噬小体及自噬囊泡的变化;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测微管相关蛋白1轻链3(LC3),酵母ATG6同源物(Beclin1),泛素结合蛋白-1(p62),自噬相关基因5(ATG5),自噬相关基因7(ATG7)mRNA和蛋白的表达。结果:CCK-8实验显示,与空白组比较,胃肠安(500,1000,2000 mg·L^-1)可明显抑制MKN45细胞的增殖能力(P<0.05,P<0.01);AO和MDC染色显示,与空白组比较,随着胃肠安浓度的增加,自噬小体和自噬囊泡含量逐渐增加;Real-time PCR和Western blot结果显示,与空白组比较,胃肠安(1000 mg·L^-1)组细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ,Beclin1,ATG5,ATG7 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05),p62表达下降(P<0.05,P<0.01)。结论:胃肠安可诱导人胃癌MKN45细胞自噬,其机制涉及上调自噬相关基因Beclin1,ATG5,ATG7 mRNA和蛋白表达,下调p62 mRNA和蛋白表达,促进自噬标志蛋白LC3-I向LC3-Ⅱ转化。     

桑葚花色苷诱导人胃癌SGC-7901细胞自噬凋亡的研究

目的:观察桑葚花色苷对人胃癌SGC-7901细胞自噬和凋亡的作用及机制。方法:MTT法检测桑葚花色苷对SGC-7901细胞增殖的作用;流式细胞术分析桑葚花色苷对SGC-7901细胞凋亡的影响;Hoechst33342/PI活细胞染色观察凋亡细胞核形态学变化;透射电镜观察SGC-7901细胞的超微结构变化。Western blot检测SGC-7901细胞自噬分子标记物LC3、Beclin1和凋亡蛋白BAX、BCL-2及Caspase-8的表达。结果:桑葚花色苷能抑制SGC-7901细胞增殖,流式细胞术及Hoechst33342/PI双染结果显示桑葚花色苷可诱导SGC-7901细胞凋亡。透射电镜观察显示桑葚花色苷干预后的SGC-7901细胞发生自噬。Western blot证实桑葚花色苷可提高SGC-7901细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ,BAX/BCL-2比值以及Beclin1、Caspase-8的表达。结论:桑葚花色苷能抑制人胃癌SGC-7901细胞的增殖,诱导细胞出现凋亡和自噬,其机制与上调SGC-7901细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ,BAX/BCL-2比值及Beclin1、Caspase-8的表达有关。     

熊果酸对肺癌细胞A549自噬相关蛋白的影响

目的研究自噬在熊果酸抑制人肺癌A549细胞增殖中的作用及机制。方法应用CCK8法检测熊果酸对A549细胞增殖的影响;实时荧光定量PCR法检测自噬相关基因LC3、 Beclin-1及p62的表达情况;Western Blot检测自噬相关蛋白LC3、 Beclin-1及p62的表达情况。采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌(3-MA)观察熊果酸对A549细胞增殖的抑制作用。结果熊果酸可以显著抑制人肺癌A549细胞的活力(P0.01)且随着熊果酸剂量增加,对细胞的生长抑制率显著上升。熊果酸可诱导A549细胞自噬发生,诱导自噬相关基因、蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、 Beclin-1表达的增加;p62表达降低(P0.01);3MA使得自噬相关基因、蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、 Beclin-1表达明显降低;p62表达明显增加(P0.01)。自噬抑制剂3-MA提高了熊果酸对A549细胞的抑制作用(P0.01)。结论熊果酸抑制A549细胞的增殖,可能通过调节LC3Ⅱ/Ⅰ、 Beclin-1及p62蛋白表达诱导细胞发生自噬。自噬抑制剂3-MA能够增强熊果酸抑制A549细胞的增殖抑制作用,有望为肺癌的临床治疗提供新的联合治疗方案。     

苦参碱诱导宫颈癌Siha细胞凋亡的机制研究

目的:研究苦参碱对宫颈癌Siha细胞的自噬、凋亡作用,探讨苦参碱抑制宫颈癌发生发展的作用机制,为中药单体及联合用药治疗宫颈癌提供实验依据。方法:"采用SRB(sulforhodamine B,磺基罗丹明B)法检测苦参碱对Siha细胞生长的影响;用流式细胞术检测苦参碱对细胞周期的影响及不同浓度苦参碱引起细胞凋亡率的变化;倒置相差显微镜观察苦参碱干预后Siha细胞的形态学改变;同时用MDC染色后通过荧光显微镜鉴定自噬的发生;最后用实时定量RT-PCR检测促凋亡基因Bax和自噬相关基因Beclin 1的m RNA表达水平。结果:苦参碱能显著抑制Siha细胞增殖,作用呈现时间-剂量依赖性;诱导Siha细胞阻滞在细胞周期的G1期,并且随着剂量的增加,Siha细胞凋亡率明显增加(P0.05);倒置相差显微镜在苦参碱组观察到细胞质中可见大量的大小不等的空泡,而且随着苦参碱浓度的增加胞质中的空泡逐渐增大增多;MDC染色荧光显微镜检测可见苦参碱组比未处理组显示更强的荧光信号和更多的MDC标记颗粒;实时定量RT-PCR显示凋亡相关基因Bax和在自噬中起重要作用的Beclin 1基因在苦参碱组的表达均处于一个较高水平。结论:苦参碱可显著抑制宫颈癌Siha细胞的增殖,而且诱导细胞死亡时凋亡和自噬均被激活,自噬基因Beclinl参与了苦参碱诱导的自噬,而苦参碱的促凋亡机制可能与其促进凋亡分子Bax的表达相关。     

苦参素诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡的体内外实验研究

目的 探讨苦参素体内外诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡的作用及机制.方法 运用流式细胞术检测细胞凋亡率及凋亡相关基因蛋白Bel-2和Bax的表达水平;运用TUNEL法观察裸鼠皮下移植瘤细胞凋亡情况.结果 经体内外实验研究结果表明,苦参素能促进人胃癌MGC-803细胞凋亡,其细胞凋亡率与阴性对照组相比差异具有统计学意义(...     

芪玉三龙汤调节mTOR/Beclin1/LC3信号轴相关分子的表达诱导肺癌A549细胞自噬

目的 从细胞水平探讨芪玉三龙汤干预肺癌A549细胞对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/自噬关键分子酵母Atg6同系物（Beclin1）/微管相关蛋白1轻链3（LC3）信号轴关键分子表达的影响。方法 选择肺癌人A549细胞作为研究对象,采用细胞增殖检测试剂盒（CCK-8）法检测芪玉三龙汤含药血清对A549细胞活性的影响;原位末端标记法（TUNEL）,透射电镜（TEM）及实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）,蛋白免疫印迹法（WB）分别检测芪玉三龙汤对A549细胞凋亡、自噬体形成及自噬标记分子表达的影响。结果 芪玉三龙汤血清能以浓度依赖性的方式抑制细胞活性;与空白血清组比较,芪玉三龙汤血清组A549细胞的凋亡数量显著增多（P<0.01）,自噬体形成增加;与空白血清组比较,芪玉三龙汤血清组A549细胞的mTOR mRNA和蛋白表达显著降低（P<0.01）,Beclin1,自噬相关基因5（Atg5）,自噬相关基因13（Atg13） mRNA和蛋白表达水平均显著升高（P<0.01）。结论 芪玉三龙汤能够诱导肺癌A549细胞发生自噬,其具体作用机制可能与其下调mTOR的表达,上调Beclin1,Atg5,Atg13,LC3的表达,促进LC3Ⅰ转化为LC3Ⅱ有关。     

丹参酮ⅡA诱导体外胃癌细胞的自噬

目的探讨丹参酮ⅡA体外对人胃癌SGC7901细胞自噬的影响,初步探讨其抑制肿瘤的机制。方法 MTT法检测不同质量浓度(0.5、1、2和4μg/mL)丹参酮ⅡA作用体外培养的胃癌SGC7901细胞共孵24、48、72 h后,细胞增殖活力的改变;1、2和4μg/mL丹参酮ⅡA作用SGC7901细胞48 h后,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞自噬小体的水平;实时定量RT-PCR和Western blot分别测定自噬相关蛋白Beclin 1、磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)、LC3-Ⅱ和LC3-I的mRNA和蛋白的表达水平。结果 0.5μg/mL丹参酮ⅡA对胃癌SGC7901细胞没有明显的生长抑制作用,1μg/mL以上各质量浓度丹参酮ⅡA对胃癌SGC7901细胞则有明显的生长抑制作用;流式细胞分析结果显示,与对照组相比,丹参酮ⅡA诱导细胞凋亡(P<0.05);细胞内酸性自噬小体含量增加(P<0.05);实时定量RTPCR和Western blot结果显示,与对照组相比,Beclin-1、PTEN和LC3-ⅡmRNA和蛋白表达水平逐渐升高,LC3-I表达下降(P<0.05)。结论丹参酮ⅡA可诱导人胃癌SGC7901细胞自噬,其机制可能涉及上调自噬相关基因表达Beclin-1,促进自噬标志蛋白LC3-I向LC3-Ⅱ转化,促进自噬调控蛋白PTEN表达。     

熊果酸通过hedgehog信号通路调控结直肠癌细胞HCT116自噬的机制研究

研究旨在证明熊果酸通过抑制hedgehog信号通路激活结直肠癌HCT116细胞的自噬。采用MTT法测定熊果酸对HCT116细胞活力的影响;结晶紫染色和划痕试验分别检测熊果酸对HCT116细胞增殖和迁移的影响。针对自噬的研究,首先进行时间点的筛选,利用Cell Meter~(TM)Autophagy Assay Kit检测熊果酸作用于HCT116不同时间点的自噬荧光强度;Western blot法检测熊果酸作用于HCT116不同时间点的自噬蛋白P62的表达水平。然后利用Cell Meter~(TM)Autophagy Assay Kit检测不同剂量熊果酸对HCT116细胞自噬荧光强度的影响;Western blot法检测不同剂量熊果酸对HCT116细胞LC3Ⅱ和P62蛋白表达水平的影响。进一步采用AdPlus-mCherry-GFP-LC3B腺病毒转染检测熊果酸对HCT116细胞自噬流的影响;熊果酸与自噬抑制剂氯喹(CQ)联合利用Western blot法检测自噬蛋白LC3Ⅱ的表达水平。在机制方面,通过Western blot法检测熊果酸对HCT116细胞中hedgehog信号通路相关蛋白的影响。实验结果表明,熊果酸抑制HCT116细胞的活性、增殖和迁移;增强HCT116细胞自噬体的荧光强度,同时升高自噬标志蛋白LC3Ⅱ表达水平和抑制P62的表达水平,并且呈时间和剂量依赖性;熊果酸激活HCT116细胞自噬流,表现为熊果酸导致自噬荧光斑点聚集并增强自噬体的荧光强度,而且与单独使用熊果酸相比,联合使用自噬抑制剂CQ能提高LC3Ⅱ的表达水平;熊果酸降低hedgehog信号通路中PTCH1,GLI1,SMO,SHH,c-Myc的表达水平,提高Sufu的表达水平。总之,该研究表明熊果酸激活结直肠癌HCT116细胞自噬,其机制可能是通过抑制hedgehog信号通路活性。     

宣肺平喘胶囊基于p38磷酸化途径对COPD自噬影响研究

目的 探讨宣肺平喘胶囊是否通过抑制p38磷酸化而影响香烟烟雾提取物诱导的支气管上皮细胞自噬。方法 将支气管上皮细胞分为空白组、香烟烟雾提取物组、宣肺平喘低剂量组、宣肺平喘中剂量组、宣肺平喘高剂量组。以香烟烟雾提取物诱导支气管上皮细胞建立慢性阻塞性肺疾病(COPD)细胞模型,空白组以空白血清培养,宣肺平喘各组加入宣肺平喘含药血清培养。CCK-8法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫荧光显微镜观察自噬情况,Western blot法检测细胞中p38、p-p38、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白表达情况,RT-PCR法检测细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1 mRNA表达情况。结果 与空白组比较,香烟烟雾提取物组细胞活力均显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、自噬水平和p-p38、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白表达量及LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1 mRNA表达量均显著增高(P均<0.05);与香烟烟雾提取物组比较,宣肺平喘各组细胞活力均显著增加(P均<0.05),细胞凋亡率、自噬水平和p-p38、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ...     

没食子酸体外抗胃癌细胞MGC-803机制的研究

目的 探讨没食子酸(gallic acid,GA)体外对胃癌细胞株MGC-803的抑制作用及机制.方法 体外培养人胃癌细胞株MGC-803,MTT法观察细胞生长情况;Hoechst-33258、AnnexinV-FITC/PI检测细胞凋亡情况;RT-PCR方法研究Survivin的mRNA的变化.结果 MTT检测6.25～50μmol/LGA 抑制MGC-803的生长,并呈剂量依赖性.Hoechest-33258显示出明显的细胞凋亡形态.用Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡率有显著的剂量依赖性.同时RT-PCR反映了GA作用后,胃癌细胞中Survivin mRNA表达减少.结论 GA可抑制胃癌细胞MGC-803的增殖,其作用机制可能与下调相关凋亡基因Survivin有关.