低氧诱导因子-1α慢病毒载体的构建及其在骨髓基质干细胞内表达的检测

目的:构建低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的慢病毒载体(Lenti-HIF-1α),转染骨髓基质干细胞(bone marrowstromal cells,BMSCs)后,检测HIF-1α在BMSCs内的表达,并鉴定其位置。方法:根据人的HIF-1α基因(NM_001530)序列行引物设计及序列片段的PCR扩增,将目的基因PCR产物连接到载体pEGFP-N1上,构建真核表达载体pEGFP-N1-HIF-1α。将目的基因PCR产物和目的载体用NheI和BamHI分别进行酶切,对质粒进行鉴定。采用LR重组系统将目的序列重组到慢病毒载体plenti6.3V5-DEST上,构建慢病毒载体Lenti-HIF-1α(Lenti-LacZ为对照组)。检测慢病毒滴度后,转染BMSCs,检测目的基因的表达。通过细胞免疫组织化学法观察HIF-1α在BMSCs内的位置。结果:通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实真核表达载体pEGFP-N1-HIF-1α构建成功。用Lenti-HIF-1α转染BMSCs细胞,0、1、4、7、14和21 d后qPCR检测。结果表明HIF-1α在转染后的第4天开始有明显的过表达,且持续到第21天。细胞免疫组织化学结果显示目的基因位于BMSCs的核内。结论:成功构建了慢病毒载体Lenti-HIF-1α,且转染的目的基因位于BMSCs细胞核内,为HIF-1α介导的BMSCs进行体内实验研究奠定了基础。     

HDAC8过表达慢病毒载体构建、转染及表达的研究

目的:构建大鼠组蛋白去乙酰基转移酶(histone deacetylase 8,HDAC8)基因过表达的慢病毒载体,转染大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)后观察HDAC8的表达。方法:采用DNA重组技术将HDAC8基因插入到慢病毒表达载体质粒pGC-FU中,重组获得慢病毒载体pGC-FU-HDAC8。重组慢病毒载体经过测序鉴定后,转染293T细胞生产病毒液,用得到的病毒液转染大鼠BMSCs,实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法分析转染前后HDAC8表达情况。结果:测序结果证实HDAC8基因正确插入载体中,成功构建大鼠HDAC8基因过表达载体。大鼠BMSCs转染后HDAC8 mRNA及蛋白表达显著上调。结论:针对大鼠HDAC8基因过表达慢病毒载体构建成功,并能有效增强BMSCs中HDAC8基因的表达。     

两个慢病毒真核表达载体pEGFP-N1-HIF-1α和pEGFP-N1-muHIF-1α的构建及检测

目的 构建低氧诱导因子1 α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)基因(野生、点突变)的两个慢病毒真核表达载体pEGFP-N1-HIF-1α和pEGFP-N1-muHIF-1 α,以期为后续干细胞的基因转染提供适宜载体.方法 根据野生型人源HIF-1α基因序列信息和确定酶切位点的点突变型序列信息,设计引物,进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增、然后对目的基因PCR产物及目的载体进行酶切、最后用重组PCR方法将目的片段与目的载体连接的产物转化至DH-5α感受态细胞,挑选阳性克隆进行测序及序列比对,验证重组克隆中插入片段序列与设计的寡核苷酸(oligo)序列是否一致.结果 重组克隆的菌落PCR、重组克隆的酶切结果和质粒克隆测序结果均表明,克隆中插入片段序列与设计的oligo序列一致,HIF-1α基因(野生、点突变)的两个真核表达载体pEGFP-N1-HIF-1α和pEGFP-N1-muHIF-1α构建成功.结论 本项研究成功构建了HIF-1α基因pEGFP-N1-HIF-1α和pEGFP-N1-muHIF-1 α两个慢病毒真核表达载体,为转染骨髓间充质干细胞等后续实验奠定了基础.     

冻干对BMP-2基因重组慢病毒载体生物学效应的影响

目的:研究冻干对BMP-2重组慢病毒载体(Lenti-BMP-2)生物学效应的影响.方法:利用基因重组技术构建lenti-BMP-2.以感染复数(multiplicity of infection,MOI)10、25、50、100、200转染大鼠骨髓基质细胞(BMSCs),X-gal染色确定最佳MOI值.在适宜条件下,将lenti-BMP-2与10％海藻糖配比的冻干保护剂混合制成冻干剂型.采用MTS试剂盒观察冻干前、后lenti-BMP-2对BMSCs增殖的影响.应用ELISA法检测冻干lenti-BMP-2转染大鼠BMSCs后细胞中BMP-2蛋白的表达变化,实时定量PCR检测冻干对lenti-BMP-2转染BMSCs后成骨标志物Runx-2 、Coi1、OCN、OPN表达水平的影响.采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析.结果:X-gal染色显示,MOI为100 pfu/细胞时,转染效率趋于稳定,冻干前、后lenti-BMP-2对BMSCs增殖无显著影响(P＞0.05).ELISA法检测显示,利用冻干后的lenti-BMP-2转染BMSCs,可持续稳定地分泌BMP-2蛋白,冻干不会影响BMP-2蛋白的分泌活性.实时定量PCR检测结果显示,冻干前和冻干后组被转染的BMSCs细胞中,Runx-2、Coi1、OCN、OPN表达水平无显著差异,说明冻干不会影响BMP-2促进成骨标志物的表达(P＞0.05).结论:海藻糖冻干剂型的lenti-BMP-2能够长期保持lenti-BMP-2的高生物活性,是一种有效可靠的储存方法.     

点突变型HIF-1α诱导犬骨髓基质干细胞骨向分化的研究

目的:检测点突变型HIF-1α对犬骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells.BMSCs)骨向分化的作用.方法:采用LR重组系统构建慢病毒载体Lenti-WT(wild HIF-lα)、Lenti-MT(mutant HIF-1α)及对照组LentiLacZ.分别用Lenti-LacZ、Lenti-WT及Lenti-MT转染犬BMSCs,以LacZ组为对照,成功转染后,分别在0、1、4、7、14及21d提取总RNA和蛋白质,通过RT-PCR和Western印迹检测目的基因在体外常氧条件下对BMSCs成骨因子表达的调控.将带有目的基因的BMSCs按2×105/孔接种至6孔板,分别于14d和21d,运用茜素红染色(alizarin red-S staining,ARS)检测其钙结节的表达采用SPSS 10.0软件包对数据进行统计学分析.结果:当MOI=9时,BMSCs的转染效率达90％以上.目的基因转染后第4天,BMSCs的成骨因子在mRNA和蛋白水平表达显著提高,14～21 d时达到高峰,并维持在高表达状态(P＜0.05).ARS结果表明,目的基因在常氧条件下可诱导BMSCs向成骨方向分化.结论:体外常氧条件下,突变型HIF-1α能够稳定表达且保持高度活性,Lenti-MT可显著提高犬BMSCs的成骨活性.     

BMP-2对大鼠骨髓间充质干细胞成骨作用的影响

目的:携带骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)基因的慢病毒载体感染大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)后,观察BMP-2对BMSCs成骨作用的影响。方法:原代培养大鼠BMSCs并进行传代及鉴定,用携带BMP-2的慢病毒感染第3代BMSCs后,进行骨向诱导,通过茜素红染色观察钙沉积。观察细胞黏附能力及对成骨标志分子骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)、胶原蛋白Ⅰ(Col-Ⅰ)及smad(drosophila mothersagainst decapentaplegic protein)表达的影响。采用SPSS11.0软件包对数据进行统计学分析。结果:①原代培养出大鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定;②携带BMP-2和EGFP的慢病毒感染第3代BMSCs后,免疫荧光检测和RT-PCR及WB检测感染成功;③大鼠骨髓间充质干细胞感染慢病毒后进行骨向诱导,钙沉积明显增加;④BMSCs细胞黏附能力增强;⑤OPN、OCN、Col-Ⅰ及smad表达增加。结论:BMP-2通路增强了细胞黏附及相关成骨分化因子的表达,可明显促进大鼠...     

Satb2过表达慢病毒载体构建及其对骨髓基质细胞的转染及表达

目的：构建大鼠特殊富含AT序列结合蛋白2（special AT-rich binding protein 2,Satb2）基因过表达的慢病毒载体,转染大鼠骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）后观察Satb2的表达。方法：采用DNA重组技术将Satb2基因插入到含有绿色荧光蛋白（GFP）基因的慢病毒表达载体质粒GV208中,获得重组慢病毒载体GV208-Satb2。重组慢病毒载体经过测序鉴定后转染293T细胞生产病毒液,用得到的病毒液转染大鼠BMSCs,Western blot分析转染前后Satb2表达情况。结果：测序结果证实Satb2基因正确插入载体中,成功构建大鼠Satb2基因过表达载体。Western blot检测显示转染后Satb2蛋白表达显著上调。结论：针对大鼠Satb2基因过表达慢病毒载体构建成功,并能有效增强BMSCs中Satb2基因的表达。     

TGF-β1基因修饰BMSCs对I型胶原表达的影响

目的:通过对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)转染人TGF-β1基因,观察该基因对BMSCs表达I型胶原的影响。方法:采用脂质体介导法转染人TGF-β1基因至BMSCs,采用定量RT-PCR,免疫荧光分析等方法分析转基因后,BMSC表达I型胶原的变化。结果:重组质粒pCDNA3.1( )-TGF-β1成功转染至大鼠BMSCs,细胞免疫荧光和定量RT-PCR均证实了TGF-β1表达的增强。结论:转TGF-B1基因可以促使BMSCs合成I型胶原。     

骨髓基质细胞中Von Hippel-Lindau基因的siRNA表达载体构建及其检测

目的:构建骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells BMSCs)中Von Hippel-Lindau(VHL)基因的siRNA表达载体并检测其对BMSCs细胞中VHL基因的干扰作用.方法:根据犬的VHL基因序列设计并合成4对siRNA oligo,然后用载体构建试剂盒进行重组克隆,将4对双链的siRNA oligo分别插人到siRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中,构建4个siRNA表达质粒(SR144-1,SR144-2,SR144-3,SR144-4).用载体通用引物进行菌落PCR筛选,筛选得到的阳性克隆进行测序,以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的oligo序列一致.干扰载体瞬时转染BMSCs,通过qPCR和Westerm印迹分别检测干扰载体对目的基因的沉默效果.为了提高转染效率及VHL基因的沉默效果,对SR144-4进行慢病毒干扰载体(pLenti-mi-VHL)构建.结果:通过对构建质粒克隆进行测序,证实重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列一致.转染BMSCs细胞24h和48h后分别用qPCR与Western印迹检测,显示SR144-4干扰效果最理想.通过测序结果比对,插入序列完全正确.pLenti-mi-VHL构建成功.结论:成功构建了BMSCS的siRNA-VHL表达载体,为进一步实验研究奠定了基础.     

非病毒载体介导pBMP-2转染MC3T3-E1细胞的体外成骨分化研究

目的 :探讨非病毒载体Gen Escort TM II介导质粒骨形态发生蛋白2(p BMP-2)转染对MC3T3-E1细胞增殖和体外成骨分化的影响。方法:以非病毒载体Gen Escort TM II介导报告基因质粒增强型绿色荧光蛋白(p EGFP)转染MC3T3-E1细胞,优化转染条件,荧光显微镜和流式细胞仪评价转染效率。p BMP-2转染MC3T3-E1细胞后,MTT法检测细胞增殖情况,染色法检测碱性磷酸酶(ALP)和茜素红S(ARS)的表达,Real-time PCR分析成骨细胞标志基因ALP、骨涎蛋白(BSP)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)的表达。结果 :Gen Escort TM II介导p EGFP转染MC3T3-E1细胞后,转染效率达35.02±4.42,MTT结果示基因转染对细胞增殖无影响(P>0.05)。p BMP-2转染组的ALP、ARS表达较p EGFP转染组和未转染组显著,同时Real-time PCR检测结果示,转染后6 d,p EGFP转染组和未转染组相比,p BMP-2转染组的成骨基因ALP、BSP、Runx2、OCN、OPN的表达量差异有显著性意义(P<0.05)。结论:非病毒载体Gen Escort TM II介导BMP-2转染MC3T3-E1细胞可诱导其向成骨方向分化。     

天然衍生脱细胞牛心包复合BMP-2转染的BMSCs引导骨组织再生的体外实验研究

目的: 研究天然衍生脱细胞牛心包复合BMP-2转染BMSCs引导骨组织再生的可行性和有效性。方法: 天然衍生脱细胞牛心包体外复合BMP-2转染BMSCs,SEM评估细胞生长与增殖,MTT法检测牛心包对转染细胞的毒性,ELISA 检测BMP-2含量,结晶紫染色法测定BMSCs细胞粘附能力,ALP活性实验检测转染BMSCs成骨性能。结果: SEM发现天然衍生脱细胞牛心包复合BMP-2基因转染的BMSCs后,细胞生长并增殖良好;各组细胞的存活率没有显著性差异;天然衍生脱细胞牛心包增强了BMP-2转染BMSCs的细胞粘附能力和成骨细胞转化能力。结论: 天然衍生脱细胞牛心包复合BMP-2基因转染BMSCs后,具有良好的生物和细胞相容性,有望成为一种优良的天然GBR膜材料。     

BMP-9/EPO双基因共转染ADSCs复合nHAC/PLA支架修复兔下颌骨缺损的实验研究

目的：探讨腺病毒介导BMP-9/EPO双基因共转染脂肪干细胞（ADSCs）复合nHAC/PLA支架材料促进体内成骨的可行性。方法：分离培养兔ADSCs,利用重组腺病毒构建携带BMP-9、EPO、BMP-9/EPO基因的表达载体,并转染至兔ADSCs。14 d后,在荧光显微镜下观察各组细胞荧光表达情况,计算病毒转染效率,采用Western免疫印迹检测各组细胞 BMP-9及EPO蛋白的表达。50只大白兔随机分为5组,A组为空白组,B组为单纯材料组,C组为BMP-9/nHAC/PLA组,D组为EPO/nHAC/PLA组,E组为BMP-9/EPO/nHAC/PLA组。制备兔双侧下颌骨缺损模型,按照实验分组,将转染组细胞分别与nHAC/PLA支架复合培养后植入兔下颌骨缺损处,于4、8、12周在缺损处取材进行影像学、组织学检测及扫描电镜观察,比较各组动物下颌骨缺损修复情况。采用 SPSS17.0软件包对结果进行统计学分析。结果：荧光显微镜下观察,BMP-9、EPO及BMP-9/EPO重组腺病毒均能稳定转染 ADSCs,转染效率为 80%～93%。转染后,BMP-9、EPO及BMP-9/EPO基因和蛋白均能稳定表达。转染后的ADSCs与nHAC/PLA支架复合,其骨缺损区修复情况优于对照组,且BMP-9/EPO/nHAC/PLA组成骨情况优于其他各组。扫描电镜下见转染组骨缺损与材料结合修复情况优于对照组,BMP-9/EPO/nHAC/PLA组修复最明显。结论：BMP-9、EPO均可转染ADSCs并稳定表达。与nHAC/PLA支架材料复合后,可显著促进下颌骨缺损的修复,为骨组织修复工程提供了新的选择。     

不同来源间充质干细胞成骨分化时序性过程的比较研究

目的:比较骨髓间充质干细胞(BMSCs)和脂肪间充质干细胞(ADSCs)成骨分化时序性特点及其潜能的差异. 方法:分离提取同一SD大鼠的BMSCs和ADSCs两种细胞进行培养,通过免疫荧光染色和Von Kossa染色分别观察两种细胞经成骨诱导培养后的成骨分化蛋白I型胶原(Col1α1)的分泌和矿化结节沉积. 利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR) 方法检测两种细胞成骨分化相关基因的表达情况. 结果: 免疫荧光染色结果显示第7 d时ADSCs的Col1α1表达强度较BMSCs弱,但在14 d和21 d时两者差异并不明显.Von Kossa染色显示21 d时两者均呈现出较好的矿化能力. RT-qPCR结果显示ADSCs成骨相关基因表达水平在早中期(7、14 d)低于BMSCs(P <0.05),而在晚期(21、28 d)无显著性差异(P>0.05).结论:ADSCs在早期成骨分化水平低于BMSCs,但在晚期接近BMSCs,显示出良好的成骨分化潜能,在骨组织工程中将有广泛的应用前景.     

生长分化因子15基因过表达慢病毒载体的构建

目的 构建生长分化因子15（growth differentiation factor 15,GDF15）基因过表达慢病毒载体。 方法 根据GDF15 mRNA的基因序列,合成GDF15基因,构建至过表达载体并转化至感受态细胞,再进行测序验证。重组慢病毒载体经过测序鉴定后,转染293T细胞,包装生产慢病毒。用慢病毒转染293T细胞,再用Western blot检测GDF15的表达情况。 结果 测序结果证实GDF15 基因正确插入载体中。慢病毒转染293T细胞后,GDF15基因在蛋白质水平上表达显著增加。 结论 GDF15基因过表达慢病毒载体构建成功,并有效增强GDF15基因在293T细胞中的表达。     

TGF-β1基因修饰BMSCs对Ⅰ型胶原表达的影响

目的：通过对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）转染人TGF-β1基因,观察该基因对BMSCs表达Ⅰ型胶原的影响。方法：采用脂质体介导法转染人TGF-β1基因至BMSCs,采用定量RT—PCR,免疫荧光分析等方法分析转基因后,BMSC表达Ⅰ型胶原的变化。结果：重组质粒pCDNA3．1（＋）-TGF-β1成功转染至大鼠BMSCs,细胞免疫荧光和定量RT—PCR均证实了TGF-β1表达的增强。结论：转TGF-B1基因可以促使BMSCs合成Ⅰ型胶原。     

bFGF重组慢病毒对羊骨髓间充质干细胞成骨功能影响的研究

目的:探讨碱性成纤维生长因子(basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)基因转染对体外培养的骨髓间充质干细胞(Bone Marrow mesenchymal Stem Cells, BMSCs)的增殖和骨向分化的影响,为构建组织工程骨的种子细胞做理论依据。方法:构建携带人bFGF基因的慢病毒载体,转染诱导后羊的BMSCs,得到bFGF转染组,选择未转染的BMSCs为对照组。两组细胞采用实时定量PCR技术和蛋白质印迹法技术检测Collagen-Ⅰ、OC、OPN等成骨相关基因的mRNA水平及蛋白水平相对表达量的变化情况。结果:bFGF组OPN和Collagen-Ⅰ基因mRNA水平表达量较对照组增高,差异有统计学意义(P<0.05),两组细胞在OC基因mRNA水平表达量上差异无统计学意义;bFGF组细胞在OPN、OC和Collagen-Ⅰ基因蛋白水平上表达量均高于对照组,且差异有统计学意义。结论:bFGF基因转染能增强羊BMSCs增殖和骨向分化的能力,可作为组织工程骨的种子细胞。     

HIF-1α促进BMSCs成骨及成血管作用的体内外研究

目的:运用基因工程技术,检测HIF-1α基因诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)在体内、外向成血管和成骨方向分化的作用.方法:(1) HIF-1α基因突变后,应用Lentivirus构建Lenti-LacZ、Lenti-WT、Lenti-MT.(2)分别用Lenti-LacZ、Lenti-WT及Lenti-MT转染BMSCs,检测①细胞转染效率;②目的基因在mRNA及蛋白水平的表达;③目的基因在BMSCs细胞内的定位.(3) BMSCs成功转染目的基因后,分别在特定时间点提取总RNA和蛋白,通过RT-PCR和Western印迹检测目的基因对BMSCs成血管和成骨因子表达的调控作用.(4)行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和钙结节的表达检测.(5)检测生物支架材料-明胶海绵(GS)的结构、形态及细胞附着情况.(6)建立F344大鼠颅骨双侧直径5mm的标准骨缺损模型,分别将细胞复合支架材料植入骨缺损区.术后8周取材,行Microfil灌注,观察血管形成,通过大体标本观察、X线及Micro-CT检查、组织学和形态学检测等观察骨修复情况,采用SPSS10.0软件包对结果进行单因素方差分析,评价修复效果.结果:当感染复数(MOI)=15时,BMSCs的转染效率最高.免疫荧光检测表明,目的基因在BMSCs细胞核内.体外常氧条件下,HIF-1α能够显著上调BMSCs的成骨和成血管因子的表达,且ALP和钙结节结果表明目的基因可诱导BMSCs骨向分化.体内实验结果显示,8周时,Lenti-WT组和Lenti-MT组对骨缺损的修复作用明显强于Lenti-LacZ组,而Lenti-MT组又优于Lenti-WT组.结论:HIF-1α基因可以显著提高BMSCs成血管和成骨活性.     

激光共聚焦显微镜观测体内回植的GFP标记的3D打印组织工程颌骨

目的:激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protins,GFP)标记的3D打印组织工程颌骨回植后体内移植情况,为筛选组织工程颌骨并为其后续功能研究提供技术基础。方法:采用羊椎骨煅烧制备陶瓷化骨粉,结合聚乙烯醇制备组织工程颌骨支架,复合GFP慢病毒转染的羊骨髓间充质干细胞(Bone Marrow mesenchymal Stem Cells, BMSCs),回植羊颌骨缺损动物模型,使用激光共聚焦显微镜观察不同时间点其体内分布及存活情况。结果:GFP慢病毒转染的BMSCs,流式细胞仪检测转染率为95.4%,基因测序结果与GFP基因一致。回植后使用激光共聚焦显微镜三维立体成像技术观察到GFP标记的BMSCs在组织工程骨支架上存活3个月以上。结论:激光共聚焦显微镜三维重建技术可很好地观察GFP标记的3D打印组织工程颌骨支架上的细胞移植情况,为组织工程骨的动物实验研究提供了很好的观察方法。     

组蛋白去乙酰化酶8对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的：探讨组蛋白去乙酰化酶8（histone deacetylase 8,HDAC8）对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）成骨分化的影响。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠 BMSCs,转染 HDAC8过表达慢病毒载体,并于矿化诱导液中培养7 d后,实时荧光定量PCR、Western blot检测BMSCs成骨分化能力的变化;矿化诱导14 d后,茜素红钙结节染色检测BMSCs矿化能力的变化。组蛋白去乙酰化酶抑制剂---曲古抑菌素A（trichostatin A,TSA）刺激转染HDAC8过表达慢病毒载体的 BMSCs,于矿化诱导液中培养7 d后,实时荧光定量 PCR及 Western blot检测 TSA刺激前后过表达 HDAC8的BMSCs成骨分化能力的变化。结果：HDAC8过表达组经矿化诱导7 d 后,成骨分化相关基因 mRNA、蛋白表达水平均低于空白对照组;经14 d矿化诱导后,HDAC8过表达组茜素红钙结节的着色程度及范围低于空白对照组。TSA 刺激的 HDAC8过表达组矿化诱导7 d后,成骨分化相关基因 mRNA及蛋白的表达均高于未加刺激组（P＜0．05）。结论：HDAC8对大鼠 BMSCs成骨分化具有抑制作用。     

BMP-2、bFGF基因转染的大鼠骨髓干细胞与牙胚细胞在体外混合培养对成牙基因的影响

目的:观察骨形态发生蛋白-2和(或)碱性成纤维细胞生长因子转染的大鼠骨髓干细胞(BMSCs)和牙胚细胞在体外混合培养对牙本质基质蛋白1、成釉蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、同源异型盒基因1的影响。方法:采用实时定量PCR和Western blot的方法,检测 BMP-2和(或)bFGF对成牙基因的影响。结果:对照组、bFGF组、BMP-2组、bFGF/BMP-2组四组间,AMBN、COLLAGEN-Ⅰ、DLX1、DMP1基因在mRNA和蛋白水平表达量上存在明显差异(P<0.05)。结论:BMP2和bFGF有一定的协同交互作用,BMP2/bFGF/BMSCs/牙胚细胞可以作为构建组织工程牙的种子细胞。