hTERT启动子调控的野生型p53基因对膀胱癌细胞的靶向性抑制作用

目的:探讨人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的野生型p53基因的靶向性表达,观察对人膀胱癌细胞株T24的选择性杀伤效应及细胞凋亡的影响。方法:采用脂质体转染法,将构建的含hTERT启动子调控表达人野生型p53基因和报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒,分别转染膀胱癌细胞株T24和正常人胎肺成纤维细胞,应用荧光显微镜、电镜、台盼蓝拒染法及流式细胞仪等方法,观察基因的靶向性表达及对膀胱癌细胞株T24细胞形态学、生长抑制曲线及细胞周期变化的影响。结果:转染hTERT启动子调控的目的基因可在端粒酶阳性的膀胱肿瘤细胞中靶向性表达发出绿色荧光。靶向转染野生型p53基因能抑制膀胱癌细胞生长,72h后细胞生长抑制率分别为48.5%、高于常规培养组3.6%和阴性对照组2.5%,差异有显著性意义(P<0.05)。电镜可见典型的凋亡细胞。细胞周期分析G0和G1期细胞比例明显增高,并出现凋亡峰。结论:构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因能通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥靶向性抑制膀胱癌细胞生长作用。     

染色质重构复合体蛋白PBRM1对膀胱癌细胞生物学功能的影响

目的探讨染色质重构复合体蛋白PBRM1对膀胱癌细胞株EJ、T24细胞生物学功能的影响。方法针对PBRM1 mRNA序列设计合成siRNA,转染膀胱癌细胞,沉默PBRM1基因后进行如下检测：RT-PCR法检测PBRM1 mRNA表达变化及凋亡、迁移相关指标;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western印迹法检测凋亡蛋白Caspase3表达水平;划痕实验及Matrigel实验检测细胞迁移及侵袭能力变化。结果 PBRM1siRNA能有效抑制膀胱癌细胞中PBRM1的表达。PBRM1基因沉默后,与空白对照组相比,细胞增殖能力显著增强,同时细胞凋亡减少,细胞迁移及侵袭能力明显减弱。凋亡及迁移相关基因mRNA水平及蛋白水平也出现相应变化。结论 PBRM1对膀胱癌细胞株EJ、T24生物学功能有重要影响,可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡、迁移及侵袭。     

siRNA沉默膀胱癌肝素酶基因对T24细胞增殖及MMP-2表达的影响

目的研究siRNA干扰沉默膀胱癌肝素酶基因对T24细胞增殖及MMP-2表达的影响 方法体外化学合成肝素酶特异性小干扰RNA（siRNA），用脂质体2000转染至T24膀胱移行细胞癌细胞内，常规分为正常对照组、空白对照组、阴性对照组和转染实验组进行实验，用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖情况，反转录聚合酶链法（RT-PCR）检测肝素酶基因的表达，免疫细胞化学方法检测MMP 2的表达。结果RNA干扰沉默T24膀胱移行细胞癌细胞肝素酶基因后，T24细胞增殖活力下降，三个不同干扰组细胞活力分别下降了(28.55±3.66)%、(27.20±3.25)%和(37.29±4.82)%。肝素酶mRNA表达下降，膀胱移行细胞癌细胞中MMP-2（明胶酶A）的表达亦明显下降（P均＜0.05）。结论RNA干扰肝素酶基因后，细胞活力及肝素酶mRNA表达水平下降并且明显抑制膀胱癌细胞中MMP-2的表达。     

膀胱癌组织中X-染色体连接的凋亡抑制蛋白表达及其对化疗敏感性的影响

为探讨X-染色体连接的凋亡抑制蛋白（XIAP）在膀胱癌组织中的表达及其对化疗敏感性的影响。采用免疫组织化学方法检测6例正常膀胱黏膜上皮组织、47例膀胱移行细胞癌组织中XIAP的表达。脂质体方法介导XIAP基因转染膀胱癌T24细胞，通过G418进行稳定筛选。逆转录聚合酶链反应检测转染前后T24细胞内XIAP的表达。分别采用0．005mg／ml、0．05mg／ml低剂量丝裂霉素诱导凋亡启动，MTT比色分析检测癌细胞生长活性，3’末端脱氧核苷酰转移酶介导生物素标记法检测细胞凋亡率。发现膀胱组织中XIAP呈中度阳性表达，阳性率78．7％，其阳性率与肿瘤分级和分期无关（P＜0．05）。     

Skp2基因沉默对 SPC-A-1肺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨 S 期激酶相关蛋白2（Skp2）基因沉默对肺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法将 Skp2 RNA 干扰表达载体转染至 SPC-A-1肺癌细胞中,G418筛选获得阳性克隆细胞。通过实时荧光定量（RT-PCR）、蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肺癌细胞中 Skp2的表达。采用流式细胞术、四甲基偶氮唑盐（M TT ）法检测各组肺癌细胞生长、凋亡情况。结果转染 Skp2 shRNA 表达载体的肺癌细胞中 Skp2蛋白表达量明显减少,抑制效率分别可达75．3±5．1,70．4±3．2;转染 Skp2 shRNA 表达载体的肺癌细胞生长减慢,阻滞于 G1期的增多,S 期细胞减少。 Skp2 shRNA 转染质粒组凋亡率较阴性对照组明显增加,细胞凋亡率分别为（17．5±2．8）％、（15．6±3．1）％。结论通过特异性沉默 Skp2基因的表达,可有效降低肺癌细胞中 Skp2蛋白表达水平,抑制肺癌细胞生长及增加细胞凋亡。     

hTERT启动子调控的p53基因膀胱癌细胞靶向性表达载体构建及意义

目的:构建人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的含有治疗基因的质粒,探讨在膀胱癌细胞株中特异性靶向转录表达及其潜在的临床意义。方法:将hTERT起始转录区上游的启动子序列克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)基因及含野生型p53基因的质粒上,分别构建成质粒phTERT-GFP及phTERT-p53。脂质体转染法瞬时转染膀胱癌细胞株T24,应用荧光显微镜、噻唑蓝(MTT)法等方法观察在转染细胞中的差异性表达及膀胱癌细胞生长的靶向性抑制作用。结果:在端粒酶阳性的膀胱细胞中观察到hTERT启动子调控的绿色荧光蛋白的靶向性稳定表达,转染hTERT启动子调控的野生型p53基因靶向性抑制膀胱癌细胞生长,但对端粒酶阴性的正常细胞无明显影响(P<0.05)。结论:成功构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因和GFP基因可在膀胱癌细胞T24中靶向性表达,hTERT启动子调控表达p53基因可靶向性抑制膀胱癌细胞生长。     

CXCR4基因158沉默对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡及迁移能力的影响

目的 探讨CXCR4基因沉默后对人膀胱癌T24细胞增殖、凋亡、迁移能力的影响。 方法 将T24细胞分为3组,即干扰组、阴性对照组和空白对照组。采用阳离子脂质体转染试剂Lipofectamine 2000将靶向沉默CXCR4基因的小干扰RNA(siRNA)序列转染至膀胱癌T24细胞株中,Western-blot检测转染后T24细胞中CXCR4蛋白的表达水平,MTT比色法检测细胞凋亡,Transwell迁移试验观察T24细胞迁移能力。 结果 转染siRNA后,CXCR4蛋白表达量明显下调(P<0.05),与空白对照组及阴性对照组的T24细胞比较,沉默CXCR4基因后,显著抑制膀胱癌T24细胞的增殖活性(均为P<0.05),促进T24细胞凋亡(均为P<0.05); Transwell实验结果提示,RNAi干扰CXCR4表达后能显著抑制膀胱癌T24细胞的迁移能力(P<0.05)。 结论 RNAi干扰CXCR4表达水平能够抑制T24细胞增殖、促进细胞凋亡及降低细胞的迁移能力,推测CXCR4基因可能是膀胱肿瘤细胞增殖及迁移的重要调控因子之一。     

KISS-7基因与膀胱癌转移的相关性及其稳定表达对细胞侵袭能力影响

目的 探讨KISS-1基因与膀胱癌转移的相关性,及其稳定表达对膀胱癌细胞细胞侵袭能力的影响.方法 应用荧光定量PCR方法检测原发未转移膀胱癌和原发伴转移膀胱癌组织中KISS-1 mRNA的表达.构建真核表达载体pIRES2-KISS1,转染膀胱癌T24细胞系并筛选单克隆稳定转染细胞株,检测转染前后细胞的侵袭能力变化.结果 原发伴转移膀胱癌组织中的KISS-1 mRNA表达较原发未转移膀胱癌中明显下降,具有统计学差异(P＜0.05).单克隆稳定转染细胞系中KISS-1蛋白明显增加,细胞侵袭能力也随之明显降低(P＜0.05).结论 KISS-1基因与膀胱癌的转移相关,其表达增高能够抑制T24细胞的侵袭能力.     

SOX6在膀胱癌发生发展中的作用及相关机制

目的:研究SOX6在膀胱癌中的表达特征,并探讨其在膀胱癌中发挥的生物学效应及相关机制。方法:利用免疫组化检测膀胱癌组织和癌旁组织中的SOX6的表达,蛋白印记（Western blot）及荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测SOX6在膀胱癌细胞（T24、BIU-87、EJ、5637）和正常膀胱上皮细胞（SV-HUC-1）中表达情况。通过SOX6高表达质粒和空载质粒分别转染膀胱癌细胞（EJ、5637）,使用Transwell方法检测两组细胞的侵袭能力,采用划痕实验检测迁移能力,Western blot法检测E-cadherin和Vimentin的表达,使用CCK-8实验检测两组细胞的增殖能力,流式细胞术检测凋亡情况,并研究对膀胱癌细胞的蛋白酶体活性的影响。结果:与癌旁组织和正常膀胱上皮细胞相比,膀胱癌组织和细胞中SOX6的表达显著下降,在细胞EJ和5637尤其明显。与对照组对比,转染SOX6高表达质粒的EJ 和5637膀胱癌细胞的迁移、侵袭、增殖能力减弱,凋亡增加,上皮间质转化能力减弱,同时蛋白酶体活性显著降低。结论:SOX6在膀胱癌中作为抑癌基因发生作用,通过降低蛋白酶体活性来抑制膀胱癌的发展。     

蜂毒多肽对人膀胱癌T24细胞增殖的抑制作用

目的探讨蜂毒多肽对人膀胱癌T24细胞的增殖及细胞周期的影响。方法以浓度为0.1、1.0、10.0、100.0μg/ml的蜂毒多肽作用于体外培养的人膀胱癌T24细胞,应用四甲基偶氮唑盐（MTT）的培养增殖抑制作用,用流式细胞仪检测蜂毒多肽对细胞增殖核抗原（PCNA）表达及对该细胞周期的影响。结果蜂毒多肽能够在体外抑制人膀胱癌T24细胞的增殖活性;抑制PCNA的表达,呈剂量依赖性,各浓度组PCNA量均较对照组降低（P〈0.05或P〈0.01）;干扰细胞周期,各浓度组G0/G1期均低于对照组（P〈0.05或P〈0.01）,S期高于对照组（P〈0.05或P〈0.01）,浓度10.0μg/ml和100.0μg/ml组G2/M期均高于对照组（P〈0.01）。结论蜂毒多肽可抑制膀胱癌T24细胞的增殖,其作用机制可能与PCNA的表达抑制及细胞周期受到干扰有关。     

AK4对肝内胆管癌细胞HUCCT1增殖、迁移的影响

  目的  探究AK4对肝内胆管癌细胞HUCCT1增殖、迁移能力的影响。  方法  采用小干扰RNA（siRNA）技术靶向沉默肝内胆管癌细胞HUCCT1中AK4的表达,采用免疫印迹法检测沉默效果以及筛选siRNA-AK4,通过EdU实验和细胞划痕实验检测该胆管癌细胞增殖、迁移能力。  结果  通过免疫印迹法检测出siRNA-AK4-3沉默效果最好,EdU实验显示沉默AK4后,细胞增殖能力下降（P < 0.05）,细胞划痕实验显示沉默AK4后,细胞迁移能力下降（P < 0.01）。  结论  沉默肝内胆管癌细胞HUCCT1中AK4的表达后,其增殖、迁移能力受到抑制。     

miR-34a在低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

【目的】观察miR-34a在低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用并探讨其可能的机制。【方法】原代分离和培养大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC）,并给予3%低氧处理后,用Real-time PCR法检测miR-34a和Notch1mRNA在大鼠PASMC中的表达;低氧条件下用细胞转染法过表达和抑制miR-34a、沉默Notch1基因的表达后用EDU法观察细胞增殖情况,并用Real-time PCR和Western blot法检测细胞核增殖抗原PCNA的表达。【结果】分离和培养大鼠PASMC并给予3%低氧处理后,大鼠PASMC中miR-34a表达明显降低,且低氧48h降低较明显,组间差异有统计学意义（P<0.05）。而Notch1的表达明显增高,且48h增高较明显,组间差异有统计学意义（P<0.05）。此外,过表达miR-34a和沉默Notch1后会显著抑制低氧引起的细胞增殖,抑制miR-34a的表达后则会促进细胞增殖,且组间差异有统计学意义（P<0.05）。【结论】在低氧诱导的PASMC细胞增殖过程中miR-34a参与了PASMC的增殖过程,且可能是通过上调Notch1引起了细胞增殖。     

EGCG抑制结肠癌HT-29细胞生长及血管生成的作用机制

目的   探讨表没食子儿茶素没食子酸酯( EGCG )对人结肠癌细胞HT-29生长的影响及抑制血管生成的相关机制。方法   EGCG（0、25、50、100μg /mL）作用于结肠癌细胞株HT-29 24h后, 采用MTT法检测EGCG对HT-29细胞生长的作用,应用RT-PCR及Western blot分别检测EGCG干预前后HT-29结肠癌细胞中TGFβ1、 15-PGDH、COX-2、VEGFmRNA及蛋白的表达情况。结果   MTT显示EGCG抑制HT-29细胞的生长,并随着浓度的增加及时间的延长抑制作用逐渐增强（P＜0.05）; TGF-β1、15-PGDH mRNA及蛋白表达量随着EGCG 浓度的增加而增加,COX-2、VEGF mRNA及蛋白表达量随着EGCG 浓度的增加而下降(P<0.05) 。结论   EGCG呈浓度及时间依赖性抑制HT-29细胞的增殖,可能通过诱导HT-29细胞中TGF-β1、15-PGDH, 抑制COX-2、VEGF mRNA及蛋白表达预防结肠癌的血管生成。     

shRNA沉默Bmi-1质粒构建及对鳞癌细胞ECA109增殖的影响

目的 研究shRNA沉默Bmi-1基因对鳞癌细胞ECA109增殖变化的影响,探讨Bmi-1基因在鳞癌细胞增殖中的作用。方法 采用RT-PCR和Western blot法分别检测Bmi-1在Fibroblast细胞、Hacat细胞、A431细胞、ECA109细胞中的表达。构建重组质粒GPU6/GFP/Neo-shBmi-1,脂质体转染ECA109细胞后,检测细胞中Bmi-1表达变化。MTT法检测转染前后细胞抑制率,流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化。结果 与Fibroblast细胞和Hacat细胞相比,Bmi-1在鳞癌细胞系A431、ECA109中含量明显升高。重组载体GPU6/GFP/Neo-shBmi-1构建成功,转染ECA109细胞后Bmi-1表达明显降低(P＜0.05)。与对照组相比,转染后细胞增殖明显受到抑制(P＜0.05);G1期细胞明显增加(P＜0.05),S期细胞明显减少(P＜0.05)。结论 Bmi-1与细胞恶性增殖相关。在ECA109细胞中沉默Bmi-1,可改变细胞周期,从而抑制细胞增殖。     

转染反义寡核苷酸对人胆管癌QBC939细胞XIAP基因表达及细胞周期作用的实验研究

目的研究转染反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASODN）对人胆管癌细胞株QBC939细胞凋亡抑制蛋白基因（X-linked inhibitor of apoptosisprotein,XIAP）表达的抑制作用及对细胞周期凋亡的影响．方法脂质体介导ASODN瞬时转染QBC939细胞,荧光显微镜观察ASODN转染入细胞的情况,并计算转染率;RT—PCR检测转染前后XIAPmRNA表达的变化;流式细胞仪检测转染后细胞周期的变化和凋亡率．结果转染后24h可达到最佳的转染效果;ASODN组的XIAP基因水平明显低于对照组（P〈0．05）,流式结果显示转染后QBC939G0／G1期细胞高于阴性对照组,凋亡率高于对照组（P〈0．05）．结论脂质体介导转染ASODN能特异性地抑制QBC939细胞中的XIAP基因表达,使其发生G0／G1期阻滞,并诱导胆管癌细胞凋亡,有望成为胆管癌基因治疗新的靶点．     

miR-21负向调控宫颈癌HeLa细胞株中hTERT的表达

  目的  通过观察在miR-21作用下hTERT的表达情况，探讨在宫颈癌HeLa细胞中miR-21对hTERT的调控作用。  方法  利用RT-PCR 法及West Blot 法分别检测HeLa中miR-21 的表达，以及hTERT蛋白的表达情况；通过实验设计，生成miR-21模拟物和 miR-21抑制剂，并分别设立两组的空白对照序列；将空转liposome2000 （lipo2000）设为对照组，利用脂质体 liposome2000包裹宫颈癌细胞株 HeLa并予以转染。在转染后24 h及时检测hTERT及蛋白的表达量。  结果  HeLa细胞株中miR-21及hTERT表达阳性；转染后24 h模拟物组、模拟物对照组、抑制剂组、抑制剂对照组、脂质体组 hTERT mRNA相对表达水平分别为（0.51±0.33）、（0.69±0.19）、（1.33±0.39）、（0.83±0.26）和（0.58±0.16）；蛋白相对表达水平分别为（0.41±0.18）、（0.62±0.18）、（1.45±0.60）、（0.83±0.15）和（0.82±0.30）；模拟物组与其对照组及脂质体组相比较，hTERT mRNA及蛋白表达情况均较低且差异有统计学意义（P < 0.05）；相反，在抑制剂组与其对照组及脂质体组相比较中，hTERT mRNA及蛋白表达情况明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。  结论  通过检测发现miR-21及hTERT基因在HeLa细胞株中均呈现高表达状态；miR- 21可以调节hTERT mRNA 和蛋白表达水平，从而发挥负向调控hTERT的作用。     

miR-143在膀胱癌组织中的表达及意义

【目的】探讨miR-143在膀胱癌组织中的作用及机制,为膀胱癌的临床诊治提供参考。【方法】选用体外培养的T24细胞株作为研究对象,按照处理方式分为si-COX-2转染组、miRNA-143转染组、阴性对照组、空白对照组。Transwell趋化实验和3 H-thymidine 法检测 T24细胞增殖和迁移能力,免疫印迹法检测COX-2蛋白表达变化。【结果】miR-143和si-COX-2转染T24细胞48～72 h后,细胞增殖能力较正常T24细胞相比下降36％～49％（ P ＜0．01）,迁移能力下降81％。免疫印迹结果表明,si-COX-2或miR-143转染的T24细胞内源性COX-2表达水平显著减少至正常T24细胞表达水平的0．39和0．31倍（ P＜0．01）。【结论】miR-143可能通过COX-2通路发挥对膀胱癌 T24细胞的增殖和侵袭的抑制作用并抑制COX-2的表达。提示miR-143可作为膀胱癌的治疗候选药物。