TGF-β1诱导CD4+CD25-T细胞分化为CD4+CD25+调节性T细胞

目的 研究TGF-β1诱导CD4 CD25 调节性T细胞分化的能力及其相关机理.方法 ①利用丝裂霉素处理的Balb/C裸鼠脾细胞(同种抗原)刺激C57BL/6小鼠T细胞,同时给予TGF-β1予以干预(按TGF-β1剂量不同设立4组:对照组,低浓度组,中浓度组和高浓度组),共同培养5天后,用流式细胞仪检测CD4 CD25 T细胞比例;同时用RT-PCR检测培养细胞中Foxp3的表达水平.②在第一部分实验基础上,通过MACS分离获取C57BL/6小鼠CD4 CD25-T细胞,用同种抗原刺激后,给予TGF-β1干预,培养5 d后分离CD4 CD25 T细胞,利用混合淋巴细胞培养系统检测其抑制淋巴细胞增殖的能力.结果 T细胞经同种抗原刺激后,在中、高浓度TGF-β1诱导下CD4 CD25 T细胞比例均明显升高,Foxp3的表达水平也相应增加,与对照组相比有显著性差异(P＜0.05).TGF-β1可直接诱导CD4 CD25-T细胞转化为CD4 CD25 T细胞,转化后的CD4 CD25 T细胞可有效抑制淋巴细胞增殖.结论 TGF-β1可诱导CD4 CD25-T细胞转化为CD4 CD25 Treg,促进其表达Foxp3,并能够抑制淋巴细胞增殖.     

妊娠浓度雌、孕激素对小鼠H-Y皮肤移植物存活的影响及机制研究

目的:探讨妊娠浓度雌激素(E2)、孕激素(P4)对小鼠H-Y皮肤移植的影响及其机制。方法:建立小鼠去势模型,每天分别注射E2、P4及E2+P4联合注射,14 d后受鼠行H-Y皮肤移植并继续给药。检测移植前及移植后72 h外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)变化及外周血细胞因子水平;观察H-Y皮肤移植物的存活情况。结果:E2可提高外周血Treg的比例(P0.05),移植后Treg的比例进一步升高(P0.05);P4对Treg没有显著影响(P0.05),而E2+P4联合对Treg的影响与单独应用E2结果相似(P0.05)。移植后P4对Treg仍无明显影响(P0.05),而E2+P4联合亦不能进一步提高Treg的比例。细胞因子检测显示,E2、P4均能减少促炎因子分泌,并提高抗炎因子分泌(P0.05)。两者均能有效延长H-Y皮肤移植物存活(P0.05),且具有协同效应。结论:P4可通过诱导免疫偏移促进H-Y皮肤移植物的存活。而E2除诱导免疫偏移外,还通过提高Treg水平而延长移植物的存活时间。     

TGF-β1调控卵巢癌微环境中CD8~+Treg的表型及功能初探

目的初步探讨TGF-β1在卵巢癌微环境中对CD8+Treg诱导过程的作用。方法建立卵巢癌细胞系SKOV3与健康人外周血CD8+T细胞体外Transwell共培养系统,实验组为SKOV3与健康人外周血CD8+T细胞共培养组,对照组为健康人外周血CD8+T细胞单独培养组,培养5 d后收集2组共培养上清。ELISA法检测2组上清中TGF-β1水平。在上述共培养体系基础上增加anti-TGF-β1中和组,即在SKOV3与健康人外周血CD8+T细胞共培养体系中加入anti-TGF-β1中和抗体,共培养5 d后收集3组CD8+T细胞。流式细胞术检测各组CD8+T细胞中Treg相关标志物(CD25、Foxp3、CD28)的表达率。将3组CD8+T细胞和na?ve CD4+T细胞按照1∶0、1∶1、1∶5、1∶10、0∶1的比例进行共培养,并在体系中加入anti-CD3及辐照的PBMCs,培养56 h后加入3H-Td R,继续培养16 h后收集细胞,液体闪烁仪检测CPM值。结果与CD8+T细胞单独培养组相比,SKOV3/CD8共培养组上清中高表达TGF-β1(P0.01)。在共培养体系中加入anti-TGF-β1中和抗体后,与SKOV3/CD8共培养组相比,anti-TGF-β1中和组CD8+CD28-Treg、CD8+CD25+Treg和CD8+Foxp3+Treg细胞比例显著下降,但相比CD8+T细胞单独培养组仍然升高。功能抑制试验结果显示,共培养组CD8+T细胞能抑制na?ve CD4+T细胞的增殖,anti-TGF-β1中和组仅在CD8+T细胞和na?ve CD4+T细胞比例为1∶1时对na?ve CD4+T细胞增殖呈现抑制作用,而单独培养组CD8+T细胞不能抑制na?ve CD4+T细胞的增殖。结论 anti-TGF-β1可部分中和卵巢癌微环境诱导的CD8+Tregs表型及功能,TGF-β1是卵巢癌细胞生长微环境诱导CD8+Treg分化过程重要的作用因素之一。     

内毒素耐受状态下脾脏CD4~+Foxp3~+调节性T细胞的比例变化及意义

以5mg/kg浓度LPS腹腔注射C57BL/6小鼠建立内毒素耐受模型,观察注射72h及8d后脾脏大小、重量及总细胞数;HE染色观察脾脏病理学变化;FACS检测CD4+Foxp3+Treg细胞比例并计算其细胞总数;同时检测CD4+Foxp3+Treg细胞功能相关膜分子CTLA-4的相对表达;Ki-67染色法检测CD4+Foxp3+Treg细胞的增殖情况;PI染色法检测CD4+Foxp3+Treg细胞的凋亡情况;Real-time PCR技术检测脾脏中TGF-β的相对表达。结果发现与对照组相比,LPS注射72h后脾脏大小、重量及细胞总数显著增加(P0.05),且发生病理学改变;脾脏中CD4+Foxp3+Treg细胞比例和数量显著减少(P0.05),CTLA-4表达水平显著降低(P0.05);同时,增殖比例明显减少,凋亡比例增加(P0.05);最后,脾脏中TGF-β的相对表达水平显著减少。LPS注射8d后脾脏大小、重量及细胞总数均与对照组相比无差异(P0.05),且脾脏组织结构未见改变;脾脏中CD4+Foxp3+Treg细胞比例及数量仍减少(P0.05),而其表达CTLA-4水平增加(P0.05),且凋亡和增殖比例无明显差异(P0.05);最后,脾脏组织中TGF-β的相比表达显著增加。结果表明,内毒素耐受状态下,CD4+Foxp3+Treg细胞比例发生明显改变,可能与细胞凋亡和增殖变化有关。     

MicroRNA-126调控CD4~+Foxp3~+T细胞的外周诱导及功能

目的探讨Micro RNA-126对CD4~+Foxp3~+Tregs的外周诱导调控及功能的影响。方法分选Balb/c小鼠脾脏CD4~+CD25-初始T细胞,在anti-CD3/CD28的激活下,用TGF-β进行诱导培养,在第3、5天FACS检测CD4~+Foxp3~+Tregs的比例,Real-time PCR检测mi R-126的表达;采用mi R-126抑制剂抑制mi R-126后,FACS检测CD4~+Foxp3~+Tregs的比例,Real-time PCR检测mi R-126的表达;进而采用mi R-126 ASO下调CD4~+Foxp3~+Tregs中mi R-126的表达,Real-time PCR检测IL-10和TGF-β的表达,CFSE标记技术分析CD4~+Foxp3~+Tregs免疫抑制功能。结果 mi R-126在活化的Tregs中的表达高于在活化的CD4~+CD25-T细胞中的表达(P0.05);TGF-β在体外诱导生成Foxp3~+CD4~+T细胞的比例组间差异具有统计学意义(P0.05),同时在Tregs的诱导过程中,mi R-126的表达上调(P0.05);CD4~+CD25-T细胞体外瞬时转染mi R-126抑制剂,与对照组比较,Foxp3~+CD4~+T细胞的比例组间差异具有统计学意义(P0.05),mi R-126抑制剂能有效下调mi R-126的表达(P0.05);与对照组相比,mi R-126 ASO转染组Tregs中Foxp3、CTLA-4和GITR的表达均降低(P0.05),且TGF-β和IL-10的m RNA相对表达均降低(P0.05);CFSE标记细胞增殖实验显示,mi R-126 ASO Tregs组CD4~+CD25-T细胞增殖与Tcon组、Control Tregs组比较,差异具有统计学意义(P0.05)。结论下调mi R-126的表达能显著削弱CD4~+Foxp3~+Tregs的外周诱导和免疫抑制功能。     

阻断CD40-CD40L共刺激途径对T细胞表型及细胞因子分泌的作用研究

目的探讨应用抗CD40L单克隆抗体阻断CD40-CD40L共刺激途径后对T细胞表型及其分泌的细胞因子的影响,为体外阻断该共刺激途径诱导T细胞对异体移植抗原的免疫耐受提供实验依据.方法供鼠(C57BL/6H-2b)脾T细胞作为反应细胞,受鼠(BALB/CH-2d)脾细胞作为刺激细胞,设单抗组(加抗CD40L单抗)和对照组(不加单抗),初次混合淋巴细胞培养(MLR)7天,在不同时间点采用3H-TdR掺入法检测细胞增殖率,以ELISA法测定培养上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10等的水平,第5天采用流式细胞仪检测CD4+T和CD8+T细胞上CD25、CD69、CD40L和CD45RA的表达.再次MLR 5天,第1、3、5天采用3H-TdR掺入法测定细胞的增殖情况和ELISA法测定培养上清液中的上述细胞因子的水平.结果初次和再次MLR结果均显示,单抗组细胞增殖反应率明显低于对照组.初次MLR单抗组中CD4+T和CD8+T细胞比例明显低于对照组(P＜0.05);单抗组中CD4+CD25+T、CD4+CD69+T、CD8+CD25+T、 CD4+CD40L+T和CD8+CD69+T细胞比例明显低于对照组(P＜0.05),而CD8+CD40L+T和CD4+CD45RA+T细胞的比例与对照组相比无明显差异(P＞0.05).初次MLR中单抗组和对照组培养上清中IL-4和IL-10几乎无法测出,而单抗组培养上清中IFN-γ和IL-2的水平均明显低于对照组(P＜0.01);再次MLR后培养上清中单抗组IFN-γ、IL-2和IL-4和IL-10的分泌水平明显低于对照组(P＜0.05),但处于低水平,仍明显低于对照组.结论在体外MLR体系中,应用抗CD40L单抗孵育供鼠脾T细胞,可同时作用于CD4+T和CD8+T细胞,使CD40L+,CD25+和CD69+表达下降,引起T细胞早期的活化和成熟障碍,T细胞增殖能力减低,抑制了Th1类细胞因子IFN-γ和IL-2及Th2类细胞因子IL-4和IL-10的分泌水平,可诱导供者T细胞免疫耐受.     

卡介苗联合Poly I:C接种对新生期小鼠脾脏T细胞的影响

目的 研究卡介苗(BCG)联合Poly I:C新生期接种对小鼠脾脏T细胞功能亚群发育的影响.方法 新生清洁级BALB/c小鼠32只,分4组:对照组、BCG组、Poly I:C组、BCG和Poly I:C联合接种组,新生期接种4周后取脾细胞用流式细胞仪检测CD3+ CD8+ IFN-γ+、CD3+ CD8- IFN-γ+、CD3+ CD8+ IL-4+ 、CD3+ CD8- IL-4+、CIM+ Foxp3+ T细胞的比例,其分别代表Tc1、TH1、Tc2、TH2和调节性T细胞(Treg)亚群.结果 BCG组、Poly I:C组、BCG和Poly I:C联合接种组TH1、Tc1细胞比例明显高于对照组(P＜0.05或P＜0.01),3个接种组间比较差异无统计学意义;Tc2、TH2和Treg比例各组间比较差异没有统计学意义;3个接种组TH1/TH2和总IFN-γ/IL-4比值明显高于对照组(P＜0.05或P＜0.01),联合接种组TH1/TH2比值高于BCG组(P＜0.05),Tc1/Tc2比值各组间差异没有统计学意义;CD4+ Foxp3+ T细胞比例各组间比较差异没有统计学意义.结论 新生期BCG和Poly I:C接种均能促进TH1、Tc1细胞亚群的发育,提高TH1/TH2比值,其联合接种在TH1/TH2水平可能具有一定的协同作用,但不能影响CD4+ Foxp3+ Treg细胞的比例.     

卵清蛋白免疫耐受因子转移免疫耐受活性的研究

目的:探讨卵清蛋白免疫耐受因子(OVA immune tolerance factors,OVA ITFs)转移抗原特异性外周免疫耐受的特性.方法:分别从OVA耐受鼠或空白小鼠的脾淋巴细胞裂解液中分离分子量小于3 kD的组分,即为OVA ITFs或OVA ITFscontorol.试验BALB/c小鼠分成5组,A、B、C、D组经尾静脉分别注射OVA ITFs、OVA ITFs control、OVA耐受鼠脾淋巴细胞或PBS给正常BALB/c小鼠,E组不做任何处理.流式细胞术检测转移前后受体鼠脾脏CD4+CD25+T细胞亚群的比例变化,MTT法检测受体鼠OVA特异性T淋巴细胞的增殖情况,夹心ELISA法测定培养上清中IL-10、TGF-β1的水平.结果:转移OVA ITFs或OVA耐受鼠脾淋巴细胞后,受体鼠脾脏CD4+CD25+T细胞亚群在总CD4+T细胞的比例分别为(15.32±1.03)%和(15.35±0.62)%,与转移前(9.97±1.38)%相比显著上升(P＜0.05);OVA特异性淋巴细胞增殖刺激指数(Stimulation Index,SI)分别为0.699±0.05和0.704±0.03,与PBS对照组(1.356±0.07)相比明显受到抑制(P＜0.05);培养上清中TGF-β1的分泌量分别为129.15±6.14和106.71±2.89 pg/ml,显著高于PKS对照组(52.82±3.68 pg/ml,P＜0.01),IL-10分泌量未检出.转移OVA ITFscontrol后,受体小鼠的CD4+CD25+T细胞比例、OVA特异性淋巴细胞增殖及TGF-β1、IL-10分泌量均无显著变化.结论:OVAITFs具有将OVA特异性免疫耐受传递给正常受体小鼠的特性.     

宫颈癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T淋巴细胞及血清中IL-10、TGF-β的表达及其临床意义

目的 探讨宫颈癌患者外周血CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T淋巴细胞(regulatory T cells,Treg)、T淋巴细胞亚群以及血清IL-10、TGF-β1、TGF-β2细胞因子的表达及其临床意义.方法 选取32例宫颈癌患者和24位健康体检者为研究对象,采用流式细胞术检测受试者外周血中CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg占CD4+T淋巴细胞的比例、T淋巴细胞亚群细胞比例;采用ELISA方法检测血清中细胞因子IL-10、TGF-β1、TGF-β2的含量.结果 与健康对照组相比,宫颈癌组外周血中CD4+CD25+ Foxp3+ Treg占CD4+T淋巴细胞的比值明显增高,差异有统计学意义(P＜0.01),T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+、CD4 +/CD8+、CD19+)比例差异无统计学意义(P＞0.05),血清IL-10含量明显增高,TGF-β2含量明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01),TGF-β1的含量差异无统计学意义(P＞0.05);宫颈癌组手术后、化疗后CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg占CD4+T淋巴细胞的比例,血清IL-10、TGF-β1、TGF-β2含量均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01),CD4+ CD25+ Foxp3+Treg与TGF-β1之间存在正相关(r=0.673,P＜0.01).结论宫颈癌患者CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg占CD4+T淋巴细胞的比值增高,且与TGF-B1含量呈正相关,可能在宫颈癌的肿瘤发生发展及肿瘤免疫逃逸中起着重要作用.     

甲基转移酶抑制剂延长小鼠心脏移植物存活期的作用研究

探讨甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷调控体内幼稚T细胞转化对同种心脏移植物存活期的影响及其机制。将C57BL/6小鼠分为实验与对照2组,实验组每日腹腔注射5-氮杂-2′-脱氧胞苷(0.25mg/kg体质量),对照组接受等体积的二甲亚砜腹腔注射。然后,提取小鼠脾细胞,抗CD3与抗CD28抗体协同共刺激后,检测CD4+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞比例。以BALB/c小鼠为供鼠,两组C57BL/6小鼠为受鼠,建立腹部异位心脏移植模型,监测两组移植心存活时间,检测受鼠脾细胞中CD4+T细胞凋亡率,观察移植心脏组织病理学变化。结果显示,实验组移植前脾细胞中CD4+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞比例为(22.7±2.6)%,明显高于对照组的(12.6±1.1)%,差异有统计学意义(P0.05);实验组移植物存活(22.8±2.8)d,明显长于对照组(8±1.8)d,P0.05);实验组移植后脾细胞中CD4+T细胞凋亡率(11.5±1.22)%,高于对照组的(6.6±0.91)%,差异有统计学意义(P0.05)。实验组移植物淋巴细胞浸润数量少于对照组。以上结果提示甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷受体腹腔注射可延长同种移植心脏存活期,其机制可能与调控幼稚T细胞转化为CD4+Foxp3+T细胞,诱导CD4+T细胞凋亡有关。     

特发性血小板减少性紫癜患者CD4~+ CD25~+ Treg细胞和TGF-β1的相关研究

目的:研究特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者外周血CD4+ CD25+调节性T细胞(Treg)及相关细胞因子转化生长因子β1(TGF-β1)的表达水平,探讨二者在ITP发病机制中的作用。方法:流式细胞术(FCM)检测31例ITP患者及25例健康志愿者外周血Treg细胞的数量,ELISA方法检测血清中TGF-β1的含量,并进行相关性分析。结果:ITP患者外周血CD4+ CD25+调节性T细胞数量显著低于正常对照组(P0.05),血清TGF-β1的含量也较正常对照组明显减低(P0.05),差异有统计学意义。但CD4+ CD25+调节性T细胞比例与TGF-β1的含量无相关性(P0.05)。结论:ITP患者CD4+ CD25+调节T细胞数量减少与ITP的细胞免疫失调有关,CD4+ CD25+调节性T细胞和TGF-β1在ITP中作用机制复杂,还需要进一步研究。     

八珍汤对TGF-β1抑制的T淋巴细胞增殖及其活化影响

目的:研究八珍汤对TGF-β1抑制下人T淋巴细胞的增殖及活化的影响.方法:以正常人外周血来源的T淋巴细胞为研究对象, 设对照组、 PHA组、 PHA+八珍汤组、 PHA+TGF-β1组、 PHA+TGF-β1组+八珍汤组.以MTT法检测八珍汤对TGF-β1抑制的T淋巴细胞增殖的影响;流式细胞术(FCM)检测八珍汤对TGF-β1抑制的T淋巴细胞活化的影响及对CD4+CD25+调节性T淋巴细胞的数量的影响;ELISA法检测八珍汤对TGF-β1抑制的T淋巴细胞分泌IFN-γ、 IL-2的影响.结果:八珍汤可以使TGF-β1抑制的T淋巴细胞的增殖率回升(P<0.01), 但仍低于对照组(P<0.01), 并随TGF-β1作用时间的延长, 恢复难度增加.八珍汤可以使T淋巴细胞活化率增加, TGF-β1+八珍汤组与TGF-β1组的活化标志CD69表达有统计学差异(P<0.01);八珍汤能使CD4+CD25+调节性T淋巴细胞的比例降低(P<0.01);能使T淋巴细胞分泌IFN-γ、 IL-2的能力恢复(P<0.01), 但都未能恢复到TGF-β1抑制前的水平, 明显低于PHA组水平(P<0.01).结论:八珍汤对TGF-β1抑制的T淋巴细胞增殖率、 T淋巴细胞的活化、 CD4+CD25+调节性T细胞比例、 IFN-γ、 IL-2的分泌水平都有一定的恢复作用.     

强直性脊柱炎患者外周血CD4+调节性T细胞的变化及意义

目的 探讨强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)患者外周血中CD4+调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的表达、功能及意义.方法 采用流式细胞术检测78例AS患者和50例健康志愿者外周血中CD4+CD25+CD127lo/- Treg、细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)和NK细胞,采用ELISA法检测血清中β型转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达水平.从患者外周血单个核细胞中磁珠分选出CD4+CD25+ Treg细胞,混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte culture, MLC)分析其免疫抑制功能.结果 AS活动期患者外周血中CD4+CD25+CD127lo/-Treg占CD4+ T淋巴细胞的百分比为(4.36±1.21)%,MLC中CD4+CD25+ Treg抑制同种异体T淋巴细胞增殖功能低下,与其Treg分泌TGF-β减少相关,CD4+ Treg含量及功能均低于健康志愿者(P<0.05).AS患者外周血中CD4+CD25+CD127lo/- Treg水平与TGF-β呈正相关,与TNF-α呈负相关.结论 AS患者外周血中Treg表达水平低,且存在功能缺陷,导致体内诱导免疫耐受机能不足,可能参与AS免疫发病.     

局部湿热联合微波消融对乳腺癌荷瘤小鼠CD4~+ CD25~+调节性T淋巴细胞比例和功能的影响

目的探讨局部湿热联合微波消融对乳腺癌荷瘤小鼠脾细胞中CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)比例和功能的影响。方法小鼠随机分为荷瘤组、局部湿热/微波消融处理组和局部湿热联合微波消融处理组共4组,每组12只。先建立小鼠乳腺癌实验动物模型,分别进行局部湿热、微波消融或局部湿热联合微波消融处理。用FACS检测脾细胞中Tregs的比例变化;real-time PCR检测Foxp3 mRNA水平;FACS检测CTLA-4和GITR的表达;ELISA法检测TGF-β和IL-10的含量;增殖抑制实验观察CD4+CD25-T细胞体外增殖。结果与单一局部湿热处理组和微波消融处理组相比,Tregs在局部湿热联合微波消融处理组中的比例显著降低(P0.05)。并且,Tregs细胞的Foxp3、CTLA-4和GITR的表达也明显降低(P0.05),同时TGF-β和IL-10的分泌及抑制功能也显著削弱(P0.05)。结论湿热联合微波消融可以较单一治疗方法更有效的抑制肿瘤生长,这与其降低CD4+CD25+调节性T细胞的比例和功能密切相关。     

调节性T细胞及其分泌的细胞因子在再生障碍性贫血中的意义

目的:检测再障患者外周血中T细胞亚群比例及Treg细胞相关的细胞因子分泌水平,探讨其在再障发病中作用。方法:依据临床诊断标准,收集初发再障组、再障造血恢复组、正常对照组的外周血标本,流式细胞学方法检测各组CD4+、CD8+、NK、NKT、Treg细胞的比例,免疫磁珠法分离各组外周血中Treg细胞,并给予刺激培养,24、48小时后收集上清液,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Treg细胞分泌的细胞因子IL-10、IL-35、TGF-β的表达水平。结果:初发再障组的CD4+,Treg比例与正常对照组和再障造血恢复组相比显著低下;CD8+T细胞比例在再障患者中明显升高,其结果有统计学差异(P<0.05);NK、NKT的细胞与正常对照组比较无明显变化(P>0.05)。分离培养三组人群Treg细胞,ELISA检测结果显示:初发再障患者的IL-10、IL-35、TGF-β表达水平和正常对照组比较明显降低(P<0.05)。结论:T细胞免疫异常是再障发病机制的重要环节,Treg细胞在再障患者恢复造血过程中可能起着正向调控的作用。     

鸢尾素irisin对病毒性心肌炎小鼠的免疫调节作用

目的通过体内外实验研究鸢尾素irisin对病毒性心肌炎小鼠的保护作用及其免疫调节作用。方法体外分离培养乳鼠心肌细胞,并经柯萨奇B3病毒(CVB3)感染诱导心肌细胞凋亡,利用流式细胞术检测各组心肌细胞经10、50、100μg/L的irisin作用后细胞凋亡情况。构建CVB3接种感染Balb/c小鼠的体内病毒性心肌炎模型,并分成空白对照组、模型组和10、50、100μg/kg irisin蛋白治疗处理的irisin作用组,利用流式细胞术检测各组小鼠外周血中相关免疫细胞(NK、CD4~+T、CD8~+T、CD4~+/CD8~+)和淋巴细胞中Treg和Th17细胞比例变化;ELISA方法检测各组小鼠心肌组织中炎性相关细胞因子水平的变化。结果与对照组相比,模型组心肌细胞凋亡率显著上升,而各低、中、高浓度irisin作用组心肌细胞凋亡率逐渐下降(P0.05);与对照组相比,模型组小鼠的NK、CD4~+T细胞比例、CD4~+/CD8~+比值均显著下降(均P0.05),CD8~+T、Treg、Th17细胞比例和相关炎性细胞因子水平则均显著上升(均P0.05);经过不同浓度irisin治疗作用后,各组病毒性心肌炎小鼠的NK、CD4~+T细胞比例、CD4~+/CD8~+比值逐渐上升,且CD8~+T、Treg、Th17细胞比例和相关炎性细胞因子水平均逐渐下降(均P0.05)。结论鸢尾素irisin能够抑制CVB3病毒诱导的病毒性心肌炎心肌细胞凋亡,并可通过调控Treg/Th17细胞比例来改善病毒性心肌炎机体的免疫反应。     

GM-CSF与TGF-β联合处理小鼠供体骨髓细胞诱导特异性免疫耐受

目的:观察用GM-CSF和TGF-β在体外处理供体骨髓细胞(BM)后,输给受体鼠,观察能否诱导受体鼠对供体鼠淋巴细胞的特异性耐受。方法:体外用GM-CSF与TGF-β联合处理供体BM细胞诱导非成熟树突状细胞(iDC),并检测其成熟度。将BALB/c受体鼠随机分为3组,进行不同的预处理:(1)BM预免疫组:经尾静脉输入体外诱导的iDC,1×105细胞/只;(2)脾细胞预免疫组:经尾静脉输入C57BL/6供体鼠脾细胞,1×105/只;(3)阴性对照组:经尾静脉输入同体积的PBS。每组小鼠均需经过2次预免疫,每次间隔1周。第2次处理后1周,所有组的小鼠均接受相同剂量的C57BL/6来源的脾细胞腹腔注射,1×105/只。脾细胞攻击后3d,检测各组小鼠对C57BL/6小鼠脾细胞的同种异体反应水平,检测指标包括:采用单向混合淋巴细胞培养方法检测受体鼠淋巴细胞对供体鼠淋巴细胞的增殖指数;采用双抗体夹心ELISA检测受体鼠血清中IFN-γ和IL-10水平、FCM检测脾脏CD4+CD25highTreg细胞含量、及NK细胞抑制性受体KLRG1的表达、采用乳酸脱氢酶释放法检测NK细胞杀伤功能。结果:经GM-CSF和TGF-β体外处理的供体BM细胞能够抵抗脂多糖(LPS)促成熟的作用;与脾细胞预免疫组相比,经此BM细胞预处理的小鼠,再次遭遇供体小鼠淋巴细胞时,血清IL-10的含量降低(P0.05)、脾脏中CD4+CD25highTreg细胞的比例明显升高、对C57BL/6小鼠淋巴细胞增殖反应减弱(P0.01);NK细胞杀伤率降低。结论:用GM-CSF与TGF-β联合处理供体小鼠BM细胞在一定程度上能够诱导小鼠对供体小鼠脾细胞的免疫耐受,除Treg外,NK细胞可能也参与了诱导免疫耐受。     

丙种球蛋白输注对川崎病患儿外周血CD4~+CD25~+调节T细胞与淋巴细胞亚群分布的影响

目的探讨丙种球蛋白输注对川崎病患儿外周血CD4~+CD25~+调节T细胞(Treg)与淋巴细胞亚群分布的影响及临床意义。方法流式细胞术检测40例川崎病患儿和30例体检健康儿童外周血中CD4~+CD25~+Treg细胞的表达水平以及108例川崎病患儿和41例体检健康儿童外周血中淋巴细胞亚群分布。ELISA法检测川崎病患儿血浆中TGF-β1浓度。108例川崎病患儿中有30例收集到对应的丙种球蛋白(IVIG)治疗后全血,流式细胞术检测CD4~+CD25~+Treg、TGF-β1及淋巴细胞亚群在川崎病患儿丙种球蛋白(IVIG)治疗前后表达水平的差异。结果与健康体检组相比,川崎病患儿CD4~+CD25~+Treg细胞及血浆TGF-β1的表达水平明显降低,外周血CD3+、CD8~+T细胞及NK细胞的表达水平明显降低,CD4~+T细胞、B细胞及CD4~+/CD8~+水平明显增高,差异均有统计学意义(均P0.01)。与IVIG治疗前相比,川崎病患儿IVIG治疗后外周血CD4~+CD25~+Treg细胞及血浆TGF-β1的表达水平明显增高(均P0.05),外周血CD3+、CD8~+T细胞及NK细胞的表达水平明显增高(均P0.05),CD4~+T细胞、B细胞及CD4~+/CD8~+水平明显降低(均P0.05)。治疗后患儿外周血CD4~+CD25~+Treg水平、血浆TGF-β1浓度及淋巴细胞亚群表达水平与健康对照相比无差异(P0.05)。结论 Treg细胞与淋巴细胞比例失常是导致儿童川崎病免疫紊乱的重要原因。检测CD4~+CD25~+调节T细胞及淋巴细胞亚群分布对评估川崎病患儿的细胞免疫状况,辅助诊断和指导治疗具有重要的临床价值。     

Th17细胞和调节性T细胞失衡参与实验性自身免疫性脑脊髓炎的发病

目的探讨Th17细胞和调节性T细胞(Treg)失衡在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发病过程中的作用。方法建立EAE小鼠模型,在EAE发病的不同时期运用流式细胞术检测小鼠脾脏Treg比例变化,用实时定量PCR(qRT-PCR)分别检测小鼠脾淋巴细胞Foxp3、视黄酸相关的孤儿受体γt(RoR-γt)以及脑组织IL-17 mRNA表达,ELISA检测小鼠外周血IL-6、转化生长因子β(TGF-β)及IL-17A含量变化。结果与佐剂对照组比较,CD4+CD25+Foxp3+Treg比例和Foxp3 mRNA的表达,在EAE发病初期及高峰期明显下降,而在慢性期明显升高(P0.05);RoR-γt mRNA表达量在发病初期与佐剂对照组比较显著增加(P0.05),而高峰期及慢性期与佐剂对照组比较则无显著差异(P0.05)。EAE组小鼠外周血中TGF-β、IL-6浓度在发病初期和高峰期明显升高(P0.05);随病情发展,IL-6浓度逐渐降低,在发病慢性期与佐剂对照组比较无明显差异(P0.05),而TGF-β浓度在发病慢性期仍较高,与佐剂对照组比较明显升高(P0.05)。EAE组小鼠外周血中IL-17A含量在EAE不同时期均有明显升高,且高峰期升高最明显(P0.05)。结论 Th17细胞/Treg失衡参与了EAE发病过程。     

抗CD40L单克隆抗体对哮喘大鼠血液和淋巴液调节性T细胞的影响

目的:研究抗CD40L单克隆抗体(抗CD40L mAb)对哮喘大鼠外周血和淋巴液中CD4+ CD25+调节性T细胞(Treg)数量及其功能的影响。方法:抗CD40L mAb处理血液和淋巴液中的单个核细胞(MNCs),流式细胞仪(FCM)检测MNCs中CD4+ CD25+ Foxp3+ T细胞的百分率,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清中IL-10和TGF-β1的含量。结果:体外培养72 h后,淋巴液来源MNCs中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例均明显高于血液来源的MNCs,末次激发后各组淋巴液和血液来源MNCs中CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg比例随细胞收集时间距末次激发时间延长呈先升高后降低的趋势;哮喘组淋巴液和血液来源MNCs中CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg比例均显著低于正常对照组和抗CD40L mAb组(P<0.05);末次激发后0、12 h收集的血液MNCs培养上清中抗CD40L mAb组TGF-β1的水平显著高于哮喘组和正常对照组(P<0.05);末次激发后24 h收集的淋巴液来源MNCs培养上清中抗CD40L mAb组IL-10的水平显著高于哮喘组和正常对照组(P<0.05)。结论:抗CD40L mAb促进CD4+ CD25+ Foxp3+ T细胞增殖,并在哮喘激发早期(0、12 h)促进血液来源CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞分泌TGF-β1,哮喘激发后期(24 h)促进淋巴液来源CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞分泌IL-10。