siRNA表达载体介导的RNA干扰对肝癌细胞周期蛋白E1表达抑制研究

目的探讨经载体介导的RNA干扰对肝癌细胞周期蛋白E1表达抑制效率。方法针对周期蛋白E1基因设计并合成特定的RNA干扰模板片段，连接到pSilencer1．0-U6载体上构建siRNA真核表达载体；脂质体转染法将上述重组质粒转人BEL-7402肝癌细胞株。RT—PCR分析周期蛋白E1表达抑制率；流式细胞术测细胞周期S期和凋亡细胞比率；MTT比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线。结果重组载体介导肝癌细胞BEL-7402周期蛋白E1抑制率达62％；转染重组质粒32h测得S期细胞为19％，空载体转染对照为27％；转染重组质粒96h流式细胞术测得凋亡细胞为13．1％，高于空载体对照的6．6％；细胞生长曲线作图表明，重组载体转染组细胞生长明显减缓。结论肝癌细胞周期蛋白E1的表达可被载体介导诱发的RNA干扰成功抑制，进而导致细胞生长受抑并诱导凋亡；本研究为探索肝癌的RNAi治疗提供了初步的实验依据。     

反义RNA技术对抑制人肝癌细胞SMMC-7721中POLD1基因表达的研究

目的:应用反义RNA技术抑制人肝癌细胞SMMC-7721中POLD1基因的表达,探索采用该技术干预肝癌的可行性。方法:制备人POLD1基因的反义RNA表达质粒,同时建立空白对照组与阴性对照组,由此将实验分为阴性对照组(转染空载体的SMMC-7721细胞)、空白对照组(肝癌细胞SMMC-7721)和实验组(转染人POLD1基因反义RNA表达质粒的肝癌SMMC-7721细胞)3组。MTT实验分析细胞增殖变化,并在转染SMMC-7721细胞48h后,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测POLD1基因的表达。结果:MTT实验显示,与空白对照和阴性对照组相比,转染了反义RNA的实验组细胞增殖受到明显抑制。在转染后24～72h,实验组吸光度24h为0.306 7±0.015 4,48h为0.459 2±0.033 2,72h为0.567 1±0.061 1,与空白和阴性对照组相比,P值均<0.05。实时荧光定量PCR实验显示,实验组POLD1的mRNA表达明显下调为0.142 5±0.020 5,阴性对照组为1.017±0.188,空白对照组为1.00±0.00(F=26.5,P<0.05),说明POLD1基因表达受抑制。蛋白质印迹实验显示,POLD1基因蛋白水平(p125)变化趋势与mRNA相同,均为下调,其中实验组为0.222 3±0.009 7,阴性对照组为0.237 9±0.005 9,空白对照组为0.235 4±0.003 4(F=1 365.754,P值均<0.05),说明反义RNA可抑制p125蛋白表达,结论与基因水平趋势一致。结论:针对POLD1基因设计的反义RNA体外抑制了肝癌细胞SMMC-7721的增殖,这与POLD1在基因和蛋白水平的表达下调有关。     

RNAi抑制肾癌细胞MDR1基因表达及对顺铂化疗耐药的逆转

目的:研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)对肾癌细胞多药耐药基因1(multidrug resistance,MDR1)表达的抑制作用,并分析干扰前后肾癌细胞对顺铂(cisplatin)敏感度的变化.方法:根据MDR1基因序列设计3条小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染肾癌A498细胞;RT-PCR法检测转染前后MDR1 mRNA表达水平的变化,筛选出干扰效率最高的siRNA序列;进而利用慢病毒包装siRNA重组质粒,感染A498细胞,RT-PCR法筛选沉默效果最好的细胞株进行克隆;Western印迹法检测MDR1蛋白表达水平;MTT法检测干扰前后顺铂对半数细胞抑制浓度(half inhibitory concentration,IC_(50))的变化.结果:3条siRNA序列均能不同程度地抑制细胞MDR1基因的表达,其中siRNA-1序列能更有效地封闭MDR1基因,使MDR1 mRNA表达水平下降67%;筛选得到稳定转染的细胞株与未干扰细胞株相比,MDR1蛋白表达量明显下降(P<0.01),并使顺铂对细胞的IC_(50)值降低约83.37%(P<0.01).结论:RNAi能有效抑制肾癌A498细胞MDR1基因的表达,并可显著增加其对顺铂的敏感度,从而使肾癌细胞化疗耐药逆转成为可能.     

RNA干扰抑制RAD51基因表达对放射敏感性影响的实验研究

目的:构建针对DNA双链断裂修复基因RAD51的siRNA表达质粒,观察对肝癌细胞株HepG-2放射敏感性的影响。方法:采用基因重组技术,构建针对RAD51基因的干扰质粒pSilencer-1、pSilencer-2、pSilencer-3及对照质粒pSilencer-C,经脂质体转染HepG-2细胞,200μg／mL潮霉素筛选稳定表达的细胞,用Western blot测定RAD51蛋白表达量的改变,用细胞克隆形成实验测定细胞放射敏感性。结果:筛选出稳定转染各组质粒的细胞;转染pSilencer -1、pSilencer-2和pSilencer-3质粒细胞克隆的RAD51蛋白表达量分别为转染pSilencer-C细胞克隆的0．60±0．29、0．36±0．16和0．15±0．09,t值分别为4．101、6．561和8．714,P值分别为0．049、0．003和0．001。pSilencer-C组、pSilencer-2组和pSilencer-3组三组剂量存活曲线的D0值分别为1．55、1．46和1．44,Dq值分别为3．31、3．16和2．82,SF2分别为0．82、0．73和0．67 Gy;与pSilencer-C组相比,pSilencer-2组和pSilencer-3组在2 Gy剂量时的放射增敏比SERSF2分别为1．12和1．23。结论:RNAi抑制RAD51基因的表达,能提高HepG-2细胞的放射敏感性,提示RAD51基因可作为放射增敏治疗的一个潜在靶点。     

肝癌细胞中RhoA小干扰RNA载体的构建与鉴定

 目的 构建靶向RhoA基因的RNA干扰（RNAi）载体。方法 根据人RhoA基因序列设计两条短双链，人工合成后，连接到真核表达载体Pgenesil-1中，构成Pgenesil-1-siRhoA1、Pgene-sil-1-siRhoA2两个重组质粒，转入人肝癌细胞（HEPG2）中，Western blot方法检测RhoA-siRNA对RhoA表达的抑制效果，确定一个重组质粒进行下一步研究。结果 两质粒都有沉默RhoA基因的作用，Pgen-esil-1-siRhoA1重组质粒作用更强烈一些，使用Pgenesil-1-siRhoA1质粒进行下一步研究。结论 Pgen-esil-1-siRhoA重组质粒的成功构建，为研究RhoA与肝细胞癌侵袭转移的关系提供实验模型。     

RNA干扰技术抑制smad4基因表达对宫颈癌细胞增殖的影响

目的：探讨用RNA干扰技术下调smad4基因表达对宫颈癌细胞增殖的影响。方法：用DNA重组技术将针对人smad4基因不同部位所设计的三对短发夹状RNA（shorthairpinRNA，shRNA）序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中，构建smad4shRNA表达载体pGenesil—smad4一shRNA1、2、3。脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HeLa，经G418筛选抑制smad4表达的稳定细胞克隆。MTT法、克隆形成实验、流式细胞术检测抑制smad4基因对宫颈癌细胞增殖的影响。结果：成功构建分别携带三段shRNA及空载体对照的重组质粒pGenesil—smad4-shRNA1、2、3和pGenesil-con，三种shRNA重组质粒中pGenesil—smad4-shRNA2可明显降低细胞内smad4mRNA及smad4蛋白表达，筛选出的HeLa／shRNA2细胞增殖能力明显增强。结论：应用RNA干扰技术能筛选出特异而高效阻断smad4基因表达及功能的shRNA，smad4基因表达下调能明显促进宫颈癌细胞生长。     

慢病毒载体介导RNA干扰体外抑制人胰腺癌细胞VIM基因的表达

Objective: To construct a lentiviral expression vector for RNA interference (RNAi) of human VIM gene; and assess its gene silencing effect in pancreatic cancer cell line Panc-1. Methods: Three pairs of human VIM gene short hairpin RNA (shRNA) sequences were designed using a software available on-line and one pair came from document. After synthesis and annealing, four double-stranded oligonucleotides (dsOligo) were cloned into the pGCL-GFP/U6 plasmid, which were subsequently confirmed by polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing analysis. Real-time PCR and Western blotting were used to screen the effective pGCL-GFP-shRNA plasmid in 293T cells, then the most effective one was packed into the recombinant lentivirus Lv-VIM-shRNA with lentiviral packing materials pHelper 1.0 and pHelper 2.0 in 293T cells.The titer of lentivirus was determined by hole-by-dilution titer assay. The silencing effect of Lv-VIM-shRNA in Panc-1 cells were validated by real-time PCR and Western-blotting. Results: An effective Lv-VIM-shRNA was successfully constructed.The titer of lentivirus was determined on 2×109TU/mL. The expressions of VIM mRNA and vimentin were down-regluated in the Panc-1 cells infected with Lv-VIM-shRNA. Conclusion: An effective Lv-VIM-shRNA could inhibit the expression of VIM gene in Panc-1 cells in vitro, which provides a tool for investigating the role of VIM gene in the signaling pathway involved in tumorigenesis and progression of pancreatic cancer and searching new therapeutic targets.     

RNA干扰技术的应用

RNA干扰(RNAi)能产生序列特异性的基因沉默。RNAi的研究与应用在短时间内得到了迅速发展，其应用主要围绕特异性降解同源mRNA的作用方面。现对其应用进展进行综述。     

MDR1 RNAi表达克隆的质粒构建

目的:构建针对多药耐药基因(MDR1)的RNA干扰(RNAi)表达克隆质粒。方法:采用Invitrogen公司的Block-i TTMU6RNAi Entry Vector Kit和BLOCK-i T Lentiviral RNAi Expres-sion System生产表达克隆质粒。针对MDR1人工设计合成一段寡核苷酸,依照试剂盒说明书分别构建MDR1entryclone质粒和表达克隆质粒。以MDR1entry clone质粒瞬时转染MCF-7/ADM细胞株,MTT法测细胞对ADM的耐药性及流式细胞仪测试P-gp表达情况。抗生素筛选表达克隆、抽提质粒电泳鉴定。结果:测序证实MDR1entry clone质粒构建正确,无任何突变.转对照质粒组和转MDR1entry clone质粒组,P-gp表达水平分别为(31.97±1.2)%和(7.88±0.5)%,IC50分别为1.27和0.4μg/mL。两组比较,P-gp表达和IC50差异均有统计学意义,P均<0.05。抗生素筛选显示转化克隆对氯霉素敏感、对氨苄青霉素具抗性,抽提质粒琼脂糖凝胶电泳显示重组质粒大小符合设计要求。结论:MDR1entry clone质粒和表达克隆质粒构建正确,为进一步阻断MDR1基因表达逆转肿瘤多药耐药奠定了基础。     

肝癌细胞系BEL-7402中siRNA表达载体介导靶向c-myc基因的RNA干涉实验研究

Objective： To explore the inhibition of the expression of c-Myc in human hepatocellular carcinoma via vector-based RNA interference （RNAi）. Methods： Two RNA interference DNA templates targeting c-Myc oncogene were designed via online software and synthesized. By ligation, the fragments were inserted into pSilencer 1.0-U6 to construct the recombinant siRNA expressing plasmids. The identified recombinants were introduced into BEL-7402 cells with Lipofactamine. The inhibition of c-Myc expression, together with the expression of CDK4, hTERT and Gadd45β in c-Myc down-regulated BEL-7402 cells, were analyzed by semi-quantitative RT-PCR. Results： Two recombinant plasmids pSic-myc-1 and pSic-myc-2, which direct the yields of siRNAs targeting c-Myc in cells, were constructed. Among which, pSic-myc-2 was shown to trigger a RNAi-mediated inhibition of expression of c-Myc in BEL-7402 by up to 90%. In c-Myc knockdown BEL-7402 cells, the expression of CDK4 and hTERT were down-regulated with a ratio of 85% and 57%, respectively, while the expression of Gadd45β was up-regulated by up to 110%. Conclusion： The expression of c-Myc in BEL-7402 could be suppressed by vector-based RNA interference successfully. The knockdown of c-Myc in turn resulted in the changes of expression of genes related to cell proliferation and apoptosis. Thus, our study provided a preliminary data in searching of a c-Myc-targeted RNAi therapy of human hepatocellular carcinoma.     

肝癌细胞系BEL-7402中siRNA表达载体介导靶向c-myc基因的RNA干涉实验研究

目的:探索经载体介导的RNA干涉对肝癌细胞cmyc基因表达抑制的可行性。方法:设计并合成2条靶向癌基因cmyc的RNA干涉模板片段,分别将其连接至pSilencer1.0U6载体上构建siRNA真核表达载体;脂质体转染法将上述重组质粒转入BEL7402肝癌细胞株。半定量RTPCR分析cmyc基因的表达抑制效率,以及cmyc基因表达下调细胞中CDK4、hTERT和Gadd45β基因表达的改变。结果:获得2个能在细胞内有效转录生成靶向cmyc基因siRNA的重组载体pSicmyc1和pSicmyc2;其中pSicmyc2可有效介导肝癌细胞BEL7402cmyc基因的表达抑制,抑制率高达90%以上;在cmyc基因经RNAi抑制的细胞中,CDK4和hTERT基因的表达分别下调至85%和57%;而Gadd45β的表达上调约110%。结论:肝癌细胞BEL7402中cmyc基因的表达可被载体介导诱发的RNA干涉有效抑制,进而导致细胞中与增殖和凋亡相关基因的表达改变。     

shRNA沉默多药耐药胃癌细胞7901/VCR MDR1基因表达的实验研究

目的利用RNAi技术干扰胃癌多药耐药细胞（7901/VCR）多药耐药基因（MDR1）的表达,为临床肿瘤的基因治疗奠定基础。方法根据MDR1的碱基序列设计并合成两对短发夹RNA,构建重组载体,用阳离子脂质体法体外转染7901/VCR;采用MTT法检测转染胃癌细胞的生长抑制率,流式细胞术检测细胞周期变化,RT-PCR和Western blot检测转染前后MDR1 mRNA和蛋白表达的变化。结果成功构建RNAi质粒载体,转染后细胞IC50明显降低（P〈0.05）;G1期细胞增加,S期细胞减少（P〈0.05）;MDR1 mRNA转录水平下降（P〈0.05）,P-糖蛋白（P-gp）的表达水平降低（P〈0.05）。结论RNAi能明显抑制胃癌细胞7901/VCR MDR1mRNA和P-gp蛋白的表达,进而对肿瘤细胞多药耐药性有明显的逆转作用,为基因治疗提供了一种新的手段。     

干扰RNA对HepG2肝癌细胞内源性c-myc表达的抑制作用

目的 研究干扰RNA(RNAi)对HepG2细胞的c-myc基因表达的干扰效应。方法 建立装载靶向c-mvc基因小干扰性RNA(siRNA)的表达载体。用脂质体法将此表达载体转染HepG2细胞株,以转染空载细胞作为对照。采用定量PCR和Western blot检测c-myc基因的表达。用流式细胞仪及荧光显微镜检测AnexinV标记的凋亡细胞。结果 转染siRNA的表达载体可以抑制内源c-myc基因在转录和转译上的表达,抑制率达67％。c-myc基因的表达抑制与HepG2细胞的凋亡相关联。结论 转染siRNA的表达载体可明显抑制肝癌细胞株HepG2 c-myc基因的表达,并伴有细胞的凋亡。     

shRNA逆转耐阿霉素人乳腺癌细胞株（MCF-7/AdrR）的多药耐药性

目的〖HT5"SS〗： 利用短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）表达载体逆转耐阿霉素人乳腺癌细胞株(MCF7/AdrR)的多药耐药性（multidrug resistance,MDR）。〖HT5W〗方法〖HT5"SS〗： 构建2个MDR1基因shRNA表达质粒,稳定转染MCF7/AdrR细胞。RTPCR分析MDR1基因mRNA的表达,Western blotting检测P糖蛋白(Pgp)的表达,流式细胞术和MTT法分别检测乳腺癌细胞的凋亡和对阿霉素的敏感     

小干扰RNA靶向抑制埃兹蛋白对肠癌细胞生物学行为的影响

目的：探讨细胞膜与细胞骨架连接的埃兹蛋白（Ezrin）对肠癌细胞生长和侵袭转移能力的影响。方法：选取肠癌细胞系（Lovo，SW 480）作为研究材料，采用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）方法下调Ezrin的表达，分别通过实时荧光定量PCR和Western印迹法检测siRNA对Ezrin mRNA和蛋白表达水平的下调及下调作用随干扰时间的变化。根据Western印迹法检测结果，选取Ezrin蛋白表达最低的时间点检测干扰后肠癌细胞生物学行为的改变。运用CCK-8法检测2株细胞干扰前后增殖能力的改变，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡，Transwell实验检测肠癌细胞侵袭和转移能力的变化。结果：实时荧光定量PCR和Western印迹结果显示，Ezrin siRNA对Ezrin mRNA和蛋白表达水平均有显著的下调作用。下调Ezrin蛋白后，2株肠癌细胞S期细胞比例略有下降，G1期细胞比例略有上升，与对照组比差异无统计学意义（P〉0．05）；2株细胞凋亡指数增加，与对照组比差异有统计学意义（P〈0．05）；肿瘤细胞的运动侵袭能力下降，穿过人工基底膜的细胞数量明显减少，与干扰前比差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：Ezrin在肠癌生长和侵袭转移过程中发挥重要作用，有可能成为抑制肠癌发生发展的新靶点。     

RNA干扰抑制MTA 1的表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的影响

目的:探讨通过RNA干扰技术抑制MTA1的表达及对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和细胞周期的影响。方法:建立3种稳定表达靶向MTA1的shRNA的MDA-MB-231细胞系。通过反转录-聚合酶链反应(reverse transeription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和免疫组化法验证基因表达的抑制效果;采用细胞计数法及噻唑蓝(thiazolylblue,MTT)法检测细胞的增殖能力;流式细胞仪分析细胞周期。结果:MTA1基因被抑制后,其mRNA表达明显下降,RT-PCR结果显示,稳定转染3种重组质粒后,MTA1mRNA水平较对照组分别下调了70.07%、82.40%和63.44%;同时,MDA-MB-231细胞的生长明显受抑制,与对照组细胞相比,细胞计数示细胞数目明显减低;MTT分析示细胞增殖下降,流式细胞分析示细胞周期阻滞在G0/G1期。结论:在MDA-MB-231细胞中,抑制MTA1的表达可有效抑制细胞生长并导致细胞周期的阻滞;利用RNA干扰技术抑制MTA1的表达可能会成为一种有效的乳腺癌基因治疗手段。     

RNA干扰PLCE1基因表达对食管鳞癌细胞周期和凋亡的影响

目的：通过siRNA干扰PLCE1基因表达,检测PLCE1对食管鳞癌细胞增殖周期和凋亡的影响,以探讨PLCE1的致癌机制。方法：采用免疫组织化学方法检测食管鳞癌组织和癌旁正常组织中PLCE1蛋白的表达水平;PLCE1特异性siRNA转染食管鳞癌细胞,荧光显微镜观察转染效率;半定量RT-PCR法检测转染后PLCE1沉默效果;流式细胞术检测干扰后细胞周期变化及凋亡情况。结果：PLCE1在食管鳞癌组织的表达高于正常组织（P=0.000）;siRNA转染后PLCE1表达明显减少（P=0.000）;与对照组相比,PLCE1干扰后可致G0/G1期细胞阻滞（P=0.001）,细胞凋亡增多（P=0.000）。结论：PLCE1在食管鳞癌组织中有较高表达;沉默PLCE1后可抑制癌细胞的增殖,促进其凋亡。