神经生长因子对吲哚美辛诱导人胚胎视网膜色素上皮细胞凋亡的保护作用

目的 探讨神经生长因子(nerve growth factor, NGF)对体外培养的人胚胎视网膜色素上皮(human fetal retinal pigment epithelium, HFRPE)细胞凋亡的保护作用。 方法 用传代培养的HFRPE细胞，建立吲哚美辛(indome thacin, IN)诱导的细胞凋亡模型，并用吖啶橙(acridine orange, AO)荧光染色计数和透射电镜(transmission electron microsocpy,TEM)观察NGF对HFRPE细胞凋亡的保护作用。 结果 用AO荧光染色及TEM均观察到经200 ～600 μmol/L IN处理24 h后的HFRPE细胞出现典型的凋亡形态学改变。200 μmol/L IN+500 μg/L NGF组与对照组200 μg/(mol·L) IN相比凋亡细胞差异有显著性的意义(q=3.9204 ，P=0.0320)；400 μmol/L IN+500 μg/L NGF组与对照组400 μmol/L IN相比凋亡细胞差异有非常显著性的意义(q=9.709 15，P=0.000 1)。 结论 NGF 能拮抗IN诱导的HFRPE细胞凋亡。 （中华眼底病杂志，2003，19：38-41）     

神经生长因子对过氧化氢诱导人胚胎视网膜色素上皮细胞凋亡的保护作用

目的　探讨神经生长因子 (nerve growth factor,NGF)对体外培养的人胚胎视网膜色素上皮 (human fetal retinal pigm ent epithelium,h FRPE)细胞凋亡的保护作用。方法用传代培养的 h FRPE细胞 ,30 0、5 0 0 μmol· L- 1 过氧化氢 (hydrogen peroxide,H2 O2 )建立诱导的 h FRPE细胞凋亡模型 ,并用吖啶橙 (acridine orange,AO)荧光染色计数和透射电镜 (transmission electron microscope,TEM)观察 NGF对凋亡细胞的保护作用。结果　用AO荧光染色及 TEM均观察到经 30 0、5 0 0μmol· L- 1 H2 O2 处理 6 5 h后的 h FRPE细胞出现典型的凋亡形态学改变。 30 0μm ol· L- 1 H2 O2 作用 6 5 h后 h FRPE细胞凋亡指数为4 5 .6 2 %± 1.4 1%和 30 0μmol· L- 1 H2 O2 +40 0μg· L- 1 NGF作用 6 5 h后的 h FRPE细胞凋亡指数 2 2 .79%± 1.30 %相比 ,差异有显著性 (q=4 .84 4 5 ,P=0 .0 0 0 0 ) ;5 0 0μmol· L- 1H2 O2 作用 6 5 h后 h FRPE细胞凋亡指数为 6 6 .2 2 %± 1.86 %和 5 0 0 μm ol· L- 1 H2 O2 +40 0 μg· L- 1 NGF作用 6 5 h后的 h FRPE细胞凋亡指数 4 2 .5 6 %± 1.2 1%相比差异有非常显著性的意义 (q=5 .114 2 ,P=0 .0 0 0 0 )。结论　 NGF能拮抗 H2 O2 诱导的 h FRPE细胞凋亡     

N-甲基-D-门冬氨酸诱导体外培养的视网膜色素上皮细胞凋亡

目的　探讨用N-甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)诱导体外目的　探讨用 N-甲基 -D-门冬氨酸 (N-methyl-D-aspartate,NMDA)诱导体外培养的人胚胎视网膜色素上皮 (retinal pigment epithelium,RPE)细胞的凋亡。方法　加入终浓度分别为 1 0、50、1 0 0、2 0 0、3 0 0 μmol· L-1的 NMDA作用 72 h;3 0 0 μmol· L-1NM-DA作用 1 2、2 4、3 6、48、72 h后用透射电镜定性观察凋亡细胞 ,并用吖啶橙荧光染色进行定量和定性分析。结果　经 2 0 0、3 0 0 μmol· L-1NMDA作用 72 h后 RPE细胞凋亡指数分别为 (51 .0 0 0± 1 .4491 ) %和 (74.0 0 0± 1 .71 2 7) %与对照组 (2 .0 0 0 0± 0 .42 1 6) %相比 ,差异有显著性 (t=1 0 .0 66、1 4.790 ,P=0 .0 0 0、0 .0 0 0 ) ,随着 NMDA浓度的增加 ,RPE细胞凋亡数逐渐增多 ;3 0 0 μmol·L-1NMDA作用 2 4、3 6、48、72 h后 RPE细胞凋亡指数分别为(9.0 0 0 0± 0 .73 79) %、 (1 3 .0 0 0 0± 1 .0 593 ) %、(2 5.0 0 0 0± 0 .70 71 ) %、(53 .0 0 0 0±0 .82 3 3 ) %与对照组 (2 .0 0 0 0± 0 .42 1 6) %相比差异有显著性 (t=2 .0 1 4、3 .1 65、6.61 8、1 4.676,P=0 .0 50、0 .0 0 3、0 .0 0 0、0 .0 0 0 )。结论　 NMDA能诱导体外培养的人胚胎 RPE细胞     

Effects of Nerve Growth Factor on Proliferation and DNA Synthesis of Cultured Human Fetal Retinal Pigment Epithelium Cells

Objective: To investigate the effects of nerve growth factor(NGF)on proliferation and DNA synthesis of cultured human fetal retinal pigment epithelium (RPE) cells in vitro. Methods: Primary culture and subculture of human fetal retinal pigment epithelium cells were established in vitro first. Cultured RPE cellswere treated with NGF by various concentrations 0μg/L, 50μg/L, 100μg/L,200μ,g/L and 300μg/L(final concentration) for 48 hs. After 48 hs, cells proliferation was measured with methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay method and the amount of DNA was determined by the absorbance at 280 nm of nucleic acid & protein analysis.Results: The A values of 100μg/L, 200μg/L, 300μg/L NGF was(0. 213 7 ± 0. 233), (0.218 8 ±0. 018 1), (0.232 2 ±0.016 4) as compared with(0. 1897 ±0.0152) of A value of 0 μg/L NGF respectively, q value was 3.63,4.40,6.42 and P value was 0.015, 0.000, 0. 000(q-test).The DNA concentrations of 100μg/L, 200μg/L, 300μg/L and 400μg/L NGF was (981. 220 4±123. 5357), (1375.     

雷帕霉素对缺氧损伤视网膜神经节细胞的保护作用及其机制

背景 研究表明雷帕霉素(Rapa)可延缓人大脑细胞的衰老,改善大鼠局灶性脑缺血时脑组织代谢活动,对中枢神经细胞具有保护作用.视神经和视网膜神经节细胞(RGCs)属于中枢神经组织,但Rapa是否可对外伤后RGCs具有保护作用尚不清楚. 目的 探讨Rapa对氯化钴(CoCl2)诱导的缺氧损伤大鼠RGCs的保护作用,并探讨其可能的作用机制,为外伤性视神经病变(TON)的治疗提供新的思路.方法 用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基培养大鼠RGC-5细胞,倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态学变化.将细胞分为正常对照组及50、100、200、400和600 μmol/L CoCl2组,于细胞培养后24 h和48 h采用细胞生长分析系统检测各组细胞存活率.采用200 μmol/L CoCl2处理细胞以诱导建立RGC-5细胞缺氧损伤模型,然后将培养的细胞分为正常对照组、模型对照组和不同浓度Rapa干预组,Rapa干预组在缺氧模型细胞培养液中添加Rapa使其终浓度分别为0.1、0.4、1.6和6.4μmol/L,处理细胞24 h.采用细胞生长分析系统检测各组细胞的存活率;采用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测各组细胞凋亡率;采用JC-1染色技术检测各组细胞线粒体跨膜电位(△ψm)的变化;采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞促凋亡基因bax mRNA的相对表达量. 结果 200 μmol/L CoC12作用RGC-5细胞后24 h细胞相对存活率为(70.51±5.00)％,与正常对照组的(100.00±3.29)％比较,差异有统计学意义(P＜0.01),成功构建细胞缺氧损伤模型.正常对照组、模型对照组和0.1、0.4、1.6、6.4 μmol/L Rapa干预组细胞存活率的总体比较差异有统计学意义(F=167.904,P=0.000),其中0.1μmol/L Rapa干预组细胞存活率明显高于模型对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).正常对照组、模型对照组和0.1μmol/L Rapa干预组细胞凋亡率分别为25.4％、37.7％和25.3％,细胞线粒体膜电位分别下降了0.4％、6.3％和1.4％.正常对照组、模型对照组和0.1 μmol/L Rapa干预组细胞中baxmRNA相对表达量分别为1.01±0.21、3.52±0.30和1.66±0.20,总体比较差异有统计学意义(F=88.034,P=0.000),其中模型对照组细胞中bax mRNA相对表达量均明显高于正常对照组和0.1μmol/L Rapa干预组,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 Rapa可对CoC12诱导的缺氧RGC-5细胞发挥保护作用,其主要作用机制是下调细胞中促凋亡分子bax的表达,并提高RGC-5细胞存活率.     

氯离子通道阻滞剂对人眼小梁细胞增生及凋亡的影响

背景 氯离子通道阻滞剂5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸(NPPB)对家兔心肌细胞缺血-再灌注损伤时的细胞凋亡有促进作用,而小梁细胞上也存在ClC型氯离子通道及容积敏感性氯离子通道,但NPPB究竟会对小梁细胞的形态和功能产生什么影响尚不清楚. 目的 探讨氯离子通道阻滞剂NPPB对人眼小梁细胞增生及细胞周期、细胞凋亡的影响.方法 将处于对数生长期的永生株人眼小梁细胞进行培养并以1×106个/ml的密度接种于96孔培养板,将不同浓度(10、50、100 μmol/L)的NPPB分别加入小梁细胞培养基中,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组小梁细胞的增生情况以吸光度(A)值表示;采用流式细胞术测定小梁细胞的细胞周期.将100 mg/L 5-氟尿嘧啶(5-FU)加入培养的细胞中,而另一组培养的细胞中加入100 mg/L 5-FU+100μmol/L NPPB,用Annexin V-PI法检测各组小梁细胞的凋亡情况;罗丹明123法检测细胞线粒体膜电位(△ψm),分别评估各浓度NPPB对培养的人小梁细胞生长和存活的影响.结果 3种不同浓度的NPPB与小梁细胞共同孵育48 h后4个组小梁细胞的增生率差异有统计学意义(F=7.230,P=0.006),50 μmol/L、100μmoL/L NPPB作用后小梁细胞的A值明显低于10 μmol/L NPPB组,50 μmol/L NPPB组、100μmol/LNPPB组与空白对照组比较差异均有统计学意义(t=1.610,P=0.025;t=12.270,P=0.001).小梁细胞培养基中加入NPPB 48 h后,G0/G1期的细胞比例增多,S期细胞比例减少,各细胞周期小梁细胞的比例与未加NPPB的组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).用5-FU作用24 h及48 h后,100 mg/L 5-FU组和100 mg/L5-FU+100μmol/L NPPB组的细胞凋亡率均较其各自空白对照组增加(t24h=2.130,P=0.023;t48h=4.810,P=0.011);100 mg/L 5-FU+100 μmol/L NPPB组细胞凋亡率明显高于100 mg/L 5-FU组,差异均有统计学意义(t24h=1.980,P=0.037;t48h=1.290,P=0.028),小梁细胞线粒体膜电位降低,差异均有统计学意义(t24h=1.580,P=0.029;F48h=6.200,P=0.015).结论 氯离子通道阻滞剂NPPB可抑制小梁细胞增生,抑制小梁细胞通过G1/S期限制点进入S期;NPPB对5-FU诱导的小梁细胞凋亡有促进作用,与内源性线粒体凋亡通路相关.     

全反式视黄酸对诱导为神经元样细胞的脐带间充质干细胞分化和凋亡的影响

目的 观察不同浓度全反式视黄酸(ATRA)在诱导脐带间充质干细胞(MSC)向神经元样细胞分化中对细胞形态、增殖、凋亡的作用并筛选其最适诱导浓度.方法 实验研究.取生长良好的第3代脐带MSC接种于24孔培养板,细胞贴壁后培养基更换为含ATRA的DMEM/F-12培养液.ATHA终浓度分别为0 μmol/L(对照组,A组)、0.25 μmol/L(B组)、0.5 μmol/L(C组)、1.0 μmol/L(D组)、2.0 μmol/L(E组)、4.0 μmoL/L(F组),诱导后1 h、24 h观察细胞形态,并应用MTT法监测ATBA的细胞毒性.另取对照组和经各浓度ATRA诱导24 h后的细胞应用Annexin-V/PI联合流式细胞仪(FCM)检测凋亡细胞百分率和双标染色后的细胞着色情况,综合上述指标确定ATRA诱导脐带间充质干细胞向神经元样细胞分化的最适浓度.根据资料性质,对不同浓度ATRA作用24 h后各组间A值、细胞凋亡率进行比较,采用单因素方差分析,并应用t检验进一步进行两两比较;对照组和ATRA诱导组之间神经元样细胞阳性表达率的比较采用配对资料的t检验.结果 与对照组相比,ATRA(0.25 μmol/L、0.5 μmol/L)对MSC形态、细胞增殖、细胞凋亡均无明显影响(t=0.72,1.32;P>0.05);高浓度(4.0 μmoL/L)加入后即刻可见部分细胞浮起,24 h后无贴壁细胞;≥1.0 μmol/LATRA诱导24 h后能极显著抑制细胞增殖(t=8.8,18.9,22.1;P<0.01),且随ATRA浓度增加,抑制作用越明显.诱导24 h后,2.0 μmol/L组细胞回缩较1 h更明显,大部分细胞由长梭形回缩至类圆形,细胞质内出现粗大颗粒,部分细胞漂浮;1.0 μmoL/L组中仅有少数细胞有形态改变;Annexin-V/PI联合FCM检测显示≥1.0 μmol/L组细胞凋亡率与对照组间差异有统计学意义(t=9.88,19.95,31.6l;P<0.01).结论 0.5 μmol/L ATRA是诱导脐带MSC向神经元样细胞转化的最佳剂量,≥1.0 μmol/L能明显抑制MSC的增殖,增加细胞凋亡率并诱导细胞发生明显损伤.     

miR-34a/SIRT1在H2O2诱导人晶状体上皮细胞氧化应激中的表达

目的 观察微小RNA-34a(microRNA-34a,miR-34a)和沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)在不同浓度H2O2诱导的人晶状体上皮细胞(SRA01/04细胞)氧化应激中的表达变化.方法 用不同浓度的H2O2(0μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、300 μmol·L-1、400 μmol·L-1)处理细胞24 h后,用CCK-8检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率和RT-PCR检测miR-34a/SIRT1的表达.结果 CCK-8检测结果显示:100～400 μmol·L-1 H2O2对SRA01/04细胞有增殖抑制作用,且呈剂量依赖关系,与0μmol·L-1 H202组相比差异均有统计学意义(均为P＜0.01);流式细胞仪凋亡检测结果显示:0μmol·L-1 H2O2组细胞凋亡率为(6.1±1.2)％;100 μmol·L-1、200μmol·L-1、300 μmol·L-1 H2O2组细胞凋亡率分别为(26.3±1.8)％、(32.5±2.2)％、(64.7±5.3)％,各组与0μmol·L-1H2O2组比较,差异均有统计学意义(均为P＜0.01).RT-PCR检测结果显示:不同浓度H2 O2处理SRA01/04细胞后,细胞中的miR-34a表达水平呈剂量依赖性升高,而SIRT1表达水平呈相应下降,与0μmol·L-1 H2O2组相比差异均有统计学意义(均为P ＜0.001).结论 在一定浓度H2O2诱导的人晶状体上皮细胞氧化应激中,miR-34a表达水平显著增加,而SIRT1表达水平显著下降.下调miR-34a表达可增加氧化应激人晶状体上皮细胞存活率.     

组织因子靶向肽对蓝光诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

背景 视网膜光损伤可造成视网膜色素上皮(RPE)细胞损伤,是影响年龄相关性黄斑变性(AMD)发生和发展的重要因素之一.研究表明,组织因子(TF)在氧化损伤的RPE细胞中和AMD患者的脉络膜新生血管(CNV)中呈高表达,推测抑制TF可预防RPE细胞的损伤以及抑制CNV. 目的 观察TF靶向肽(TF-TP)对蓝光诱导的人RPE细胞损伤的保护作用. 方法 体外分离和培养人RPE细胞并分为空白对照组、蓝光照射组和TF-TP组.空白对照组细胞在常规条件下进行处理;蓝光照射组细胞用辐照强度为(4.0±0.5)mW/cm2的蓝光照射12h建立蓝光损伤细胞模型;TF-TP组先分别用不同浓度(10、100、150、200、300 μmol/L)TF-TP培养细胞24 h,再用蓝光照射12h.采用CCK-8法检测各组细胞的存活率;分别在普通倒置显微镜和透射电子显微镜下观察RPE细胞的形态和超微结构变化;采用Hoechst染色法检测各组细胞的凋亡情况;采用Western blot法检测各组细胞中TF蛋白和相关凋亡蛋白bax和bcl-2的表达.结果 不同浓度TF-TP组间RPE细胞存活率比较,差异无统计学意义(F=2.15,P=0.11).空白对照组、蓝光照射组和150 μmol/L TF-TP组细胞存活率分别为(100.0±0.00)％、(43.79±6.55)％和(63.45±3.57)％,150 μmol/LTF-TP组细胞存活率较蓝光照射组明显增加,差异有统计学意义(P=0.00),以150.μmol/L TF-TP为后续实验的最适浓度.光学显微镜下和透射电子显微镜下显示,蓝光照射组有较多皱缩、变形、悬浮细胞,可见细胞微绒毛数量减少,部分线粒体嵴断裂和缺失以及细胞空泡样变性,而150 μmol/L TF-TP组异常形态的细胞较少,细胞绒毛结构较完整,细胞质中空泡样结构改变和线粒体损伤改变明显减轻.空白对照组、蓝光照射组和150 μmol/L TF-TP组细胞凋亡率分别为(0.98±0.19)％、(9.98±0.82)％和(5.73±0.88)％,组间总体比较差异有统计学差异(F=206.18,P=0.00),其中150 μmol/L TF-TP组细胞凋亡率明显低于蓝光照射组,差异有统计学意义(P＜0.05).与空白对照组相比,蓝光照射组细胞中bax蛋白和TF蛋白的相对表达量明显增加,bcl-2蛋白的相对表达量显著下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05);与蓝光照射组相比,150 μmol/L TF-TP组细胞中bax蛋白和TF蛋白的相对表达量均明显下降,而bcl-2蛋白的相对表达量明显增加,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 TF-TP预处理后可减少蓝光损伤的人RPE细胞的凋亡及增加细胞的存活率,从而对蓝光诱导的人RPE细胞损伤发挥保护作用,其作用机制可能与TF-TP抑制TF介导的bax/bcl-2凋亡通路有关.     

橙皮苷对翼状胬肉成纤维细胞增殖及cyclin D表达的影响

目的：评价橙皮苷对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞(HPF)增殖的抑制作用及对周期蛋白D(cyclin D)表达的影响。

方法：将人翼状胬肉新鲜组织进行体外贴壁细胞常规培养,并采用免疫荧光染色法进行鉴定。通过MTT法检测不同浓度丝裂霉素C(MMC)(1.5、7.5、30.0μmol/L)和橙皮苷(24、48、64、72、96、120μmol/L)作用不同时间(24、48、72h)对细胞增殖的抑制,筛选适宜的作用浓度和时间。采用Western blot法检测cyclin D在HPF细胞中的相对表达量。

结果：分别采用48、72μmol/L橙皮苷和7.5μmol/L MMC作用于HPF细胞48h,Western blot检测结果显示,空白对照组(正常培养)、MMC组、48μmol/L橙皮苷组、72μmol/L橙皮苷组细胞cyclin D蛋白相对表达量分别为1.20±0.02、0.60±0.03、0.54±0.02、0.45±0.07(F=73.025,P=0.001),MMC组和橙皮苷组细胞cyclin D蛋白相对表达量均低于空白对照组(P<0.05),但MMC组和橙皮苷组(48、72μmol/L)细胞cyclin D蛋白相对表达量均无差异(P>0.05)。

结论：橙皮苷能抑制翼状胬肉HPF细胞增殖,该过程与其降低cyclin D的表达有关。