应用实时荧光定量PCR技术快速检测甲型H1N1流感病毒

目的:对疑似甲型H1N1流感患者标本进行病毒核酸检测确诊,探讨实时荧光定量PCR检测方法在流行性感冒检测诊断中的意义。方法:采用WHO标准实时荧光定量PCR方法对2009年6月～12月萧山地区采集的436份疑似甲型H1N1流感患者咽拭子标本进行病毒核酸检测,并对甲型H1N1流感病毒、甲1型流感病毒、甲3型流感病毒和乙型流感病毒进行快速分型。结果:436份咽拭子标本中有144份呈甲型H1N1流感病毒核酸阳性,阳性率33.03%,另检出甲1型流感病毒15份,甲3型流感病毒30份,没有检出乙型流感病毒。结论:实时荧光定量PCR方法操作方便、耗时短、特异性强、灵敏度高,可作为甲型H1N1流感疫情可靠的快速诊断方法。     

茂名市首例甲型H1N1流感病例的实时荧光RT—PCR检测

[目的]对茂名市首例甲型H1N1流感病例进行病毒核酸检测,为甲型H1N1流感疫情的防控提供参考。[方法]采用实时荧光逆转录PCR法对采集的病人咽拭子标本进行甲型H1N1流感病毒核酸检测。[结果]共采集病人2份咽拭子标本,其中1份咽拭子标本的实时荧光RT—PCR检测结果显示H1及N1的RT—PCR反应体系扩增曲线有明显对数增长且Ct值分别为25．21（H1）和25．07（N1）,为甲型H1N1流感病毒核酸阳性;另1份咽拭子标本则呈阴性。后采集第3份咽拭子标本连同第1分标本送广东省疾控中心复检,结果2份标本的甲型H1N1流感病毒核酸检测均为阳性。[结论]这名病人为福建省第2例甲型H1N1流感病毒感染者的密切接触者,由于及时采用灵敏度高,特异性强,检测时间短的实时荧光逆转录PCR方法检测,快速确诊了病例,为疫情的控制争取了时间,防止了2代病例的出现。     

2017年云南省流感病毒监测及甲型H1N1流感病毒血凝素基因特征分析

目的 了解2017年云南省流感病毒的流行情况和甲型H1N1流感病毒的血凝素（HA）基因分子特征。方法 对2017年云南省流感监测哨点医院采集的21 672份标本使用real - time RT - PCR方法检测流感病毒,核酸阳性标本使用MDCK细胞进行病毒分离,采用血凝素凝集试验及抑制试验进行病毒抗原性分析。选取12株抗原性变异较大的甲型H1N1流感毒株进行基因测序,使用MEGA软件分析其HA基因特征。结果 2017年共检出流感核酸阳性标本2 372份,分离出流感毒株1 180株,全年共有2个流行高峰,H3亚型和甲型H1N1亚型交替成为优势株,BY亚型和BV亚型共同流行。毒株分离高峰与ILI%高峰基本一致。甲型H1N1流感病毒ＨＡ基因无明显变异,疫苗株仍具有保护作用。结论 继续加强监测力度,提高监测敏感性并做到及时预警,控制流感流行风险。     

甲型H1N1流感病毒实时荧光RT-PCR检测法的建立及其在南京地区甲流防控早期的应用

[目的]建立并应用Taqman探针实时荧光RT-PCR法10μl检测体系对91例输入性甲型H1N1流感疑似病例及密切接触者进行病毒核酸特异、灵敏、快速的检测和感染排除。[方法]采用美国CDC公布的探针和引物序列,比较了两种反应条件(无预扩增、有预扩增)和10μl、12.5μl及25μl3种反应体系的扩增效率;用预扩增10μl体系对季节性流感病毒核酸进行扩增;用预扩增程序及10μl体系对南京市91例输入性疑似病例及密切接触者的样本进行扩增,同时设置阳性对照和阴性对照。[结果]应用美国CDC公布的探针和四对引物序列,3种反应体系对甲型H1N1流感病毒都可以获得有效扩增,而且应用3种反应体积的扩增CT值没有统计学差异(P﹥0.05)。增加预扩增的反应条件下敏感度有显著提高(P﹤0.05)。用10μl反应体系及增加预扩增程序对季节性流感病毒核酸进行扩增,第2对引物(猪流感通用引物)与第3对引物(甲型H1N1流感引物)未获得阳性扩增曲线,甲1、甲3亚型病毒核酸的扩增只有第一对引物(甲型通用引物)与第四对引物(阳性内参)获得阳性扩增曲线,对乙型流感病毒核酸的扩增只获得阳性内参的扩增曲线。对南京市91例输入性甲流疑似病例及密切接触者进行了有效检测和感染排除,并检测到第一例输入性甲型H1N1流感病毒感染病例,其四对引物扩增结果均为阳性。[结论]该检测方法对甲型H1N1流感病毒有高度的特异性,对甲型流感病毒有通用性,10μl反应体系及增加预扩增程序可从疑似甲型H1N1流感患者鼻咽拭子中直接检测甲型H1N1流感病毒核酸,该方法可用于甲型H1N1流感病毒的日常检测并大大降低检测成本。     

双重实时荧光PCR对流感病毒检测及分型方法的研究

目的:建立双重实时荧光PCR方法用于流感病毒检测,实现对新甲型H1N1流感病毒,H1和H3亚型季节性流感病毒,H5和H9亚型禽流感病毒的亚型区分。方法:根据GenBank公布的基因序列,针对M基因保守区设计引物和探针,用于流感病毒检测和定量;针对HA基因设计引物和探针,用于病毒分型。建立和优化双重实时荧光PCR反应体系,进行敏感度和特异性评价,同时对32份已知亚型的流感病毒样本进行检测,验证所建方法的实用性。结果:基于M基因的实时荧光PCR方法定量范围为5×101到5×108个目的拷贝。经优化的双重实时荧光PCR方法对不同亚型流感病毒的检测灵敏度在50～500拷贝之间,各亚型之间没有交叉反应。建立的方法能够检测出本研究涉及的所有流感病毒标本,分型准确率达到96.9%。结论:建立的双重实时荧光PCR方法具有敏感度高,特异性好等优点,实现对流感病毒样本准确分型,适用于流感的鉴别诊断及病毒载量测定。     

应用2种TaqMan-荧光定量PCR法快速检测甲型H1N1流感病毒

[目的]应用达安基因H1和N1两对引物检测试剂盒及美国CDC四对引物探针法对流感样病例进行核酸检测,以快速排除甲型H1N1流感病毒的感染.[方法]采用达安基因H1和N1两对引物检测试剂盒对流感样病例进行核酸检测,这些样本同时以美国CDC公布的针对甲型H1N1流感病毒的探针和引物序列以及国家CDC提供的针对季节性流感病毒的探针和引物序列进行检测,与达安基因的甲型H1N1试剂盒进行特异性、准确性的比较.[结果]达安基因甲型H1N1试剂盒和美国CDC的甲型H1N1四对引物法对季节性流感甲1、甲3、乙型的扩增都为阴性,对甲型H1N1确诊病例的病毒核酸扩增都是阳性,应用国家CDC的探针和引物检测为流感病毒核酸阴性的样本用达安基因的甲型H1N1试剂盒及美国CDC的甲型H1N1四对引物法的检测结果也都为阴性.[结论]达安基因的甲型H1N1试剂金及美国CDC的甲型H1N1四对引物法对甲型H1N1流感病毒的检测有高度的特异性,可从疑似甲型H1N1流感患者鼻咽拭子中直接检测流感病毒核酸.     

实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用

目的探讨实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用效果。方法选取2009年9月—2013年12月在我州采集的流感样病例咽拭子2489件进行分析,采用实时荧光定量PCR对流感病毒核酸进行检测,观察检测阳性率和阳性样本的类型,以分析流感的流行趋势。结果 2009年9月—2013年12月共检出流感病毒核酸阳性676件,检测阳性率为27.16%;其中甲型H1N1病毒472件,占69.82%;季节性甲3亚型病毒126件,占7.54%;季节性甲1型病毒21件,占3.11%;乙型病毒6件,占0.89%;各类型流感病毒发生率之间差异具有统计学意义（P〈0.05）。每年6-9月甲型H1N1病毒流感呈上升趋势,在10-11月达到高峰期;6-9月以季节性甲3亚型病毒为主要流行病株,10-11月甲型H1N1病毒成为主要流行病株。结论实时荧光定量PCR是一种科学有效的检测方法,可对流感病毒核酸进行快速、准确的检测,分析流感病毒的流行规律,有效预防突发公共卫生事件的发生。     

甲型H1N1流感病毒real-time RT-PCR检测方法的研究与应用

[目的]建立一种特异、灵敏、快速的Real-Time RT-PCR方法用于检测甲型H1N1流感病毒核酸.[方法]采用WHO所推荐的引物与探针序列,对Real-Time RT-PCR反应体系和反应条件进行调整优化,检测该方法的特异性和灵敏度.并对疑似甲型H1N1流感病例咽拭子标本进行检测.[结果]该方法对甲型H1N1流感病毒的检测的灵敏度达10-7(HA滴度为1:128),可从疑似甲流感患者咽拭子中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需2.5 h左右.[结论]建立的TagMan探针法Real-Time RT-PCR是一种检测甲型H1N1流感病毒的快速、特异、敏感的新方法,适合于基层疾控机构及医院开展甲型H1N1流感的应急检测.     

泉州市2009年甲型H1N1流感基因特性分析

目的 了解福建省泉州市2009年甲型H1N1流感病毒的HA和NA基因特征,探讨该病毒的遗传变异及分子特性.方法 采集泉州市甲型H1N1流感患者咽拭子,采用实时荧光聚合酶链反应方法检测病毒核酸及MDCK细胞培养进行病毒分离、鉴定,提取其中2株代表性毒株病毒核糖核酸(RNA),采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒HA和NA基因,纯化产物进行核苷酸序列测定,用DNAstar megalign软件进行序列分析.结果 1 020份咽拭子检出甲型H1N1流感病毒核酸阳性200份;季节性流感病毒核酸阳性70份,其中H3N2亚型53份,H1N1亚型14份,B型3份,并分离到29株甲型H1N1流感病毒株;HA基因核苷酸序列测定显示,该毒株与北美流行株高度同源,由HA基因核苷酸序列推导的氨基酸系列与疫苗株A/Brisbane/59/2007比较,有22个位于抗原决定簇的氨基酸位点发生变异,但受体结合特异性仍为人样受体,NA基因耐药性位点分析显示,对达菲药物依然敏感.结论 2009年泉州市甲型H1N1流感流行毒株与北美流行株高度同源,相对于疫苗代表株出现了HA蛋白抗原性漂移.     

镇江地区流感哨点对新甲型H1N1流感的预警作用

目的应用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)快速检测技术对镇江地区流感哨点医院流感样病例定期检测,为预警疫情提供科学依据。方法每周采集镇江市3家哨点医院的流感样病例和暴发疫区现患病例的咽拭子标本以及部分流感样病例血清标本。应用实时荧光定量PCR方法进行核酸检测,对部分流感样血清标本用血凝抑制试验方法进行H1亚型抗体检测,并对检测结果进行趋势分析。结果 2229份哨点医院采集的标本中检测出流感核酸阳性标本750例,其中423份为新甲型H1N1,293份为H3N2,8份为H1N1,26份为B型;356份暴发疫情采集的标本中检测出流感核酸阳性标本165例,其中112份为新甲型H1N1,51份为H3N2,2份为B型。哨点医院流感时间趋势,2009年6～7月以B型流感为主,8～9月转变为H3N2型流感流行,10～12月新甲型H1N1普遍流行。暴发疫情6月份出现首例新甲型H1N1,7月和8月新甲型H1N1呈现局部暴发,9～12月新甲型H1N1病例显著增加。362份流感样病例检测出H1亚型抗体阳性标本85例,阳性率为23.48%。结论应用哨点医院的流感样病例检测结果,可预测流感的变化趋势,提前采取控制...     

菏泽市2009～2010年甲型H1N1流感病毒监测分析

目的 了解菏泽市人群感染甲型H1N1流感病毒的情况.方法 采集哨点医院流感样病例、暴发疫情及重症病例的鼻、咽拭子标本,采用荧光定量PCR进行流感病毒核酸检测.结果 2009年9月～2010年6月,共检测493例标本,甲型H1N1流感病毒核酸阳性210例,检出率42.60％.确诊病例男女比例为1∶1.04,主要集中在5～29岁(80.48％);分布在8个县区;11月份和12月份确诊病例占确诊病例总数的71.91％.结论 菏泽市甲型H1N1流感确诊病例以学生和青壮年人群为主,2009年11月份和12月份是流行高峰.     

河南省甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

目的分析河南省甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的变异情况,了解其变异现状及特点。方法对35株甲型H1N1流感病毒毒株提取病毒总RNA,设计引物运用RT-PCR技术扩增编码NA蛋白的基因序列,测序分析核酸序列并用MEGA4.1软件构建进化树,用BLAST进行比对分析。结果分离株NA基因316位G/A和742位A/G(N端106位V/I和248位N/D)发生变异,2个突变位点同时存在;同时,通过BLAST分析,发现我国多个省份和亚洲其它多个地区病毒株NA基因存在945位A/G和1 338位T/C突变,进化树分析发现,这两个位点的突变可能来自于中国猪-人之间相互感染。结论甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因在中国内地传播期间个别核酸位点发生了突变,其氨基酸抗原区有一位点发生变异(106 V/I)。     

长沙市甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因序列分析

目的对长沙市甲型H1N1流感病毒A/changsha/78/2009的神经氨酸酶（neuraminidase,NA）基因进行测序分析,以期了解该病毒的来源及变异情况。方法利用国家流感中心（CNIC）和世界卫生组织（WHO）推荐的NA基因测序引物和CEQTM8000 Genetic Analysis System对2009年长沙市甲型H1N1流感患者阳性鼻咽拭子标本（A/changsha/78/2009）进行测序,测序结果提交至GenBank并利用Lasergene和Mega5软件对测序结果进行氨基酸比对和进化树分析。结果 A/changsha/78/2009 NA基因GenBank登录号为：GQ463958.1,与瑞典斯德哥尔摩甲型H1N1流感病毒分离株A/Stockholm/37/2009（H1N1）核苷酸同源性为100%;进化树分析显示A/changsha/78/2009 NA基因属于欧亚猪流感分支,包含A/changsha/78/2009在内的甲型H1N1流感病毒与A/swine/Spain/WVL6/1991（H1N1）亲缘关系近;A/chang-sha/78/2009与A/swine/Spain/WVL6/1991 NA基因均有7个潜在糖基化位点,A/changsha/78/2009 NA基因未发生H274Y位点突变。结论包含A/changsha/78/2009在内的甲型H1N1流感病毒NA基因可能来源于欧亚猪流感病毒,A/changsha/78/2009病毒对神经氨酸酶抑制剂类药物敏感。     

Co-circulation of pandemic 2009 H1N1, classical swine H1N1 and avian-like swine H1N1 influenza viruses in pigs in China

The pandemic A/H1N1 influenza viruses emerged in both Mexico and the United States in March 2009, and were transmitted efficiently in the human population. They were transmitted occasionally from humans to other mammals including pigs, dogs and cats. In this study, we report the isolation and genetic analysis of novel viruses in pigs in China. These viruses were related phylogenetically to the pandemic 2009 H1N1 influenza viruses isolated from humans and pigs, which indicates that the pandemic virus is currently circulating in swine populations, and this hypothesis was further supported by serological surveillance of pig sera collected within the same period. Furthermore, we isolated another two H1N1 viruses belonging to the lineages of classical swine H1N1 virus and avian-like swine H1N1 virus, respectively. Multiple genetic lineages of H1N1 viruses are co-circulating in the swine population, which highlights the importance of intensive surveillance for swine influenza in China.     

玉林市流行性感冒监测结果分析

目的:了解玉林市流感病毒的流行趋势及主导病毒的交替规律。方法:采集咽拭子标本,应用荧光定量PCR技术检测。结果:2009年4月-2012年3月共检测流感阳性病例396例。2009年-2010年流行期以A(甲型H1N1)亚型流感病毒占优势,2010年-2011年流行期A(H3N2)亚型流感病毒与A(甲型H1N1)亚型流感病毒同时流行,2011年-2012年流行期B型流感病毒占优势。我市流感病毒流行高峰期一般在10月到次年的3月之间。结论:通过不同年份流感实验室监测结果的分析,对了解玉林市流感流行特点、亚型分布具有重要意义。     

Pandemic H1N1 influenza virus-like particles are immunogenic and provide protective immunity to pigs

The outbreak of the 2009 influenza pandemic underscored the important role of swine in influenza virus evolution and the emergence of novel viruses with pandemic potential. Vaccination is the most common practice to control swine influenza in swine industry. Influenza virus-like particle (VLP) vaccines are an alternative approach and have been demonstrated to be immunogenic and confer protection against influenza virus challenge in chickens, mice and ferrets. In this study, we generated VLPs consisting of HA, NA and M1 proteins derived from pandemic virus A/California/04/2009 in insect cells. The immunogenicity and efficacy following vaccination of VLPs were evaluated in swine. Our data showed that vaccination using VLPs elicited robust levels of serum IgG, mucosal IgA, and viral neutralizing antibodies against A/Sw/Manitoba/MAFRI32/2009 H1N1. Following challenge with pandemic H1N1 2009, vaccinated pigs were protected, displaying reduced lung lesions, virus shedding and inhibition of virus replication in the lungs compared to non-vaccinated control pigs. Thus, VLPs can serve as a promising vaccination strategy to control influenza in swine.     

一起外轮群体性甲型H1N1流感病例的实验室检测及分析

目的分析、溯源一起外籍船员群体性流感的原因。方法结合流行病学调查结果,采集所有船员的鼻咽拭子,处理后利用实时荧光PCR法对样本进行甲型流感、乙型流感、禽流感、甲型H3N2流感及新型甲型H1N1流感的检测;同时对所选样本进行RT-PCR确证检测及HA基因测序分析并构建分子进化树。结果实时荧光PCR检测结果显示,6例患者的甲型流感病毒及新型甲型H1N1流感病毒检测均为阳性,但均未检出乙型流感、禽流感及甲型H3N2流感病毒;RT-PCR确证实验以及HA基因测序结果也表明为新型甲型H1N1流感病毒阳性。结论引起本次群体性流感事件的原因为新型甲型H1N1流感病毒感染。分子进化分析表明,引起本次流感事件的病毒株与从香港分离得到的病毒株属同一分支。     

Reassortant Pandemic (H1N1) 2009 virus in pigs, United Kingdom

Surveillance for influenza virus in pigs in the United Kingdom during spring 2010 detected a novel reassortant influenza virus. This virus had genes encoding internal proteins from pandemic (H1N1) 2009 virus and hemagglutinin and neuraminidase genes from swine influenza virus (H1N2). Our results demonstrate processes contributing to influenza virus heterogeneity.     

An elastase-dependent attenuated heterologous swine influenza virus protects against pandemic H1N1 2009 influenza challenge in swine

Influenza virus infections continue to cause production losses in the agricultural industry in addition to being a human public health concern. The primary method to control influenza is through vaccination. However, currently used killed influenza virus vaccines must be closely matched to the challenge virus. The ability of an elastase-dependent live attenuated influenza A virus was evaluated to protect pigs against the pandemic H1N1 2009 influenza virus. Pigs vaccinated intranasally or intratracheally with the elastase-dependent swine influenza virus (SIV) vaccine had significantly reduced macroscopic and microscopic lung lesions and lower viral loads in the lung and in nasal swabs. Thus, elastase-dependent SIV mutants can be used as live-virus vaccines against swine influenza in pigs. In addition, low levels of cross-neutralizing antibodies to H1N1 2009 were elicited prior to challenge by the swine adapted H1N1 avian strain vaccine.     

金华市首例甲型H1N1流感死亡病例病毒分离及HA基因序列分析

目的分离甲型H1N1流感病毒,分析金华市首例甲型H1N1流感死亡病例病毒分离株HA基因序列特征,为研究病毒进化、致病性、流行规律提供科学依据。方法采用MDCK细胞和real-time PCR法进行病毒分离、鉴定;提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增其HA基因片段,测定核苷酸序列;利用GeneBank中相关序列对病毒分离株A/Jinhua/01/2009（H1N1）进行基因进化树分析。结果从3份咽拭子样本中分离出1株甲型H1N1流感病毒。HA基因序列分析证明：该毒株与2009年大流行株高度同源,与古典型猪流感亲缘性较近,与欧亚地区分离的A/H1N1猪流感病毒及A/H1N1禽流感病毒进化关系较远。结论金华市首例甲型H1N1流感死亡病例分离病毒株与北美流行株高度同源,可能是由古典型猪流感进化而来,与WHO选定的甲型H1N1疫苗候选株同源性较高,对于人季节性流感A/H1N1疫苗可能不敏感。