抗华支睾吸虫循环抗原噬菌体抗体基因分析

目的 对获得的抗华支睾吸虫循环抗原Fab抗体克隆进行基因分析.方法 将2株阳性克隆抗体基因进行测序,并用NCBI和Ig Blast Analysis of Immunog lobulinse quences中的分析软件,对其推导的氨基酸序列进行分析,再进一步模拟它们的二级结构.结果 E38、B05阳性克隆抗体基因与人免疫球蛋白κ轻链和γ重链可变区基因高度同源.推导的氨基酸序列均具有典型的抗体轻、重链可变区特征.用分析软件对推测的2株克隆轻链和重链Fd氨基酸序列进行二级结构模拟,结果显示以β-折叠和转角为主的平行肽链形成片层样结构,均符合抗体二级结构构型.结论 E38、B05阳性克隆外源基因均属于人免疫球蛋白κ轻链和γ重链可变区基因.     

5种食源致病菌16SrRNA基因单链构象多态性分析

目的 对5种常见食物中毒致病菌16SrRNA基因单链构象多态性(Single-strand-conformationpolymorphism,SSCP)进行分析,探讨该技术在食物中毒致病菌快速鉴别诊断中的可能作用.方法 5种常见食源性致病菌标准株增菌后,提取DNA,通过特异引物对菌株的16SrRNA序列的可变区进行扩增,扩增产物进行SSCP分析.结果 各菌株均分离出两条或以上特异性条带,条带间距离及相对位置差异明显,并有良好的重复性.该方法的灵敏度可达10～15个鼠伤寒沙门菌细胞.结论 5种常见食物中毒致病菌16SrRNA基因单链构象多态性具有种属特异性,PCR-SSCP分析法有助于快速、准确的从基因水平上对食物中毒致病菌进行分析检测.     

猪带绦虫成虫EF-1基因生物信息分析及原核表达

目的 分析和预测猪带绦虫成虫延伸因子(elongation factor-1,EF-1)基因及其编码蛋白的结构域特性,并进行原核表达.方法 利用在线生物信息学网站及工具进行序列分析、预测其编码的延伸因子的理化特性、抗原表位、翻译后的修饰、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构、三维空间构象等,将其编码区序列克隆岛原核表达载体pET-28 a(+)上,测序鉴定重组质粒.结果 该基因全长1 657 bp,编码区为186~1 533 bp,编码448个氨基酸,为全长基因;无跨膜区,具有多个磷酸化位点,蛋白的理化性质稳定,理论分子量为49 011.5 Da;没有质体、线粒体定位序列;十二烷基-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果表明,目的基因在大肠埃希菌BL21~DE3中表达成功.结论 发现猪带绦虫成虫延伸因子基因,成功构建重组原核表达质粒.     

麻疹患儿外周血T淋巴细胞及杀伤细胞分析

目的 探讨麻疹患儿外周血T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞的变化。方法 收集麻疹患儿174例作为病例组,以门诊健康体检婴幼儿作为对照组;采集外周血细胞,用标记荧光的抗体进行染色,流式细胞仪分析麻疹患儿T淋巴细胞和NK细胞的变化。结果 麻疹患儿CD₈细胞百分率为(24.98±8.24)%,NK细胞百分率为(13.14±6.49)%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);2组间CD₃、CD₄细胞百分率及CD₄/CD₈比值差异无统计学意义(P>0.05);麻疹患儿中,麻疹病毒高活性组CD₃细胞为(2586.54±1635.90)个/μL,CD₄细胞为(1450.06±849.06)个/μL,均低于麻疹病毒低活性组(分别为(3527.36±1912.88),(2046.43±900.92)个/μL),差异均有统计学意义(P<0.05);2组间CD₈细胞和NK细胞差异无统计学意义(P>0.05)。结论 测定麻疹患儿外周血T淋巴细胞和NK细胞变化有助于评价麻疹患儿感染早期的免疫状况,而且对判断病毒复制的活跃程度具有重要价值。     

小鼠喂养低铅饲料对细胞免疫功能的影响

目的 探讨小鼠喂养低铅饲料对细胞免疫功能的影响.方法 将幼年小鼠分成6组,分别给予含有不同剂量铅的饲料8周,观察分析喂养低铅饲料后小鼠T细胞亚群CD₄、CD₈分布,血清TNF-α含量,并测定小鼠脾脏系数.结果 8周后各低铅饲料组与正常对照组T细胞亚群分布异常,CD₄明显减少,CD₄/CD₈比例下降,而各低铅饲料组与正常组之间差异均有显着性意义(P<0.05);血清TNF-α分泌异常,最低剂量组TNF-α明显高于正常对照组,而其余各组显着降低;各组脾脏系数与对照组比较明显降低.结论 喂养低铅饲料可造成小鼠细胞免疫功能的受损,免疫器官结构受损,在无明显铅中毒症状时,免疫功能已受到损害.     

心肌肌球蛋白及其重链的研制、特性鉴定和应用

目的 分离、提纯人心肌肌球蛋白(HCM)及其重链(HCMHC),为心肌显像及其显像剂抗HCMHC抗体的研究打基础。方法 参考猪心肌肌球蛋白制备方法,做了较大改进后,提取了HCM,用盐酸胍裂解HCM制备了HCMHC。用SDS-PAGE(梯度)电泳测定分子质量,用检测无机磷的方法测定HCM的ATP酶活力,用Ellman氏试剂测定游离巯基。将HCMHC免疫动物,用ELISA法测定了血清抗体效价。结果 HCMHC的相对分子量为200×10³,纯度大于80%;被免疫的BALB/C小鼠血清的抗体滴度最高达10⁷,细胞融合率达80%。结论 研制的HCMHC具有良好的免疫学活性,为下一步抗HCMHC单链可变区抗体(ScFv)及其放射性核素受体显像的研究打下了基础。     

牛带绦虫ATE基因功能预测及原核表达

目的 分析和预测牛带绦虫成虫精氨酰-tRNA转移酶(arginyl-tRNA-protein transferase,ATE)基因及其编码蛋白的结构域特性,并进行原核表达.方法 利用在线生物信息学网站及工具对牛带绦虫精氨酰-tRNA转移酶基因的功能进行预测并将其编码区序列克隆到原核表达载体pET-28 a(+)上,测序鉴定重组质粒.结果 该基因全长1 476 bp,编码区为141~1 617 bp,编码491个氨基酸;该基因为全长基因,无跨膜区,具有多个磷酸化位点,蛋白的理化性质稳定,理论分子量为56 436.3Da;没有质体、线粒体定位序列;十二烷基-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果表明,目的基因在大肠埃希菌BL21~DE3中表达成功.结论 筛选出牛带绦虫成虫精氨酰-tRNA转移酶基因,成功构建重组原核表达质粒.     

亚洲牛带绦虫自吞噬相关蛋白3基因克隆及表达

目的 从亚洲带绦虫成虫cDNA质粒文库中识别并预测自吞噬相关蛋白(autophagy related protein3-like,APG3)基因,并将该基因进行克隆表达,为进一步研究其生物学功能提供基础依据.方法 利用生物信息网站及其他分析软件包,分析该蛋白质理化特性等,并将其克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,经PCR、双酶切及测序鉴定之后诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定.结果 该基因全长为1 331 bp,编码区为92~1099,编码335个氨基酸,理论分子量、等电点分别为37 498.5 Da和4.71.PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-Ta APG3重组质粒构建成功.经过尿素破包涵体法得到纯化蛋白.结论 发现亚洲牛带绦虫APG3基因,成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白.     

shRNA表达载体构建及其对HBV体外抑制作用

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)基因X区和P区的shRNA表达载体,通过纳米聚合物将其转入HBV感染的细胞模型,并检测其对HBV复制的抑制作用。方法设计3条针对HBV基因编码区的干扰RNA序列,合成3对64nt的寡核苷酸,插入载体pRNAT-U6,构建重组干扰质粒Sl、S2和S3,利用纳米转染剂转入HBV感染的HepG2细胞。用实时荧光定量法检测HBVmRNA含量。结果干扰质粒S1、S2对HBv的复制有明显抑制作用,荧光定量检测转染后HBVmRNA表达水平发现,HBVmRNA含量分别减少至空白对照组的70.2%和61.2%,无关对照质粒则无抑制作用。结论成功构建针对HBv编码区的shRNA表达载体,并能在体外有效抑制HBVmRNA。     

乙肝病毒核心抗原人源单链可变区抗体的筛选

目的　筛选、鉴定乙型肝炎病毒 (HBV)核心抗原 (HBcAg)蛋白的人源单链可变区抗体 (ScFv)的编码基因 ,为细胞内表达小分子单链抗体的研究及抗HBV的基因治疗研究奠定基础。方法　采用噬菌体表面展示技术 ,以HBcAg蛋白为固相抗原 ,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过 5轮“吸附 -洗脱 -扩增”筛选过程 ,获得抗原结合活性较强的HBcAg人源单链可变区抗体阳性克隆 ,并对其进行免疫检测及序列测定。结果　筛选得到的ScFv片段编码基因为 771nt,编码的产物由 2 5 7个氨基酸残基组成 ,具有典型的轻链和重链可变区结构特点以及与HBcAg结合的特异性。结论　利用噬菌体抗体库技术成功地获得了HBcAg人源单链可变区抗体的编码基因 ,并获得了可溶性单链抗体的表达。     

抗类风湿人源单链抗体库的制备及筛选

目的 通过噬菌体展示技术构建抗类风湿人源单链抗体库,为其进一步的临床应用研究奠定基础。方法提取患者外周淋巴细胞总RNA,逆转录合成cDNA,以人源免疫球蛋白H链和L链可变区的扩增引物,分别扩增出H链和L链可变区基因。采用SOE—PCR法将VH和比片段随机拼接成scFv片段,并克隆入噬菌粒载体pCANTAB5E中,构建噬菌体单链抗体库。结果初级库库容量为3×10^6,在大肠杆菌TG1中重组后得到1．2×10^6的次级抗体库。结论本研究成功构建类风湿人源单链抗体库,拟为类风湿病的预防、诊断、治疗奠定基础。     

用体外致敏的鼻咽癌患者B细胞构建全人源噬菌体单链抗体库

目的构建全人源抗鼻咽癌噬菌体单链抗体库，为筛选鼻咽癌相关抗原的抗体奠定基础。方法采用体外致敏与EB病毒（EBV）转化鼻咽癌患者的外周血单个核细胞（PBMC），提取总RNA，用RT—PCR技术扩增人抗体重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因，用编码（Gly4Ser）3的互补序列连接成单链抗体ScFv基因（VH-linker—VL），并克隆到噬菌粒载体FUSE5，转化大肠杆菌MC1061，构建噬菌体呈现型ScFv库。结果成功地构建了全人源抗鼻咽癌噬菌体单链抗体库，库容量为6．5×10^7，约100％的噬菌体基因中有ScFv基因的插入。结论联合应用体外致敏和EBV转化及噬菌体呈现技术构建全人源抗鼻咽癌噬菌体单链抗体库是可行的，这为进一步筛选鼻咽癌相关抗原的抗体奠定了基础。     

小鼠ScFv基因片段的构建

目的 利用分子重组技术构建小鼠单链抗体片段(ScFv)。方法 采用PCR反应从小鼠脾细胞扩增鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区，利用连结引物将重链和轻链DNA组装成单链抗体(ScFv)片段。结果 克隆出VH，VL基因，用Linker将VH，VL连接起来后的ScFv构建成功，其分子量为750bp。结论 ScFv分子小，异源性低，可以结合与噬菌体载体中形成融合蛋白表达．该技术是抗体制备的一种简便、可靠的方法。     

鼠源抗烟曲霉单链抗体库制备及鉴定

目的 构建鼠源抗曲霉菌单链抗体（scFv）噬菌体展示文库并进行初步鉴定,为制备用于侵袭性曲霉感染实验室诊断的特异性抗体提供新的方法。方法 利用噬菌体展示技术构建鼠源抗烟曲霉半乳甘露聚糖（GM）ScFv库,经过4轮“吸附-洗脱-扩增”淘选富集,随机挑选克隆进行可变区基因测序确定文库多样性,并用phage-ELISA筛选烟曲霉特异性结合的克隆。结果 构建的scFv噬菌体表达文库,库容量约为1.8×10⁷;经4轮富集筛选,洗脱的表达scFv噬菌体滴度渐增;随机挑选出4轮筛选后的20个克隆,其可变区基因序列不同;随机挑选出4轮筛选后的90个克隆,其中6个克隆与烟曲霉GM特异性结合,而与对照的白假丝酵母菌无结合。结论 构建并初步鉴定了抗曲霉菌单链抗体库,库容量大,VH和VL区具备多样性;筛选的scFv与曲霉菌GM特异性结合,提供了快速制备、筛选GM高特异性抗体分子的新方法。     

2003—2007年中国1 060起细菌性食源性疾病流行病学特征分析

目的制备用于检测肉制品中沙门菌实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准质粒。方法设计针对沙门菌invA基因的引物,扩增特异片段,转入质粒载体中构建重组质粒。将构建的重组质粒作为标准品,进行优化后的实时荧光定量PCR,建立标准曲线,并考察该标准品灵敏性及稳定性。结果成功构建含有沙门菌invA基因的质粒标准品,用其建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板的拷贝数呈良好线性关系(r²=0.9979),最低可以检出10拷贝/反应。该标准质粒经验证具有良好的稳定性。用该质粒标准品检测肉制品中的沙门菌,经2 h增菌后,可在7 h内完成对样品的检测。结论所构建的质粒标准品可用于荧光定量PCR检测肉制品中的沙门菌,为考量实验质量提供参考依据。     

弓形虫肌动蛋白表达及其抗血清制备

目的体外制备弓形虫肌动蛋白(actin)及其多克隆抗体。方法以弓形虫cDNA链为模板,PCR扩增actin基因,亚克隆至pET30a载体,转化到大肠埃希菌BL21中;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达actin-His₆蛋白;用纯化的蛋白加免疫佐剂免疫SD大鼠,收集抗血清,制备多克隆抗体,抗体亲和纯化柱纯化并分析抗体的效价。结果actin基因的PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,在1 000 bp附近有一条带,与目的基因(actin cDNA长度为1 131 bp)大小相符;actin/pET30a重组质粒经BamHI和XhoI双酶切, 1.0%琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物,在1 000和5 000 bp附近可见条带;actin-His₆蛋白在3~4 h时表达量达到峰值;蛋白可溶性分析显示,actin-His₆蛋白主要以包涵体的形式存在;获得了抗actin-His₆蛋白的大鼠源性抗血清。结论弓形虫actin蛋白在原核系统中得到了表达,用该蛋白免疫动物后获得了抗血清。     

结核杆菌PEPCK表达及保护性免疫反应效果

目的研究结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(PEPCK)的表达,并观察此融合蛋白使机体产生的保护性免疫反应。方法将含有结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(pckA)基因的重组质粒转化大肠埃希菌HB₁₀₁,表达出融合蛋白PEPCK,并进行蛋白质印迹(Western blot)分析;选BALB/c小鼠60只,随机分为实验组和对照组。实验组每只小鼠用表达的PEPCK 10μg加弗氏不完全佐剂进行腹腔免疫注射,对照组小鼠仅用弗氏不完全佐剂注射。每隔2周免疫1次,共免疫3次。末次免疫2周后,分别取小鼠脾脏、血清,检测CD4⁺T细胞和CD8⁺、T细胞及各细胞因子。结果成功表达出融合蛋白PEPCK,并能够与小鼠抗卡介苗(BCG)血清反应;实验组小鼠的脾脏明显增大,粘连严重;CD4⁺T细胞增殖明显(73.5±3.69),CD4⁺/CD8⁺比值显著升高(5.1±0.98)(P<0.01);血清中γ干扰素(IFN-γ)、白介素12(IL-12)和α肿瘤坏死因子(TNF-α)均有不同程度的升高。结论PEPCK能够诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应,是很好的抗结核疫苗候选分子之一。     

脑膜炎球菌多糖疫苗安全性及免疫原性评价

目的评价A、C、W₁₃₅和Y群脑膜炎球菌多糖疫苗在2~30岁健康人群中接种的安全性与免疫原性。方法采用随机、双盲和平行对照的设计方法,对A、C、W₁₃₅和Y群脑膜炎球菌多糖疫苗接种人群不良反应发生率、抗体阳转率、平均几何滴度(GMT)进行比较。结果免疫后对照组与试验组总体不良反应发生率分别为11.21%和13.79%,其中全身反应发生率分别为6.06%和5.30%,局部反应发生率分别为6.06%和9.85%;免疫后28d,试验组A、C、W₁₃₅和Y群抗体阳转率均>94.00%,A和C群抗体阳转率与对照组比较差异均无统计学意义(均P>0.05),W₁₃₅和Y群抗体阳转率与对照组比较差异有统计学意义,试验组高于对照组;免疫后抗体GMT分别为A群=394.81、C群=237.32、W₁₃₅群=326.00、Y群=226.45,均达到保护性水平。结论A、C、W₁₃₅和Y群脑膜炎球菌多糖疫苗在2~30岁健康人群中接种有较好的安全性和免疫原性。     

错配修复基因在氯化镉致16HBE细胞转化中作用

目的探讨氯化镉诱发人支气管上皮(16HBE)细胞系恶性转化过程中错配修复基因hMSH2和hMLH1的mRNA和蛋白动态变化情况。方法用反转录一聚合酶链反应(PT-PCR)和免疫组织化学(SP法)检测16HBE细胞、氯化镉恶性转化16HBE细胞系不同阶段(第5,15,35代细胞及成瘤细胞)hMSH2基因和hMLH1基因的mRNA和蛋白的表达情况。结果随着转化代数的增加,hMSH2基因mRNA和蛋白的表达逐渐降低,至第35代细胞后表达明显下降(P<0.01);而hMLHl基因的mRNA和蛋白表达水平在氯化镉恶性转化16HBE细胞过程中无明显变化差异(P>0.05)。结论错配修复基因hMSH2表达水平的下调可能是镉化物分子致癌的重要机制。     

北京市大气颗粒物中多环芳烃及碳元素分析

目的了解大气颗粒物PM_2.5与PM₁₀中多环芳烃及有机碳、元素碳的污染特征。方法2006年6月16～18日和6月20～22日于北京市城区设置采样点,采集大气颗粒物PM_2.5与PM₁₀,并对其中的17种多环芳烃及有机碳、元素碳进行了分析。结果PM_2.5与PM₁₀中多环芳烃的平均质量浓度分别为0.011～2.846和0.013～4.415ng/m³;PM_2.5与PM₁₀中有机碳和元素碳的平均质量浓度分别为28.56,8.75μg/m³和41.14,15.43μg/m³。结论采样时间内,4环和5环多环芳烃是PM_2.5与PM₁₀中17种多环芳烃的主要成分;含碳组分在PM_2.5与PM₁₀中所占比例相当,碳仍然是2种粒子中的主要成分之一。