应用双重PCR检测海南疟区发热病人的效果

目的 评价双重PCR检测疟区发热病人的效果。方法 对疟区求诊发热病人，手指取血分别制作厚薄血膜片和滤纸血斑作为检测血样。参照献用恶性疟原虫PF1－2和间日疟原虫PV3－5为特异性引物，同在一个反应体系常规进行PCR，扩增片段分别为206bp和431bp。同时镜检厚血膜作对照。结果 该反应体系最低可检出原虫血症为1个恶性疟原虫／μl血和10个间日疟原虫／μl血的感染；检测132例疟区发热病人血样的阳性率为65．1％，而镜检法为64．4％，且有1例漏诊和3例误诊，两法符合率为97％。结论 双重PCR用于疟区发热病人检测，较镜检敏感、特异，适合我国恶性疟与间日疟混合流行区的疟疾诊断，还可用于血检质量的监控。     

Nested polymerase chain reaction in detection of Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes

目的　检测蚊体内间日疟原虫DNA。方法　以疟原虫SSurRNA为模板 ,采用套式PCR扩增间日疟原虫特异性 12 1bp片段。结果　在实验感染蚊中 ,套式PCR可检测到低至 3个间日疟原虫子孢子的DNA或 10 0只蚊中的一只阳性蚊 ,而其它 3种人疟原虫或正常蚊DNA未扩增出条带。结论　套式PCR的敏感性及特异性表明 ,该方法在检测蚊体内少量疟原虫感染时 ,比DNA探针或直接PCR具有更大优越性。     

武汉市两种输入性卵形疟巢式PCR检测

目的 了解巢式PCR鉴别卵形疟curtisi及变种wallikeri效果。方法 收集武汉市2008—2015年疟疾患者血样和流行病学资料。提取患者血样中的疟原虫DNA,进行巢式 PCR 检测。结果 采用巢式PCR检测疟疾患者282例,其中恶性疟原虫206例、间日疟原虫62例、三日疟原虫6例、卵形疟原虫19例。巢式PCR结果显示,卵形疟原虫经典型curtisi 和变种型wallikeri 分别扩增出800 bp和780 bp目的 条带。2012—2015年卵形疟占当年疟疾患者分别为4.1%（2/49）、12.2%（9/74）、8.2%（4/49）、11.4%（4/35）,卵形疟总数占全部病例的6.74%,其中,经典型curtisi 14例,变种型wallikeri 3例,混合感染2例,变种型wallikeri检出率占卵形疟26.3%。19例卵形疟病例全部为男性,感染输入地主要分布在撒哈拉沙漠以南地区,2例卵形疟混合感染分别来自安哥拉和尼日利亚。其中有2例卵形疟原虫curtisi型镜检 结果分别为间日疟和恶性疟,1例血片重新复核后为卵形疟,另1例巢式PCR检测为间日疟和卵形疟混合感染型。结论 分子生物学技术可以减少卵形疟误诊的情况;加强卵形疟curtisi及变种wallikeri的巢式PCR 检测,避免误诊。     

疟原虫核酸检测技术建立及在献血员筛查应用的研究

目的建立血液中疟原虫检测的核酸技术，探讨应用于献血员筛查的效果。方法根据红细胞内期疟原虫ssurRNA编码基因序列，设计合成三条扩增引物。将5份待检血样混合，采用蛋白酶K消化裂解法制备模板，在同一反应体系中扩增恶性疟原虫和间日疟原虫DNA，诊断鉴别恶性疟和间日疟。与厚血膜镜检法比较评价其灵敏度及特异性。结果将3份恶性疟原虫及10份间日疟原虫感染者的血样随机混入5000份无偿献血者血样中，每5份为一个检测单元，采用PCR方法从感染血样中扩增出分别为436bp和341bp的恶性疟原虫及间日疟原虫特异性的DNA片段，并经序列测定证实扩增片段的正确性；10份间日疟患者血样以及3份恶性疟患者血样均被检出，献血者血样PCR检测结果均为阴性，结果与厚血膜方法完全一致。结论所建立的疟原虫核酸检测技术灵敏度高、特异性好，且可以批量处理，提高了检测的效率，能有效降低疟原虫的输血传播，具有很好的推广使用价值。     

不同检材微量血间日疟原虫PCR检测模板制备方法的研究

目的 探寻不同检材微量血间日疟原虫PRC检测模板制备的方法.方法 全血标本采用酚/氯仿抽提法、洗涤沉淀法、Chelex煮沸法和洗涤水煮法;滤纸干血滴及厚血膜标本以Chelex煮沸法和洗涤沉淀法制备模板.以间日疟原虫特异性引物作PCR扩增检测模板制备的效果.结果 采用上述4种不同的方法制备的全血间日疟原虫DNA模板与采用Chelex法和洗涤沉淀法制备的滤纸干血滴以及厚血膜疟原虫DNA模板均可被扩增出1条341bp的间日疟原虫特异性DNA条带,与预期的扩增片断大小一致;不同方法制备的10份间日疟患者血样DNA模板用于PCR扩增检测,结果无明显差异.其中,Chelex煮沸法和洗涤沉淀法对不同检材的疟原虫感染血样DNA模板均能有效制备,且可在同一离心管中进行,减少了交叉污染的机会.结论 Chelex法和洗涤沉淀法简便、实用,适用于不同检材微量血疟原虫PRC模板的制备.     

逆转录聚合酶链反应检测恶性疟原虫的应用研究

目的 建立逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测恶性疟原虫的新方法,并用于检测现场采集血样。方法 以恶性疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计一对特异引物,采用RT—PCR技术,恶性疟原虫预期被扩增出359bp特定扩增带。结果 从培养的恶性疟血样和现场采集的恶性疟血样中扩增出359bp特定扩增带,而间日疟和健康人血样均未见扩增带。经限制性内切酶分析证实扩增产物为目的片段。本检测系统初步显示可检出0．34个疟原虫／出血样,37份现场采集经镜检确诊的恶性疟血样中,36份RT—PCR检测为阳性,1份RT—PCR检测为阴性,阳性符合率为97．35％。结论 RT—PCR检测恶性疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,对疟疾诊断、镜检质量控制和流行病学研究具有较大的实用价值。     

云南省1例输入性三日疟实验室检测分析

目的对云南省1例输入性疟疾患者的血样进行实验室检测分析。方法采用疟原虫属特异性引物和种特异性引物对该样本进行巢式PCR检测,将PCR扩增结果进行序列测定,并对获得的序列进行Blast比对,分析其分子性状。结果使用疟原虫属特异性引物r PLU5和r PLU6对血样进行PCR检测,第一轮未扩增出预期条带;使用疟原虫种特异性引物对血样进行PCR检测,扩增出预期大小约141bp的三日疟条带,无对应大小的恶性疟、间日疟和卵形疟扩增条带产生。序列分析表明,扩增片段长度为115bp,进行Blast比对发现,与Genbank中注册编号为gb|KJ934253.1的三日疟对应部分的基因序列同源性为96%。结论通过使用巢式PCR、序列测定分析等方法,基本证实该病例为三日疟原虫感染。     

间日疟原虫孢子期SSUrRNA基因扩增、鉴定及其诊断应用

目的体外扩增、克隆间日疟原虫孢子期SSUrRNA编码基因特异性片段，分析其分子特征，评价其核酸诊断应用效果。方法根据间日疟原虫基因库相关核酸序列设计引物，采用聚合酶链反应技术从间日疟患者血样DNA提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段，与pGEM—Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109；阳性克隆以双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定分析其序列特征；以SSUrDNA为靶基因，建立间日疟PCR诊断方法，并以镜检法为标准评价其用于间日疟原虫感染的检测效果。蛄果从间日疟患者血样中扩增的SSUrDNA片段大小约为267bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段，含有267个核苷酸，与间日疟原虫Sall株孢子期SSUrRNA基因序列比较，同源性为99．3％，其中第220住为插入了1个碱基“T”，243住碱基由“G”取代了“T”。将纯化的含有SSUrRNA靶基因的重组质粒以正常人血液核酸提取液倍比稀释成浓度梯度作模板，PER扩增结果显示检测灵敏度至少迭102copy／μl；特异性检验显示仅间日疟原虫患者血样扩增出约267bp的特异性基因片段，而恶性疟原虫、弓形虫、血吸虫、肝吸虫感染患者血样及正常人血未见特异性扩增条带。以镜检法为参照标准，PCR敏感性为100％（102／102），特异性为100％（76／76）。结论所扩增克隆的间日疟原虫孢子期SSUrDNA片段序列具有种特异性且相对稳定，不同地理株间存在单核苷酸多态性，以其为靶基因建立的PCR检测方法敏感、特异，具有良好的推广使用价值。     

应用套式PCR技术检测我国西南部分疟区疟原虫的感染状况

目的　建立鉴别人体四种疟原虫的套式 PCR技术 ,检测我国西南部分疟区疟原虫的感染情况。方法　选用两组疟原虫引物 ,扩增 SSU r DNA特定片段 ,经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色 ,紫外检测凝胶分析仪观察并摄像。结果　采用上述方法扩增出间日疟、恶性疟和三日疟分别为 10 4bp、10 2 bp和 115 bp特异片段。所检测的 138份疟疾患者血样中 ,四川名山县 95份均为间日疟单纯感染 ,筠连县 37份中 10份为与间日疟和 /或恶性疟呈混合感染的三日疟 ,云南金平县的 6份均为合并恶性疟的两种或两种以上疟原虫混合感染。结论　所建立的套式PCR检测系统具有敏感性高、特异性好和稳定可靠等优点 ,在疟疾诊断、虫种鉴别、混合感染的判定、大规模流行病学研究和疫情监控预测等方面具有实际应用价值。     

多重巢式聚合酶链反应在疟疾混合感染检测与分型中的应用

目的:应用能够同时检测恶性疟(P.falciparum)、间日疟(P.vivax)、卵形疟(P.ovale)、三日疟(P.malarie)及其混合感染的多重巢式PCR方法,对疑似疟疾混合感染样本进行检测,评价其在疟原虫混合感染及分型中的应用价值,旨在为疟疾流行病学调查、疟疾混合感染的确诊提供一种快速高效、特异性强、灵敏度高的实验室诊断方法,为传统的镜检法提供有效的补充。方法:根据恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫的18SSU rRNA基因序列设计5对引物(1对通用引物、4对特异性引物),以等比例混合的4种疟原虫核酸为模板,建立疟疾多重巢式PCR检测方法,并应用该法对28份疑似疟疾混合感染样本进行检测及测序验证,将其结果与镜检法比较。结果:28份疑似混合感染样本中混合感染样品数为6例,其中恶性疟和间日疟混合感染样品5例,恶性疟和卵形疟混合感染样品1例。结论:本研究建立的多重巢式PCR检测方法能够同时用于恶性疟、间日疟、卵形疟、三日疟及其混合感染样本的检测,在疟疾混合感染的确诊与分型上较镜检法有明显的优势和更高的应用价值。     

聚合酶链反应用于恶性疟疾诊断初步研究

合成一对恶性疟原虫特异引物，用聚合酶链的反应（PCR）技术检测海南岛恶性疟病人滤纸血滴30例，结果28例阳性，在206bp处可见一条清晰易辨的扩增条带，2例阴性经血片复查，其中1例为间日疟原虫；同时检测间日疟病人血滴和未发现原虫的发热病人血滴各16例，均为阴性，与镜检符合率达98．4％（61／62例）。初步表明PCR法具有准确、敏感、特异、简捷等优点，采用滤纸血滴方便现场采样、保存和送检，且易批量检测，在疟疾临床诊断和流行病学调查方面，将可替代血片镜检法，逐步扩大应用。     

间日疟原虫深圳株红内期SSUrDNA基因片段的克隆与序列分析

目的 体外扩增间日疟原虫深圳株红内期小亚单位核糖体核糖核酸编码基因(SSUrDNA)片段，研究其结构与功能。方法 设计一对特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)从间日疟原虫患者血样中扩增出间日疟原虫SSUrDNA片段，以PUC19质粒T载体构建重组子导入大肠杆菌JM109；阳性克隆双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列。结果 间日疟原虫SSUrDNA扩增片段大小为341bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；序列测定插入片段为341bp，与Sal I株顺序相比，仅在第151位处缺失一个碱基C。结论 成功克隆了间日疟原虫SSUrDNA片段．该序列在间日疟原虫虫株间高度保守。     

澜沧江下游航运区疟疾学调查

目的 了解澜沧江下游航运区疟疾流行情况和恶性疟原虫对氯喹、青蒿琥酯的敏感性。 方法 居民带虫普查、IFA检测、疟史访问、发热病人血检、媒介按蚊、社会经济等调查和恶性疟原虫对氯喹、青蒿琥酯敏感性测试。 结果 各种人群累计平均疟原虫率为8.36％(226／2 704),其中间日疟占58.85％,恶性疟占40.27％,混合疟占0.88％。发热病人疟原虫检出率为30.03％(106／353)。居民、搬运工人和船员的疟史率,2001年分别为38.39％、8.82％和1.06％。主要媒介微小按蚊占捕获10种244.只按蚊总数的10.66％,叮人率为0.75只／人工·h。恶性疟原虫对青蒿琥酯和氯喹的抗性率各为8.70％和96.15％;半数抑制量(ID50)分别为13.44和91.25nmoL／L。 结论 目前澜沧江下游航运区疟疾呈不同程度流行状态,防治工作薄弱,急待加强。氯喹仍不宜治疗恶性疟,青蒿琥酯的敏感性有所下降,应引起重视。     

聚合酶链反应检测疟疾的研究

目的 建立能鉴别诊断恶性疟原虫间和日疟原虫的PCR检测方法。方法 根据红内期疟原虫SSUr-RNA基因序列,设计合成两对引物,采用PCR技术,检测89份门诊“四热”病人血样,并与镜检法进行比较研究。结果 恶性疟原虫血样能扩增出205bp的特异带,间日疟原虫血样能扩增出120bp的特异带,PCR检测的阳性率为74.16%,镜检法为68.54%,PCR法与镜检法的符合率为94.38%。结论 PCR检测的敏感性和特异性均优于镜检法,对于诊断恶性疟原虫和间日疟原虫以及恶性疟原虫的间日疟原虫的混合感染具有一定的应用价值。     

重组酶介导等温扩增技术检测疟原虫方法的建立和评价

目的 建立一种重组酶介导等温扩增技术（RAA）检测疟原虫的方法。方法 针对疟原虫属保守18S小亚基核糖体RNA （18S rRNA）基因设计特异性引物,筛选确定最佳引物对组合并建立疟原虫重组酶介导核酸等温扩增体系。通过该RAA体系检测疟原虫标准质粒、4种疟原虫[恶性疟原虫( Plasmodium falciparum, P.f )、间日疟原虫( P. vivax, P.v)、三日疟原虫( P. malaria, P.m)、卵形疟原虫( P. ovale, Po)]病原体以及其他6种输血传播寄生虫（婴儿利士曼原虫、杜氏利士曼原虫、刚地弓形虫、溶组织阿米巴虫、犬吉氏巴贝西虫、田鼠巴贝虫）,以评估该体系的灵敏度和特异度。 结果 筛选出一组扩增效果较好的引物对,整个RAA体系使用最佳引物对在37 ℃,20 min即可完成扩增,对标准质粒的检测下限为10^-2 copies/μL,恶性疟原虫、间日疟原虫和卵形疟原虫为10² copies/μL,三日疟原虫为10 copies/μL。RAA检测体系未与其他输血传播寄生虫产生交叉反应,特异性良好。应用RAA方法检测外籍学生献血者标本,结果与荧光定量PCR结果一致。结论 成功建立了一种快速、简便和特异的疟原虫RAA检测方法,将会给血液筛查和一些基层偏远医院的临床检测提供很大帮助。