HPV16嵌合型疫苗的构建及其免疫效应初探

目的 构建以碳末端锌指结构突变的E7基因为基础，融合HSP70的嵌合型DNA疫苗，检测其诱导的特异性T淋巴细胞增殖活性，初步评价此疫苗对HPV相关肿瘤的治疗作用。方法 利用PCR法定点突变E7基因碳末端的锌指结构，以其为基础融合热休克蛋白70，克隆入pcDNA．3．1-质粒构建嵌合型DNA疫苗。DNA测序，确认E7基因突变位点及DNA疫苗阅读框架。用脂质体法将pcd—E7-HSP转染A549细胞，经G418筛选后，提取RNA，RT—PCR检测E7基因表达。DNA疫苗免疫C57BL6小鼠。取其脾细胞与E7蛋白在体外共同培育，MTT法检测T淋巴细胞增殖活性。结果 E7基因突变位点及阅读框架均正确，E7基因可检测到表达。疫苗免疫后C57BL/6小鼠脾细胞增殖活跃。结论：E7基因锌指结构的突变及融合HSP70能够诱导特异性的细胞免疫应答。     

重组腺病毒及其基因组裸DNA免疫效果差异的初步分析

目的:研究重组腺病毒及其基因组裸DNA免疫效果的差异,探讨重组腺病毒疫苗免疫接种的新途径。方法:构建人乳头瘤病毒重组腺病毒rAd5-L1E7,用TCID50微量滴定法测定病毒滴度。将0.1ml滴度为10-4重组腺病毒和10μg重组腺病毒基因组DNA分别肌肉注射免疫BALB/c小鼠,在接种后第1～5周分离小鼠血清。以HPV16L1E7重组蛋白为抗原,用ELISA方法检测血清HPV16特异性抗体水平。通过T细胞增殖试验和检测脾细胞IFN-γ水平确定疫苗诱导的细胞免疫,并分析二者之间的差异。结果:重组腺病毒及其基因组裸DNA免疫接种均能有效地诱导体液和细胞免疫,抗体达到高峰的时间不同,二者在第3和第4周血清抗体IgG水平差异有统计学意义(P<0.05)。T淋巴细胞增殖试验结果和脾细胞分泌IFN-γ水平差异无统计学意义。结论:重组腺病毒基因组裸DNA接种能够有效地诱导细胞和体液免疫应答,是腺病毒疫苗接种的一种新途径。     

人乳头瘤病毒16 E7基因的原核表达及表达条件的优化

目的:构建pET-28a(+)-HPV16 E7原核表达质粒,并对其表达条件进行优化,为进一步研究HPV16E7致病机制及HPV疫苗提供相应的技术平台。方法:应用基因重组技术,构建pET-28a(+)与HPV16 E7(标准株和湖北株)的原核表达重组质粒,用PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测对重组质粒DNA进行鉴定,将其转入宿主菌E.coliBL21(DE 3)进行诱导以表达蛋白;SDS-PAGE及Western blot检测鉴定表达蛋白的分子量及特异性。优化诱导表达的条件,如温度、IPTG浓度、适用的培养基,探讨不同温度下蛋白的表达形式;纯化回收HPV16 E7蛋白。结果:PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV16 E7(标准株)蛋白得到高效原核表达,最佳表达条件:表达HPV16 E7的工程菌BL21(DE 3)的最佳诱导温度是37℃,诱导剂IPTG的浓度为0.3-0.4 mmol/L,最佳培养基为1.5倍LB。结论:pET-28a(+)-HPV16 E7标准株和湖北株重组载体构建成功,人乳头瘤病毒16 E7标准株获得高效原核表达。     

HPV16 L1-E7蛋白疫苗诱导小鼠产生抗体及细胞免疫应答的研究

目的：探讨嵌合性病毒样颗粒HPV16 L1－E7蛋白疫苗接种于动物体内诱发体液和细胞免疫反应的能力。方法：以本室构建的HPV16 L1－E7嵌合蛋白疫苗腹腔注射免疫BALB／c小鼠，在初次免疫后，分别于第3，4，5周采血ELISA检测特异性抗体的产生。并耳皮下注射HPV16L1蛋白，检测特异性DHT反应，在末次免疫2周后，取小鼠脾细胞，用HPV 16 L1－E7蛋白刺激，检测T细胞增殖反应及血清IFN－γ水平。结果：HPV16 L1－E7蛋白疫苗免疫小鼠可有效产生HPV16 L1抗体及特异性DTH反应，加强免疫后，抗体水平升高，两者水平均高于对照组（P＜0．01），HPV16 L1－E7嵌合蛋白疫苗免疫后取小鼠脾细胞，在特异性HPV16 L1－E7蛋白抗原刺激下，特异性T淋巴细胞明显增殖，被免疫小鼠血清中出现高水平IFN－γ。结论：嵌合母亲产颗粒HPV16 L1－E7蛋白可诱导小鼠产生高滴度抗体，HPV16L1特异性TDH参与的超敏反应及细胞免疫应答的细胞因子，这为研究预防HPV感染和治疗HPV相关性肿瘤的疫苗提供了实验资料。     

融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7的构建及其免疫学特性研究

目的 构建融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7,并评价其体外实验和动物模型上的免疫学特性,尤其是抗病毒致病基因的特异性细胞免疫反应.方法 分别构建DNA重组体pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7,pcDNA3.1-CRT180,pcDNA3.1-HPV6E7.将pcDNA3.1-HPV6E7质粒经脂质体介导转染B16细胞,以G418筛选阳性细胞集落,荧光显微镜观察和RT-PCR鉴定表达HPV6E7的阳性细胞株.将质粒DNA肌注免疫C57BL/6小鼠,3次后取全血经流式细胞仪检测T细胞亚群的变化,LDH法检测小鼠的脾细胞和淋巴细胞与靶细胞B16/HPV6E7孵育后的CTL活性以及ELISA法检测共孵育上清中IL-2和IFN-γ浓度的变化.结果 各组质粒经鉴定表明构建正确.转染后细胞株稳定表达HPV6E7.DNA疫苗免疫小鼠后,pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7免疫组较pcDNA3.1-HPV6E7免疫组的外周血CD8 T细胞和TCRγδT细胞的比例显著增加,脾细胞和淋巴细胞针对靶细胞B16/HPV6E7的CTL杀伤活性更明显,分泌IL-2和IFN-γ的水平升高(P＜0.05).结论 CRT180与HPV致病基因6E7相连的重组质粒疫苗pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7能引发小鼠T细胞亚群CD8 分化并诱导出显著的特异性CTL反应.推测CRT180/HPV6E7 DNA疫苗在动物模型上可以有效激活抗HPV特异性细胞免疫,有利于病毒感染的清除.     

多表位HBV重组DNA疫苗的构建与免疫效果评价

目的探讨多表位乙型肝炎DNA疫苗诱导特异性细胞免疫应答及其治疗慢性乙型肝炎的潜能。方法筛选一组HBV的表位,并进行优化组合,辅以一定的旁侧序列,并合成目的基因片段HS。将它插入可人用的真核表达载体pVAX1中,构建出重组质粒PVAX-HS。通过重组质粒免疫小鼠,观察免疫动物体内CTL。结果酶切结果显示成功构建了PVAX-HSDNA疫苗,ELISPOT测定证实其可以在小鼠体内诱导产生特异性T细胞,51Cr释放实验证实,所诱导的T细胞中具有很强的CTL活性。结论PVAX-HSDNA疫苗免疫可诱导特异性细胞免疫应答,具有慢性病毒性乙型肝炎治疗性疫苗的潜能。     

HPV16 E6 DNA疫苗诱导小鼠抗宫颈癌主动免疫

目的：探讨HPV16 E6 DNA疫苗能否在体内诱导小鼠抗宫颈癌主动免疫应答。 方法：将HPV16 E6基因转染615小鼠宫颈癌U14,建立高表达E6的U14细胞株即E6+U14;制备HPV16 E6 DNA疫苗;随后分组进行体内预防和治疗E6+U14移植同系小鼠试验,设立对照组;观察各组小鼠肿瘤大小,计算抑瘤率、生存时间;计算淋巴和肺转移率;体外分别检测经HPV16 E6 DNA疫苗免疫后的小鼠T 淋巴细胞对E6+U14和U14的杀伤作用。结果：HPV16 E6 DNA疫苗预防和治疗组小鼠各时期瘤体大小均显著低于对照组（均P<0.001 ）,两组抑瘤率均大于70%;平均生存时间均大于对照组（均P<0.001）;预防组淋巴转移率低于对照组（P<0.05）;HPV16 E6 DNA疫苗免疫小鼠T淋巴细胞在不同效靶比,对E6+U14的杀伤效率均明显高于对U14者（均P<0.001）。结论：HPV16 E6 DNA疫苗能诱导机体产生针对HPV16 E6阳性的宫颈癌细胞主动免疫应答及特异性细胞毒淋巴细胞,提示该疫苗可能对临床治疗宫颈癌有效。     

人乳头瘤病毒HPV16L1-E7C重组质粒的构建及其细胞的免疫性

目的:构建HPV16L1-E7C重组质粒并研究其细胞免疫性。方法:利用基因克隆技术将HPV16L1-E7CDNA片段定向插入pcDNA3.1载体,构建重组质粒pcDNA16L1-E7C,然后将其免疫C57BL/6小鼠,利用T淋巴细胞增殖试验检测免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖能力,同时利用ELISA试验检测免疫小鼠的脾淋巴细胞分泌γ-干扰素(IFN-γ)的水平。结果:特异性T细胞增殖试验中实验组3H-TdR掺入率为18339±1972,对照组为6737±1243,实验组小鼠T细胞增殖水平明显高于对照组(P<0.05)。DNA免疫后实验组小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平为0.89±0.56,对照组为4.81±1.33,两者相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:重组质粒能增强小鼠的细胞免疫功能。     

人乳头瘤病毒16型E6E7基因协同共激活分子B7-1基因免疫诱导的特异性免疫反应

目的利用突变修饰后的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16,HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7),研究治疗HPV16感染相关疾病的DNA疫苗,并进一步探索利用共激活分子B7-1基因,研究更加活化细胞免疫的加强疫苗。方法将用PCR法扩增获得fmE6E7基因插入真核表达质粒pVR1012中获得pVR1012-fmE6E7,瞬时转染Cos-7细胞,免疫荧光组织化学法检测证实其表达后,在C57BL/6小鼠肌肉内进行pVR1012-fmE6E7单独免疫,或与小鼠共激活分子B7-1基因真核表达质粒(pcDNA3.1-B7-1)联合免疫。51Cr释放法分析免疫小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性,间接ELISA法检测小鼠血清中E7特异性抗体。用5×105个C3细胞皮下接种C57BL/6小鼠,分析小鼠体内诱发的特异性抗瘤免疫水平。结果修饰后的E6E7基因免疫可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应,小鼠B7-1基因与fmE6E7联合免疫可显著提高特异性CTL活性,并可保护33%(2/6)的小鼠免受C3肿瘤细胞的攻击,而单独fmE6E7基因免疫则不能抑制C3瘤细胞的生长,联合B7-1基因免疫对诱发的抗体水平无加强作用。结论中国山东地方株E6E7融合基因可用于DNA疫苗的构建,B7-1基因协同免疫可提高疫苗的细胞免疫水平,利用B7-1基因作为HPV16DNA疫苗的协同因子具有重要价值。     

HPV16 E6E7与C3d3 融合基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建可作为DNA疫苗的包含人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6E7与C3d3融合基因真核表达质粒,并在体外进行表达和鉴定。方法采用PCR技术扩增HPV16 E6E7片段,将该片段插入到pMDT-18载体中后,亚克隆至真核表达载体pSG.SS.C3d3.YL和pSG.SS.YL,构建E6E7与C3d3融合基因及E6E7表达质粒pSG.SS.E6E7.C3d3.YL和pSG.SS.E6E7.YL。经限制性酶切鉴定和DNA序列测定后,将重组质粒pSG.SS.E6E7.C3d3.YL、pSG.SS.E6E7.YL转染COS-7细胞,用Western blot及免疫细胞化学技术检测其表达。结果经酶切、DNA测序及转染真核细胞后表达产物的鉴定结果显示,重组质粒构建成功。结论构建的质粒可在真核细胞内正确表达,为其作为DNA疫苗诱导免疫效应的动物实验打下了基础。     

人β防御素2（HBD2）与人乳头瘤病毒HPVl6E6羧基端编码基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的构建人β防御素与人乳头瘤病毒HPV16E6羧基端基因的真核表达质粒，并检测其在真核细胞中的表达情况，探讨其作为DNA疫苗治疗宫颈癌的可行性。方法利用分子克隆技术，将HBD2基因片段与HPV16E6羧基端基因片段连接，插入真核表达质粒pcDNA3．1，经测序鉴定后，用阳离子脂质体法转染真核细胞COS7，RT—PCR及免疫组化法检测其表达。结果重组质粒pcDNA3．1／HBD2～HPV16E6C转染COS7细胞48小时后，RT—PCR扩增出插入的HBD2--HPV16E6C片段，免疫组化染色呈棕黄色阳性反应。结论人β防御素与人乳头瘤病毒HPV16E6羧基端融合基因能在真核细胞中有效表达，为今后进行整体动物DNA免疫试验奠定了基础。     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白真核载体的构建与表达

目的构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白真核载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E2基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,双酶切及测序鉴定。将质粒pcDNA3.1（＋）与pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2分别转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E2基因在HeLa细胞中的表达。结果 HPV16 E2基因片段插入到pcDNA3.1（＋）相同酶切位点,即构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2;转染pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2的细胞,检测到HPV16 E2 mRNA。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2能在HeLa细胞内有效表达。     

Immune response to plasmid DNA encoding HPV16-L1 protein

Objective To test the immunogenicity of recombinant plasmid DNA containing human papillomavirus type 16-L1 (HPV16-L1) coding sequence of mice.Methods The HPV16-L1 encoding sequence was generated by polymerase chain reaction (PCR), and inserted into TA cloning vector PCR Ⅱ, then cloned in the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 with CMV promoter. The recombinant plasmid DNA pcDNA-L1 was transferred into Cos-7 cells and used to immunize BALB/c mice via muscular injection. The expression of HPV16-L1 in transferred cells was identified by immunospot and immunocytochemistry, which tested specific anti-HPV16-L1 antibody in the serum of immunized mice. Results Using the immunospot technique, we found L1 protein expression in pcDNA-L1 transferred cells. The immunocytochemistry studies demonstrated that the L1 protein was located in nuclei. In immunized mice, specific anti-HPV16-L1 antibodies could be detected by immunospot and immunocytochemistry 28 days after the first immunization and last at least 41 days. Conclusions We constructed HPV16-L1 eukaryotic expressing plasmid whose DNA could induce immuno-humoral response in mice. This observation will be helpful in designing HPV16 prophylactic vaccine.     

CONSTRUCTION AND IMMUNOGENICITY OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 6B L1 RECOMBINANT PLASMID

Objective To construct a DNA vaccine as a prophylactic model to prevent condyloma acuminatum and detect its immunogenicity in mice. Methods The major capsid protein (L1) gene of human papillomavirus (HPV) 6b was inserted into an eukaryotic expression plasmid (pcDNA3.1). The recombinant plasmid was transfected into COS-7 cells. Western blot were performed to detect whether L1 protein can be expressed in eukaryotic cells. Eighteen female BALB/c mice were tested for immunogenicity study. Results The recombinant plasmid (pcDNA3. 1-HPV6bL1) was verified as HPV6b L1 gene by sequencing. Western blot showed specific strip. Anti-L1 protein antibodies could be detected in the mice‘s sera inoculated with pcDNA3.1-HPV6bL1. Similarly, IL-4, IL-2, and IFN-γ were increased in the same mice. Conclusion HPV6b L1 recombinant plasmid was constructed successfully which had immunogenicity for BALB/c mice. It provided experimental evidence for the research of DNA vaccine of condyloma acuminata.     

人乳头瘤病毒16型E5蛋白真核载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒115型（HPV16）E5蛋白真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5,分析E5在HeLa细胞及BALB／c小鼠肌肉组织中的表达。方法设计HPV16E5基因引物,PCR扩增E5基因。经Bam-HI、EcoR1酶切后将其连接入pcDNA3．1（＋）,PCR及双酶切筛选阳性克隆并测序。将构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5转染HeLa细胞,利用RT—PCR测定HPV16E5mRNA表达。将6只BALB／c小鼠分为3组,分别取100mgpcDNA3．1（＋）／HPV16E5、100mgpcDNA3．1（＋）、100mLPBS经肌肉注射小鼠,2周1次,共4次;末次接种后第14天取小鼠股四头肌制成石蜡切片,免疫组织化学法检测E5蛋白在小鼠肌肉组织中的表达。结果PCR扩增得到252bpHPV16E5基因片段,DNA测序结果显示E5基因片段正确地连入pcDNA3．1（＋）。构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5在HeLa细胞表达大小为252bp的HPV16E5mRNA。小鼠股四头肌细胞膜被染成棕黄色。结论构建的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5能在HeLa细胞及小鼠肌肉组织中表达HPV16E5蛋白。     

HPV16 E5蛋白原核表达、鉴定及真核表达稳定株的筛选

目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPVl6感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16 E5基因,经BamHⅠ和HindIⅡ双酶切后插入相同酶切的pET32a（＋）载体,转染JMl09感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Wlescem blotting检测目标蛋白表达情况。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET32（＋）,E5质粒后取得的E5全基因片段转入pcDNA3．1（＋）空质粒,构建pcDNA3．1（＋）m5真核表达质粒并对NIH3T3细胞进行转染,最后用G418进行稳定表达株的筛选,并采用RT．PCR鉴定细胞内HPV16 E5基因表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32/E5,在1mmol／LPTG、28℃诱导条件下BL21（DE3）菌体中HPVl6E5．TRX融合蛋白占菌体总蛋白的10％左右。真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／E5在成功转染NIH3T3细胞后于250μg/mlG418浓度时筛选21d得到了E5基因稳定表达株,RT-PCR产物测序得到了HPV16 E5基因全序列。结论成功构建了pET32／E5原核和pcDNA3．1（＋）／E5真核表达质粒,HPV16 E5蛋白在大肠杆菌和NIH3T3细胞中的稳定表达．这些结果为进一步深入研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础。     

嗜肺军团菌pilE基因体外表达及其免疫原性研究

目的 构建嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛pilE基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-pilE,研究其真核细胞中的表达及其免疫原性.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌pilE基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1.-pilE.经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-pilE转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western-blot分别鉴定pcDNA3.1-pilE的瞬时和稳定表达产物.将pcDNA3.1-pilE作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ产生水平、CTL杀伤活性等指标,评价疫苗的免疫原性.结果 扩增出了429 bp的PilE基因,在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,在相对分子质量15000处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-pilE在细胞内表达PilE蛋白.pcDNA3.1-pilE免疫组的免疫原性均高于对照组pcDNA3.1( )组(P＜0.01).结论 成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中得到了表达,免疫小鼠后诱导了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答.     

人乳头状瘤病毒16E7在人喉癌细胞系中的转染及表达

目的:构建含人乳头状瘤病毒16E7(HPV16E7)基因的真核表达载体,观察HPV16E7对人喉癌HEp-2细胞系生物学特性的影响,为后续实验提供研究对象.方法:以含HPV16E7基因的中间质粒pET28a-HPV16E7为模板扩增出HPV16E7基因全长序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-) B中,并进行序列分析和酶切鉴定.电穿孔法将重组体pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7转染入喉癌HEp-2细胞中,Western 印迹法检测HPV16E7蛋白的表达,相差显微镜观察转染前后的HEp-2细胞系形态学变化,流式细胞仪检测转染前后细胞生长周期的改变.结果:成功构建并将pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7转染入人喉癌HEp-2细胞中;转染后HEp-2细胞增生活跃,S期明显延长,并能够稳定表达HPV16E7蛋白.结论:HPV16E7有促进HEp-2细胞的致瘤活性;真核表达载体pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7可为下一步建立动物模型和喉癌体外治疗实验提供研究工具.     

地方株HPV16L1基因诱发的小鼠体液免疫反应

目的检测pcDNA-L1的表达,评价地方株HPV16L1基因疫苗诱导的体液免疫反应.方法采用PCR技术从宫颈癌组织中获得L1基因,以pGEM-T Easy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-L1,进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析,再将L1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1（-）中,构建地方株HPV16L1基因疫苗,转染COS-7细胞,通过IFA试验验证L1蛋白的表达.用pcDNA-L1肌肉内注射方法分别于第1天、第15天和第43天免疫6周龄BABL/c小鼠,在特定时间段采血分离血清,IFA分析基因免疫在小鼠体内诱导的免疫应答,设pcDNA载体对照.结果pcDNA-L1能够在COS-7细胞中暂态表达,免疫小鼠后能检测出特异的抗体,用IFA方法在第一次免疫后的第30、60和180天均可检测到抗体;原载体免疫后未检出特异抗体.结论本实验构建的地方株HPV16L1基因疫苗可诱导产生特异性的体液免疫反应.