细胞色素P450 3A研究进展

P4503A是细胞色素P450中含量最多的同工酶,临床中有60％以上的药物由其代谢。总结了CYP3A的分布、含量、亚型、表达与调控、与疾病的关系以及活性研究方法等研究进展。     

细胞色素P450—3A4相关的药物相互作用

目的：综述与细胞色素P4503A4相关的药物相互作用。方法：检索Medline和中国药学文摘。结果：发现多种由CYP3A4催化代谢的药物之间可以竞争药物代谢酶,引起药物相互作用,CYP3A4的抑制剂和诱导剂均可以抑制或诱导CYP3A4催化代谢的药物代谢。导致有益或不良的药物相互作用。结论：CYP3A4催化代谢的药物联合使用,特别是CYP3A4抑制剂与底物联合使用时,可能因为抑制了药物的代谢而导致严重的药物不良反应。     

重组细胞色素酶P450 3A4表达和鉴定

细胞色素酶P450是代谢内源性物质和外源性物质的重要的酶,在药物治疗和药物开发领域以及了解潜在的毒性物质和致癌性物质的代谢机制起决定性作用。旨在构建细胞色素酶P450 3A4的表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化得到CYP3A4蛋白。用逆转录-聚合酶链反应方法从人肝脏总RNA中得到CYP3A4的cDNA,然后直接插入pMD20-T Vector中,将测序正确的N-末端和C-末端进行修饰。然后利用双酶切插入到表达载体pET-28a-c(+)Vectors,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达。并通过定点突变的方法获得CYP3A4亚型P467S(CYP3A4*19)。采用SPSS13.0设计4因素2水平正交实验,对α-ALA(0.5 mmol/L和1 mmol/L)、IPTG(0.5 mmol/L和1 mmol/L)、卡那霉素(50μg/mL和100μg/mL)添加浓度及菌的接种密度(接种1%和接种2%)进行优化。并用SPSS13.0对结果进行分析,选择出比较好的组合进行下一步的大规模的诱导表达。经定点突变的方法成功获得了CYP3A4*19亚型。经IPTG诱导获得CYP3A4蛋白,并通过Western blot验证。用BCA蛋白浓度定量分析试剂盒测定的膜蛋白浓度在65μg/mL左右,α-ALA、抗生素(卡那霉素)、T7启动子诱导剂IPTG及接种密度高低两水平中对膜蛋白的表达水平的影响没有统计学意义。     

转入人细胞色素P450—3A4基因的CHL细胞可代谢活化异环磷酰胺

环境污染物的致癌、致突变效应以及肿瘤化疗诱发第二肿瘤的风险是人们普遍关注的问题。大多数化学致癌物本身不具活性，必须在体内经过代谢活化才能诱发肿瘤。细胞色素Ｐ４５０（ＣＹＰ）同功酶系在外来化合物的代谢活化中起主要作用，可是目前用于遗传毒理学研究的建株细...     

细胞色素P450 3A4表达调控机制的研究进展

细胞色素P450 3A4(CYP3A4)的表达具有很强的个体间特异性,会引起复杂的药物相互作用。故明确CYP3A4的表达调控机制,对于指导临床合理用药意义重大。本文从转录前、转录后、翻译后修饰3个阶段对CYP3A4的调控机制进行综述。     

酒精性肝损伤大鼠细胞色素P450 CYP2E1和细胞色素P450 CYP3A的代谢活性

目的观察酒精性肝损伤对大鼠细胞色素P450CYP3A(CYP3A)和细胞色素P450CYP2E1(CYP2E1)代谢活性的影响。方法采用ig给予白酒制备大鼠酒精性肝损伤模型,检测血清中谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)活性,采用HE染色法光镜下观测酒精对肝脏损伤程度。大鼠ip给予CYP3A探针药物咪达唑仑10mg·kg-1或ig给予CYP2E1探针药物氯唑沙宗50mg·kg-1后,采用高效液相色谱法测定不同时间点大鼠血浆中咪达唑仑和氯唑沙宗的血药浓度,并应用3P87软件计算其药代动力学参数,以考察CYP2E1和CYP3A的代谢活性的变化。大鼠ig给予氯唑沙宗80mg·kg-1后,热板方法测定大鼠添足次数和添足反射潜伏期。结果酒精性肝损伤可致大鼠肝小叶结构不清,肝索排列紊乱,肝细胞体积增大,呈弥漫性中度水变性,肝窦受压,大部分肝细胞胞浆内见大小不等的脂肪空泡;与正常对照组相比,酒精性肝损伤组大鼠GPT和GOT活性分别增加了16.0%和20.0%(P<0.05,P<0.01)。酒精性肝损伤致大鼠CYP2E1对探针药物氯唑沙宗的代谢活性增强,AUC,t1/2和cmax分别降低了38.0%,30.5%和35.0%(P<0.05);酒精肝损伤组大鼠氯唑沙宗镇痛效果明显降低;酒精性肝损伤致大鼠CYP3A对探针药物咪达唑仑的代谢活性增强,AUC,t1/2和cmax分别降低了122.6%,54.9%和56.9%(P<0.01,P<0.05)。结论酒精性肝损伤可使大鼠CYP2E1和CYP3A代谢活性增强。     

细胞色素氧化酶CYP3A4基因突变与表型研究进展

细胞色素P4503A4在许多内源性及外源性化合物的氧化及还原代谢中起关键作用，对CYP3A4基因表达的研究具有重要意义。本文对CYP3A4基因突变及其表型特征加以总结。     

细胞色素P450 3A5基因多态性及其对药物代谢影响的研究进展

细胞色素P450 3A5是细胞色素P450亚家族CYP3A的成员之一,对CYP3A底物的代谢清除率有明显的作用,与CYIY3A4等共同或独立催化或影响药物代谢,具有种族差异的遗传多态性.研究CYP3A5多态性及其对药物代谢的影响,对于临床上个体化用药具有积极的意义.     

细胞色素P450 CYP4A的组织和细胞表达特异性

目的确定细胞色素P450 CYP4A在组织和细胞水平表达是否具有特异性。方法采用Western印迹法分析细胞色素P450 CYP4A蛋白在培养的牛肺动脉内皮细胞、平滑肌细胞及牛肾动脉内皮细胞的表达;采用原位杂交法检测细胞色素P450 CYP4A mRNA在大鼠肺支气管内皮和血管内皮细胞的表达;以14C标记的花生四烯酸(AA)作为反应底物,用荧光高效液相色谱法(HPLC)通过检测牛肺动脉内皮细胞催化外源性AA生成20-羟基廿碳四烯酸(20-HETE)的反应,确定肺动脉内皮细胞是否存在细胞色素P450 CYP4A;将肺动脉内皮细胞破碎并用乙酸乙酯萃取,用荧光物质标记萃取物,用荧光HPLC检测内源性20-HETE,从代谢产物水平确定细胞色素P450 CYP4A的功能蛋白质表达。结果①Western印迹法分析结果表明,细胞色素P450 CYP4A蛋白在牛肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞中均有表达,在肺动脉内皮细胞中的表达明显高于平滑肌细胞(积分吸光度值分别为10182±279,5249±167);在牛肾动脉内皮细胞中也有表达,但明显低于肺动脉内皮细胞的表达(积分吸光度值分别为12173±171,17863±207)。②原位杂交结果显示,细胞色素P450 CYP4A mRNA可在大鼠肺支气管内皮细胞和大鼠肺血管内皮均有表达。③用HPLC在牛肺动脉内皮细胞中检测到20-HETE,表明细胞色素P450 CYP4A在肺动脉内皮细胞存在。结论细胞色素P450 CYP4A有其特定的组织和细胞分布,在牛和大鼠肺脏动脉内皮细胞有高表达。     

细胞色素P450 3A在胎肾上腺和胎肝中的表达

采用酶学和逆转录聚合酶链式反应 ( RT-PCR)技术 ,研究与药物代谢密切相关的细胞色素P450 3A( CYP3A)在胎肾上腺和胎肝中的表达 .结果表明 ,胎肾上腺微粒体中苄非他明 ,氨基比林 ,红霉素 N-脱甲基酶和睾酮 6β-羟化酶活性分别为胎肝微粒体的 2 1 % ,2 60 % ,1 0 5%和 33% .CYP诱导剂苯巴比妥能显著增加体外培养胎肾上腺细胞中苄非他明和氨基比林 N-脱甲基酶活性 ,诱导剂地塞米松也能明显诱导红霉素 N-脱甲基酶活性 .RT- PCR表明胎肾上腺和胎肝中存在 CYP3A7m RNA表达 .说明胎肾上腺和胎肝中存在 CYP3A亚族 .上述结果提示处于发育时期的肾上腺具有与胎肝能力相当的药物代谢功能 .     

普罗帕酮经转人肝CYP3A4基因中国仓鼠CHL细胞代谢的立体选择性

目的:研究普罗帕酮(PPF)经人肝CYP3A4代谢的立体选择性。方法:以转人肝CYP3A4基因中国仓鼠肺细胞CHL的S_9为酶源,考察了PPF消旋体及单个对映体在高、低底物浓度时的经时孵育代谢。对映体抑制试验用于考察对映体之间的相互作用。并进行了单个对映体的酶动力学试验。结果:PPF消旋体高底物浓度(400mg/L)时的代谢无立体选择性,低底物浓度(10mg/L)时R(-)-体代谢快于S( )-体(R>S);单个对映体孵育时在高底物浓度(200mg/L)时的代谢呈现对S( )-体的立体选择性(S>R),低底物浓度(5mg/L)时呈现对R(-)-体的立体选择性(R>S)。S( )-PPF的V_(max)(μmol·mg~(-1)·min~(-1))大于R(-)-体(2.66±0.32 vs 1.71±0.19,P<0.01)。R(-)-PPF的K_m(μmol·L~(-1))小于S( )-体(73±11 vs 185±17,P<0.001)。R(-)-PPF对S( )-体有代谢抑制作用(IC_(50)=125μmol·L~(-1))。结论:PPF经人肝CYP3A4的代谢有底物浓度依赖性的立体选择性。高底物浓度时两对映体有相互作用,相互作用的结果导致立体选择性丧失。而低底物浓度时两对映体无相互作用,结果仍表现出R体代谢优先的立体选择性。     

Effect of single and repeat doses of casopitant on the pharmacokinetics of CYP450 3A4 substrates midazolam and nifedipine

AIM

To evaluate the impact of single and repeated doses casopitant on the pharmacokinetics of single dose midazolam and nifedipine (CYP3A substrates) in healthy subjects. The effect on debrisoquine metabolism (CYP2D6 substrate) was also assessed.

METHODS

Three open-label studies were conducted in healthy subjects. In the first study subjects received single dose 50 or 100 mg oral casopitant, single dose 5 mg oral midazolam and single dose 10 mg oral debrisoquine. In the other two studies subjects received repeated doses of 10 mg (study 2), 30, or 120 mg oral casopitant and single doses of 5 mg oral midazolam (study 2) and single doses of 10 mg oral nifedipine (study 3). Plasma concentration–time data were analyzed using standard non-compartmental methods. The effect of casopitant on all probes was assessed using geometric means ratios and corresponding 90% confidence intervals (CIs).

RESULTS

The AUC(0,∞) of midazolam was increased 1.44-fold (90% CI 1.35, 1.54) and 1.52-fold (90% CI 1.41, 1.65) after co-administration with a single dose of 50 or 100 mg casopitant, respectively. Debrisoquine metabolism was unchanged. After 3 days of casopitant administration, midazolam AUC(0,∞) was increased 1.45- (90% CI 1.32, 1.59), 2.02- (90% CI 1.75, 2.32), and 2.67-fold (90% CI 2.18, 3.27) after co-administration with 10, 30 or 120 mg casopitant, respectively. After 14 days of casopitant administration, midazolam AUC(0,∞) was increased 1.51- (90% CI 1.40, 1.63) to 3.49-fold (90% CI 2.98, 4.08). After 3 days of casopitant administration, nifedipine AUC(0,∞) was increased 1.56- (90% CI 1.37, 1.78) and 1.77-fold (90% CI 1.54, 2.04) after co-administration with 30 or 120 mg casopitant, respectively. Similar increases in nifedipine exposure were observed after 14 days of casopitant administration.

CONCLUSIONS

Casopitant is a dose- and duration-dependent weak to moderate inhibitor of CYP3A.     

人细胞色素P450 3A4突变体CYP3A4.3,CYP3A4.4,CYP3A4.5和CYP3A4.18重组酶的异源表达与活性

目的重组表达人细胞色素P450(CYP)3A4突变体CYP3A4.3,CYP3A4.4,CYP3A4.5和CYP3A4.18蛋白,为CYP3A4代谢活性的体外研究提供单一酶源。方法应用杆状病毒表达系统构建含有上述各CYP3A4突变体基因序列的重组病毒,将其连同含人源还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-P450氧化还原酶(POR)和细胞色素b5基因的重组病毒共同感染昆虫草地夜蛾细胞Sf9得到CYP3A4突变体与POR和细胞色素b5共表达的重组蛋白,分别以高效液相色谱法和荧光分析法测定各重组酶对睾酮和7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素的代谢活性。结果在mRNA分子水平上验证了CYP3A4突变体CYP3A4*3,CYP3A4*4,CYP3A4*5和CYP3A4*18基因在Sf9细胞中的转录。感染了各重组病毒的Sf9细胞裂解液对睾酮和7-苄氧基-4-三氟甲基香豆素有明显代谢。结论应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统在体外成功表达了具有催化活性的人CYP3A4突变体CYP3A4.3,CYP3A4.4,CYP3A4.5和CYP3A4.18蛋白,其中CYP3A4.5活性显著低于野生型蛋白,CYP3A4.18活性显著高于野生型蛋白,而CYP3A4.3和CYP3A4.4与野生型蛋白活性近似。     

己烯雌酚对人肝微粒体内CYP3A4和CYP2C9酶的抑制作用

目的:体外实验考察己烯雌酚(DES)对细胞色素P450 3A4(CYP3A4)和细胞色素P450 2C9(CYP2C9)活性的抑制作用,以评佑DES通过抑制这两个重要的细胞色素P450(CYP)亚型而引发药物-药物相互作用的可能性.方法:混合人肝微粒体与不同浓度的DES(或阳性抑制剂),CYP3A4或CYP2C9的探针...     

注射用丹参总酚酸(冻干)对人CYP450酶和P-糖蛋白体外抑制作用及对大鼠CYP1A2和CYP3A体内诱导作用(英文)

目的探讨注射用丹参总酚酸(冻干)(SLI)对人CYP450酶和P-糖蛋白体外抑制作用以及对大鼠CYP1A2和CYP3A体内诱导作用。方法①应用P450-GloTMCYP450检测试剂盒,通过化学发光法测定SLI和经典抑制剂对细胞色素P4501A2(CYP1A2),CYP2D6,CYP3A4,CYP2C19和CYP2C9的IC50值,通过比较SLI和经典抑制剂对相应细胞色素P450亚型的IC50值来判断SLI对人CYP450酶的体外抑制作用。②Wistar大鼠分别iv给予SLI 3,10和30 mg·kg-1和诱导剂苯巴比妥钠20 mg·kg-1,采用探针底物法,通过比较代谢产物的生成速率来评价SLI对大鼠CYP1A2和CYP3A的诱导作用。③应用ATP酶检测试剂盒,通过化学发光法测定ATP酶活性来评价SLI是否为P-gp的底物或抑制剂。结果①CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6和CYP3A4抑制剂的IC50与SLI对其的IC50进行比较(CYP1A2:0.12μmol·L-1vs 840μmol·L-1;CYP2C9:3.362μmol·L-1vs 704μmol·L-1;CYP2C19:3.236μmol·L-1vs 306μmol·L-1;CYP2D6:0.117μmol·L-1vs 2660μmol·L-1;CYP3A4:0.078μmol·L-1vs 1780μmol·L-1)。②与空白对照组(86.4±6.3)nmol·g-1.min-1相比,SLI 3,10和30 mg·kg-1组CYP1A2活性分别为83.4±6.6,82.5±4.0和(83.4±6.6)nmol·g-1.min-1。与空白对照组(16.1±0.9)nmol·g-1.min-1比较,SLI 3,10和30 mg·kg-1组CYP3A活性分别为15.7±0.6,15.9±0.7和(15.9±1.0)nmol·g-1.min-1,无显著性差异。③以临床血药浓度为依据设计的一系列浓度的SLI 0.0002,0.0006,0.002,0.006,0.017,0.052,0.156和0.468 g.L-1的ATP酶活性分别与空白对照组进行比较(5.8,5.3,5.8,5.5,5.8,5.2,,5.8,5.3,vs 5.75μmol·g-1.min-1),无显著性差异。结论SLI临床给药剂量既不能体外抑制人CYP1A2,CYP2D6,CYP3A4,CYP2C19和CYP2C9酶活性,也不能诱导大鼠CYP1A2和CYP3A,同时也不是P-gp的体外抑制剂或底物。     

伊曲康唑对健康成人肝细胞微粒体细胞色素P450同工酶1A2、3A4活性的作用

目的观察伊曲康唑对健康成人肝细胞微粒体细胞色素P450同工酶1A23、A4活性的作用,为临床上安全有效地联合用药提供实验依据。方法采用健康成人肝细胞微粒体,分为对照组和伊曲康唑处理组。处理组分别加入0.1、0.2、1.0、2.0、10.0、20.0 mg.L-1的伊曲康唑1mL,对照组仅加入培养液,孵育15 min后再加入CYP450同工酶1A2和3A4的相应底物(分别为非那西丁和睾酮)再孵育20min。反应终止后用高效液相色谱仪测量代谢产物(分别为对乙酰氨基酚与6β-羟基睾酮)的生成量代表1A2和3A4的活性。结果细胞色素P450同工酶1A2的相对活性百分比各处理组与对照组比较差异无显著性意义(P>0.05),而同工酶3A4的相对活性百分比随伊曲康唑质量浓度增加逐渐减小,各处理组与对照组比较差异均有显著性意义(P<0.05)。细胞色素P450同工酶3A4的相对活性百分比减小到对照组50%时(IC50)伊曲康唑的质量浓度为0.16 mg.L-1。结论伊曲康唑在临床应用血药质量浓度范围内,对健康成人肝细胞微粒体细胞色素P450同工酶1A2的活性无显著影响,然而对细胞色素P450同工酶3A4的活性有抑制作用。     

探针药物法测定CYP450 3A的活性

目的：以睾酮为探针药物采用高效液相色谱法测定GYP4503A的活性。方法：采用大鼠肝微粒体体外代谢模型,以有机溶剂乙腈终止反应并沉淀蛋白,上清液进高效液相色谱分析。根据Lineweaver-Burk双倒数作图法方程式计算酶动力学参数。结果：在蛋白浓度为1．0mg&#183;mL^-1,反应时间为5min时酶促反应近似直线进行,测得酶动力学参数Km值为38．84μmol&#183;L^-1,Vmax值为1．83μmol&#183;L^-1&#183;min^-1&#183;mg^-1 protein。结论：本方法简便、有效,适合实验室用于测定CYP4503A的活性,为进一步研究药物相互作用奠定了基础。     

Pharmacokinetics of midazolam in CYP3A4- and CYP3A5-genotyped subjects

Objective We investigated whether differences in pharmacokinetics of midazolam, a CYP3A probe, could be demonstrated between subjects with different CYP3A4 and CYP3A5 genotypes.Methods Plasma concentrations of midazolam, and of total (conjugated + unconjugated) 1OH-midazolam, and 4OH-midazolam were measured after the oral administration of 7.5 mg or of 75 µg of midazolam in 21 healthy subjects.Results CYP3A5*7, CYP3A4*1E, CYP3A4*2, CYP3A4*4, CYP3A4*5, CYP3A4*6, CYP3A4*8, CYP3A4*11, CYP3A4*12, CYP3A4*13, CYP3A4*17 and CYP3A4*18 alleles were not identified in the 21 subjects. CYP3A5*3, CYP3A5*6, CYP3A4*1B and CYP3A4*1F alleles were identified in 20, 1, 4 and 2 subjects, respectively. No statistically significant differences were observed for the AUC_inf values between the different genotypes after the 75-µg or the 7.5-mg dose.Conclusion Presently, CYP3A4 and CYP3A5 genotyping methods do not sufficiently reflect the inter-individual variability of CYP3A activity.     

Cytochrome P450 2C8 and CYP3A4/5 are involved in chloroquine metabolism in human liver microsomes

Chloroquine has been used for many decades in the prophylaxis and treatment of malaria. It is metabolized in humans through the N-dealkylation pathway, to desethylchloroquine (DCQ) and bisdesethylchloroquine (BDCQ), by cytochrome P450 (CYP). However, until recently, no data are available on the metabolic pathway of chloroquine. Therefore, the metabolic pathway of chloroquine was evaluated using human liver microsomes and cDNA-expressed CYPs. Chloroquine is mainly metabolized to DCQ, and its Eadie-Hofstee plots were biphasic, indicating the involvement of multiple enzymes, with apparent Km and Vmax values of 0.21 mM and 1.02 nmol/min/mg protein 3.43 mM and 10.47 nmol/min/mg protein for high and low affinity components, respectively. Of the cDNA-expressing CYPs examined, CYP1A2, 2C8, 2C19, 2D6 and 3A4/5 exhibited significant DCQ formation. A study using chemical inhibitors showed only quercetin (a CYP2C8 inhibitor) and ketoconazole (a CYP3A4/5 inhibitor) inhibited the DCQ formation. In addition, the DCQ formation significantly correlated with the CYP3A4/5-catalyzed midazolam 1-hydroxylation (r = 0.868) and CYP2C8-catalyzed paclitaxel 6alpha-hydroxylation (r = 0.900). In conclusion, the results of the present study demonstrated that CYP2C8 and CYP3A4/5 are the major enzymes responsible for the chloroquine N-deethylation to DCQ in human liver microsomes.