瘤内注射β干扰素基因转染的人骨髓间充质干细胞对前列腺癌皮下移植瘤的治疗作用

目的 观察人β干扰素(IFN-β)基因修饰的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)治疗人前列腺癌皮下移植瘤的作用.方法 构建人IFN-β基因腺病毒表达载体Ad-IFN-β,体外转染hMSCs,使用4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)标记表达IFN-β的hMSCs(IFN-β -hMSCs).应用人前列腺癌细胞株PC-3异种皮下种植建立前列腺癌动物模型,IFN-β-hMSCs瘤内注射入小鼠模型体内,收集肿瘤和肝、肺、脾、肾等脏器作冰冻切片和石蜡切片,荧光显微镜下观察肿瘤及各脏器中]FN-β -hMSCs的分布情况,记录IFN-β -hMSCs瘤内注射后荷瘤小鼠肿瘤大小及生存期.结果 瘤内注射IFN-β -hMSCs后14 d,前列腺癌组织冰冻切片和石蜡切片中均可见DAPI标记的IFN-β -hMSCs,而肝、肺、脾、肾等脏器的切片中均未见IFN-β -hMSCs的存在.瘤内注射IFN-β -hMSCs可延长荷瘤鼠的生存期,抑制肿瘤的生长,实验组与对照组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 IFN-β -hMSCs在体内能够抑制前列腺癌移植瘤的生长,延长荷瘤鼠的生存期.     

骨髓间充质干细胞对小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤的作用

目的 研究骨髓间充质干细胞(MSCs)对小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤的影响。方法 自C57BL/6小鼠骨髓分离MSCs,制备单细胞悬液并于体外传代培养,取第4～5代细胞用于实验。56只C57BL/6小鼠经Lewis肺癌细胞皮下接种建立小鼠肺癌皮下移植瘤模型,根据MSCs给予时间分为D0组(接种同时给予MSCs)和D10组(接种后第10天给予MSCs）,其中D0组分为3个亚组（n=8）：组1单纯接种肿瘤细胞,组2肿瘤细胞和MSCs共同接种,组3肿瘤细胞接种及尾静脉注射MSCs;D10组分为4个亚组（n=8）：组4(肿瘤细胞接种及瘤体内注射MSCs)及其等量PBS对照组（组5）,组6（肿瘤细胞接种及尾静脉注射MSCs）及其等量PBS对照组（组7）。观察各组移植肿瘤的生长情况,包括肿瘤形成时间及不同时间点的瘤体大小,并进行组间分析比较。结果 在D0组,组1、2、3肿瘤形成时间分别为（9.37±1.41）d、（7.62±1.40）d和（9.25±1.49）d,与组1和组3比较,组2的肿瘤形成时间明显缩短（P<0.05）;而各时间点三组瘤体大小比较,差异无统计学意义（P>0.05）。组4的瘤体显著大于其对照组（P<0.05）;而组6与其对照组的瘤体大小比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论 MSCs与Lewis细胞同时接种可加速小鼠肺癌皮下移植瘤形成,而成瘤后MSCs瘤体内注射具有促进移植瘤生长的作用。     

骨髓间充质干细胞对小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤的作用

目的 研究骨髓间充质干细胞(MSCs)对小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤的影响.方法 自C57BL/6小鼠骨髓分离MSCs,制备单细胞悬液并于体外传代培养,取第4～5代细胞用于实验.56只C57BL/6小鼠经Lewis肺癌细胞皮下接种建立小鼠肺癌皮下移植瘤模型,根据MSCs给予时间分为D0组(接种同时给予MSCs)和D10组(接种后第10天给予MSCs),其中D0组分为3个亚组(n=8):组1单纯接种肿瘤细胞,组2肿瘤细胞和MSCs共同接种,组3肿瘤细胞接种及尾静脉注射MSCs;D10组分为4个亚组(n=8):组4(肿瘤细胞接种及瘤体内注射MSCs)及其等量PBS对照组(组5),组6(肿瘤细胞接种及尾静脉注射MSCs)及其等量PBS对照组(组7).观察各组移植肿瘤的生长情况,包括肿瘤形成时间及不同时间点的瘤体大小,并进行组间分析比较.结果 与组1和组3比较,组2的肿瘤形成时间明显缩短(P<0.05);而各时间点三组瘤体大小比较,差异无统计学意义(P>0.05).组4的瘤体显著大于其对照组(P<0.05);而组6与其对照组的瘤体大小比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 MSCs与Lewis细胞同时接种可加速小鼠肺癌皮下移植瘤形成,而成瘤后MSCs瘤体内注射具有促进移植瘤生长的作用.     

人骨髓间充质干细胞移植对肝衰竭大鼠的治疗作用

目的:探讨体外诱导肝向分化成功后的人骨髓间充质干细胞经门静脉移植对肝衰竭大鼠肝功能及组织的影响。方法:人骨髓间充质干细胞传至第6代后,体外利用肝细胞生长因子(HGF)和上皮细胞生长因子(EGF)诱导其肝向分化。使用四氯化碳建立急性肝衰竭大鼠模型,随机分5组:HGF诱导分化细胞移植组、EGF诱导分化细胞移植组、HGF+EGF联合诱导移植组、无诱导细胞移植组和无细胞移植组,经门静脉移植人骨髓间充质干细胞,分别于移植后12 h、72 h、7 d、1月和2月时间点观察检测肝功能指标及肝脏病理的变化情况。结果:HGF诱导分化细胞移植组、EGF诱导细胞移植组、HGF+EGF联合诱导移植组、无诱导细胞移植组大鼠的生存情况、谷丙转氨酶、胆红素、白蛋白水平各指标较无细胞移植组均明显改善,差异有统计学意义(P<0.05);但HGF诱导细胞移植组、EGF诱导细胞移植组和HGF+EGF联合诱导移植组各指标较无诱导细胞移植组,差异无统计学意义(P>0.05)。病理分析提示细胞移植组的大鼠肝显微结构较无细胞移植组改善明显。结论:肝向分化的人骨髓间充质干细胞移植入肝衰竭大鼠体内能够显著改善肝功能。     

转染hVEGF165基因的骨髓间充质干细胞移植治疗兔心肌梗死

1 材料和方法 1.1 材料 健康纯种新西兰大白兔48只,雌雄不拘,体质量2.0～2.5 kg,兔龄4～5 mo,由岭南科研动物中心提供.低糖DMEM(Gibco产品);Percoll分离液(Pharmacia产品);VIII因子多克隆抗体及免疫组化检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);BrdU mAb BrdU检测试剂盒(Roche产品);AdTrackCMV-VEGF165真核表达质粒(由广东省人民医院中心实验室惠赠);LipofectamineTM 2000 reagent(GIBCOL).     

血管内皮细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗疾病研究进展

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）是存在于骨髓基质中,具有干细胞特性,能够进行自我更新,有多向分化潜能的一类细胞。血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是目前发现的促血管生成作用最强的因子,其具有促进血管生成,改善细胞的生存环境,从而提高细胞的存活率。目前,采用BMSC移植治疗各种疾病,已经取得了很大的疗效,但为了追求进一步的完善,许多学者利用BMSC具有独特的细胞增殖分裂模式,容易导入和表达外源基因,将VEGF基因转染入BMSC来治疗缺血性疾病,     

基因联合骨髓间充质干细胞移植治疗心力衰竭

各种心脏疾病发生后,因为心肌细胞增殖能力极低,坏死心肌有纤维组织替代,最终导致心力衰竭。细胞移植或基因治疗是指通过某种方式,使具有高度复制和高度分化能力的细胞群体或基因到达病变的心肌,在适宜的条件下,再生出新的心肌和血管,改善心肌血液供应和心功能。细胞移植合并基因治疗可能是此领域的革命性进展。尽管机制不详且仍有许多问题尚待解决,但仍然是一种很有前景的治疗手段。     

骨髓间充质干细胞黑质内移植对帕金森病大鼠的治疗作用

目的 探索骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植到帕金森病（PD）大鼠毁损侧黑质内，PD模型大鼠的姿势不对称性和黑质及纹状体内酪氨酸羟化酶（TH）表达的改变，以及BMSCs在大鼠脑内的存活、分化情况。方法 黑质、前脑内侧束两点法注射6-羟多巴胺（6-OHDH）并行为学分析筛选PD模型大鼠。将PD模型大鼠随机分为移植组和对照组。BMSCs移植术后4周和8周，观察大鼠姿势不对称性，免疫组织化学及免疫荧光显色方法检测黑质和纹状体TH的表达变化以及BMSCs在大鼠体内的存活、迁移及分化情况。结果 BMSCs黑质内移植使可PD模型大鼠的转动频率由10.62?.97 r/min降至4.65?.08 r/min（P<0.01），显著增加毁损侧黑质TH阳性细胞数量和纹状体内TH阳性纤维密度。BMSCs在大鼠黑质内可以存活至少8周，部分细胞分化为神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。结论 黑质内移植BMSCs对PD模型大鼠有一定的治疗作用。     

PDGF-B基因转染骨髓间充质干细胞的研究

目的：探讨血小板源性生长因子B（PDGF-B）基因转染修饰大鼠骨髓闻克质干细胞（MSC）的可行性。方法：应用FAM标记重组真核表达载体系统（pcDNA3-PDGF-B）。以脂质体法转染原代MSC。观察转染结果、表达情况孕对靶细胞活力的影响。结果：MSC的基因转染成功，持续表达时间超过了8周，没有发现明显的细胞毒作用及对细胞活力的显著影响。结论：采用真柱转染技术可以介导外源基因转染MSC，MSC是一种理想的基因载体细胞。可用于PDGF-B的基因治疗。     

血管内皮生长因子基因转染的骨髓间充质干细胞移植对大鼠肺动脉高压的治疗作用

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)基因转染的骨髓间充质干细胞(MMSC)移植治疗肺动脉高压(PH)的疗效和机制.方法 体外分离培养SD大鼠MMSC,将含有增强型绿色荧光蛋白的VEGF质粒转进MMSC.将SD大鼠随机分为4组:正常对照组、PH模型组;MMSC移植组,转基因移植组.一次性项背部皮下注射野百合碱(50 mg/kg),复制PH模型,观察21 d后,MMSC移植组及转基因移植组分别给予浓度为5×106个细胞/ml和5×105个细胞/ml的MMSC悬液1 ml静脉注射,模型组及正常组均给予等量L-DMEM液注射.移植后30 d,观察4组大鼠一般情况、生存率、右心室收缩压(RVSP)、右心室肥大指数(RVH)、血气及肺小动脉的微观结构变化.结果 移植后30 d,MMSC移植组及转基因移植组大鼠的RVSP分别为(30.2 ±2.1)和(29.2±1.1)mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),RVH分别为(37.9 ±3.2)%和(27.2±3.4)%,肺小动脉中膜厚度(MT)分别为(21.3±3.4)和(14.3±2.8)μm,肺小动脉管腔横截面积与血管总横截面积的比值(V/T)分别为(39.3 ±4.3)%和(43.0 ±1.5)%.上述指标与PH模型组相比差异均有统计学意义(P<0.01);其中MMSC移植组与转基因移植组间RVH、MT及V/T的差异有统计学意义(P<0.05).另外,MMSC移植组与转基因移植组动脉血气各指标较PH模型组均明显改善(P<0.05).同时观察到肺内损伤血管修复和血管新牛现象.结论 转染有VEGF165基因的MMSC移植可有效减轻并逆转野百合碱诱导的PH进程,此作用较单纯移植MMSC的治疗效果更加明显.其作用机制可能与血管修复及血管新生有关.     

重组hTGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞及其表达

目的 探讨携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(adeno-hTGF-β1)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其表达的可行性.方法 重组adeno-hTGF-β1经293细胞包装、扩增后,转染猪BMSCs.转染后72 h,RT-PCR检测BMSCs的hTGF-β1mRNA表达;免疫细胞化学染色定性和酶联免疫吸附定量测定(ELISA法)hTGF-β1蛋白表达;MTT法测定水貂肺上皮细胞(MV-1-Lu)的生长抑制率,以验证转染后所表达的hTGF-β1蛋白的生物学活性.结果 转染后72 h,BMSCs能有效表达hTGF-β1mRNA,胞浆内有大量棕黄色的hTGF-β1蛋白表达,其蛋白表达量是转染adeno-lacZ的2.65倍(P＜0.05);MTT法检测结果显示,转染adeno-hTGF-β1的BMSCs所分泌的hTGF-β1蛋白对MV-1-Lu细胞的生长有显著抑制作用.结论 重组adeno-hTGF-β1能够被导入BMSCs,并表达有生物学活性的hTGF-β1蛋白.为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础.     

重组hTGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞及其表达

目的探讨携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(adeno-hTGF-β1)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其表达的可行性。方法重组adeno-hTGF-β1经293细胞包装、扩增后,转染猪BMSCs。转染后72 h,RT-PCR检测BMSCs的hTGF-β1mRNA表达;免疫细胞化学染色定性和酶联免疫吸附定量测定(ELISA法)hTGF-β1蛋白表达;MTT法测定水貂肺上皮细胞(MV-1-Lu)的生长抑制率,以验证转染后所表达的hTGF-β1蛋白的生物学活性。结果转染后72 h,BMSCs能有效表达hTGF-β1mRNA,胞浆内有大量棕黄色的hTGF-β1蛋白表达,其蛋白表达量是转染adeno-lacZ的2.65倍(P<0.05);MTT法检测结果显示,转染adeno-hTGF-β1的BMSCs所分泌的hTGF-β1蛋白对MV-1-Lu细胞的生长有显著抑制作用。结论重组adeno-hTGF-β1能够被导入BMSCs,并表达有生物学活性的hTGF-β1蛋白。为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础。     

人骨髓间充质干细胞脑内移植对食蟹猴脑出血的治疗作用

目的 评价人骨髓间充质干细胞脑内移植对食蟹猴脑出血模型的治疗作用.方法 符合普通级标准的成年食蟹猴12只,用自体股动脉抗凝血脑内注射方法建模后1周,用脑立体定位法在血肿周围植入人骨髓间充质干细胞,细胞数分别为高剂量5×106、低剂量1×106、对照组等体积生理盐水.利用MRI、PET、神经功能缺损评分和组织病理学对干细胞移植效果进行评价.结果 神经功能评分显示干细胞移植1周后动物神经功能明显改善.PET结果显示干细胞移植后2周高剂量组血肿周围皮层、基底节核团的SUV％值与对照组间存在显著性差异(P=0.02).移植后3周高、低剂量组血肿周围皮层、基底节核团的SUV％值与对照组间差异存在显著性(P值分别为0.03和0.04).MRI显示剂量组血肿吸收速度大于对照组.病理检查可见剂量组坏死灶面积小于对照组,出血灶周围有大量新生血管生成,剂量组与对照组间差异存在显著性(P＜0.01).结论 在损伤脑组织周围移植hBMSC可促进食蟹猴损伤神经组织的恢复,为hBMSC治疗脑出血的临床应用提供了重要实验依据.     

人VEGF基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：建立人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的方法。方法：采用密度梯度离心-贴壁培养法获Wistar大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,测定其生长曲线和表面标志CD34,CD44,CD45及SH3,检测其向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化潜能后;用脂质体介导法将pcDNA3.1-hVEGF165导入MSCs,观察转染后细胞形态和生长状况,通过RT-PCR,Western blot和ELISA鉴定VEGF在MSCs中的表达情况。结果：大鼠MSCs经检测为CD44和SH3阳性,CD45和CD34阴性,可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞;经RT-PCR,Western和ELISA检测证实阳离子脂质体能成功地将hVEGF。转染至大鼠MSCs,并获得有效的表达。结论：真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165在MSCs中获有效表达。     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑梗死的治疗作用

目的观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)对缺血性脑损伤的保护和修复作用,探讨不同时间点移植BMSCs对大鼠脑梗死治疗效果的差异。方法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型,在MCAO术后3、6、12、24、72 h这5个时间点经尾静脉移植BMSCs到脑梗死大鼠,并与PBS移植组和空白对照组进行脑梗死体积和神经损伤严重程度评分(NSS)比较。结果MCAO术后28 d,TTC染色显示:与PBS移植组和空白对照组比较,BMSCs移植组的脑梗死体积明显减小(P<0.05);随着细胞移植时间推后,梗死体积逐渐增大,BMSCs 3、6、12、24、72 h移植组脑梗死体积分别为(40±27)、(80±25)、(123±21)、(161±19)和(202±27)mm3。BMSCs移植组大鼠NSS明显低于PBS移植组和空白对照组(P<0.05),并且BMSCs移植越早,NSS越低。结论在MCAO术后3~72 h移植BMSCs对大鼠脑梗死都有治疗效果,并且移植越早,治疗效果越好。     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑梗死的治疗作用

目的 观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)对缺血性脑损伤的保护和修复作用,探讨不同时间点移植BMSCs对大鼠脑梗死治疗效果的差异. 方法 建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型,在MCAO术后3、6、12、24、72 h这5个时间点经尾静脉移植BMSCs到脑梗死大鼠,并与PBS移植组和空白对照组进行脑梗死体积和神经损伤严重程度评分(NSS)比较. 结果 MCAO术后28 d,TTC染色显示:与PBS移植组和空白对照组比较,BMSCs移植组的脑梗死体积明显减小(P＜0.05);随着细胞移植时间推后,梗死体积逐渐增大,BMSCs 3、6、12、24、72 h移植组脑梗死体积分别为(40±27)、(80±25) 、(123±21)、(161±19)和(202±27) mm3.BMSCs移植组大鼠NSS明显低于PBS移植组和空白对照组(P＜0.05),并且BMSCs移植越早,NSS越低. 结论 在MCAO术后3～72 h移植BMSCs对大鼠脑梗死都有治疗效果,并且移植越早,治疗效果越好.     

人骨髓间充质干细胞分离培养鉴定及VEGF基因的转染

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSC）分离培养、鉴定方法及人血管内皮生长因子（hVEGF）165基因转染hMSC后表达情况,拟构建血管化组织工程皮肤.方法：用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,筛选贴壁细胞培养并传代.观察细胞形态,生长情况.检验细胞CD44、CD29、CD14、CI45等表面标记.利用基因重组技术,构建pCDN3.1＋VEGF表达质粒,并将其转染第3代hMSC.经G418抗性筛选后扩大培养并用Western blot实验检测其蛋白产物.结果：骨髓密度梯度离心法分离hMSC,接种培养瓶后26 h呈对数生长,6d后达到高峰.hMSC表达CD29,CD44,不表达造血细胞标记物CD14和CD45.通过酶切鉴定验证成功构建pCDN3.1＋ VEGF表达质粒.Western blotting实验证实转染后hMSCs表达VEGF增加.结论：成功建立hMSC分离培养鉴定体系.利用基因重组技术可成功将hVEGF基因导入hMSC并产生预期效应.     

SPK1基因转染对大鼠骨髓间充质干细胞的影响

目的观察鞘氨醇激酶-1（SPK-1）基因修饰对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响。方法分别用携带SPK-1和绿色荧光蛋白（GFP）的腺病毒载体,感染大鼠骨髓间充质干细胞后用WesternBlot的方法检测SPK1蛋白表达,用[32P]ATP掺入法检测SPK-1酶活性,用MTT法测定细胞增殖,用特殊诱导剂在体外向成骨和成脂细胞诱导后检测碱性磷酸酶的活性及油红O染色,用AnnexinV-PI双标法检测去血清诱导后细胞凋亡比例。结果Ad-SPK感染大鼠骨髓间充质干细胞后可有效表达SPK-1蛋白且有较高的酶活性;基因转染不影响MSC的增殖和向成骨、成脂细胞的分化,但可显著抑制去血清诱导的细胞凋亡。结论腺病毒介导的SPK-1基因转染不影响MSC的增殖、分化等干细胞基本特性,但可显著增强其抗凋亡能力。