利用分子方法鉴别白花蛇舌草及其伪品伞房花耳草

目的:建立一种鉴别白花蛇舌草及其常见伪品伞房花耳草的分子方法，确保临床用药安全。方法:根据白花蛇舌草和伞房花耳草内转录间隔区2(ITS2)序列的差异设计特异探针，采用多重连接探针扩增(MLPA)技术和实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)技术，建立了一种能够鉴别白花蛇舌草、伞房花耳草的多重连接探针扩增-实时荧光定量PCR(MLPA-qPCR)方法。结果:对扩增产物进行熔解曲线分析，结果显示，所设计的MLPA探针具有良好的特异性，探针之间不存在交叉反应，白花蛇舌草探针的特异性熔解曲线T_m值为(81.8±0.2)℃,伞房花耳草探针的熔解曲线T_m值为(84.0±0.2)℃;灵敏度分析结果表明，该方法检出白花蛇舌草和伞房花耳草的最低模板量均为0.1 ng;掺伪检测试验结果表明，当白花蛇舌草探针与伞房花耳草探针比例为1.0∶0.6时，白花蛇舌草中掺杂1%的伞房花耳草仍可被有效检出。对收集的39份样品进行检测，成功鉴别白花蛇舌草25份、伞房花耳草12份、白花蛇舌草与伞房花耳草混合样品2份。结论:本研究所建立...     

多重连接探针扩增-高分辨熔解法鉴别鸡血藤及其常见混伪品

目的 采用分子生物学技术鉴别鸡血藤及其常见3种混伪品。方法 根据4个物种核基因组内转录间隔区2(ITS2)序列差异设计特异性探针，结合运用多重连接探针扩增(MLPA)技术与高分辨熔解(HRM)曲线技术，根据特异性探针熔解温度(T_m)差异鉴别鸡血藤及其常见混伪品大血藤、白花油麻藤、香花鸡血藤。结果 4个物种特异性探针T_m值分别为：鸡血藤(87.0±0.2)℃、大血藤(82.8±0.2)℃、白花油麻藤(85.4±0.2)℃、香花鸡血藤(80.1±0.2)℃。探针特异性考察中，交叉反应与空白组均未产生熔解峰，表明探针具有良好特异性。构建的方法可用于1.0 ng模板DNA的检测，并可有效检出鸡血藤中掺混5%大血藤、白花油麻藤或香花鸡血藤。结论 基于MLPA-HRM技术建立的鸡血藤及其混伪品鉴别方法灵敏度高，特异性强，稳定性好，可有效解决市场上鸡血藤药材植物来源复杂、混伪品难以鉴别的问题。     

RNaseH依赖性PCR扩增结合熔解曲线法鉴别石菖蒲与藏菖蒲掺杂

目的 采用核糖核酸酶H依赖性PCR(rhPCR)扩增结合熔解曲线分析对石菖蒲与藏菖蒲进行快速鉴定及相互掺杂检测。方法 比对分析石菖蒲与藏菖蒲核基因组内转录间隔区2(ITS2)序列，寻找稳定的单核苷酸多态性(SNP)位点设计特异性扩增引物，根据扩增产物熔解温度(T_m)不同进行鉴别，考察引物特异性，筛选最佳混合引物比例，并考察该方法灵敏度、掺混检出限及适用性。结果 设计的特异性引物具有良好特异性，石菖蒲、藏菖蒲扩增产物可分别产生(89.4±0.2)与(87.9±0.2)℃的单一特异性熔解曲线峰。所建立的方法灵敏度高，DNA检出限均为0.1 ng,对石菖蒲和藏菖蒲的掺混检出限均为10%。检测样品28份，其中石菖蒲16份、藏菖蒲12份，检测结果与DNA条形码结果一致。结论 该研究基于RNase H依赖性PCR扩增结合熔解曲线建立的石菖蒲及藏菖蒲鉴别及掺杂检测方法可有效鉴别石菖蒲、藏菖蒲及掺杂样品，有利于石菖蒲药材质量控制。     

多重连接探针扩增技术鉴别半夏及其常见混伪品

目的 基于多重连接探针扩增技术(MLPA)建立一种中药材半夏与其常见伪品虎掌、滴水珠的分子鉴定方法,为半夏药材质量控制提供依据。方法 从Genbank数据库下载半夏属核基因组内转录间隔区(ITS)序列,利用MEGA 6.05版软件进行序列比对,依据半夏、虎掌及滴水珠ITS序列中的单核苷酸多态性(SNP)位点设计物种特异性MLPA探针,MLPA反应后采用熔解曲线法对扩增产物进行分析。结果 半夏、虎掌和滴水珠样品DNA与物种特异性MLPA探针可分别产生位于84.84,82.76及80.14℃的单一熔解峰,表明探针具有良好特异性;构建的探针体系可对0.1 ng模板DNA进行检测,并可有效检出半夏中掺混1%的虎掌或滴水珠样品。对市场收集样品进行检测,鉴别结果准确,灵敏度高。结论 该研究建立的多重连接探针扩增方法可准确鉴别半夏和虎掌、滴水珠,具有特异性强、灵敏度高等特点,可为半夏药材质量控制提供技术支持。     

小活络丸中小麦粉掺伪实时荧光PCR检测方法的建立

目的:通过实时荧光PCR-高分辨熔解曲线(HRM)联合分析技术,建立小活络丸(大蜜丸)中小麦粉掺伪快速、准确鉴别方法。方法:通过优化前处理方法,提取小活络丸样品的基因组;通过文献检索和生物信息学分析,得到小麦粉特异性引物;使用实时荧光PCR-HRM技术,对10批次小麦(粉)、16种其他禾本科植物及7种常见高淀粉食物样品进行特异性扩增,采用克隆测序对结果进行再确认;考察实时荧光PCR-HRM方法的检出限、精密度和重复性,同时对市售的小活络丸样品进行检测。结果:试验筛选获得了适用于本研究的特异性引物,建立了实时荧光PCR-HRM小活络丸掺伪小麦的检测方法;小活络丸样品掺伪小麦粉的检出限为0.01 g·g^-1,试验精密度C_t值为26.63(RSD=2.15%),T_m值为89.53℃(RSD=0.05%);重复性Ct值为26.65(RSD=3.20%),T_m值为89.53℃(RSD=0.12%)。试验对市售的4个厂家9批次共计81份样品进行分析,确定了3批次来源于A厂家的小活络丸样品存在小麦粉掺伪的问题,将PCR扩增产物克隆测序,其结果为小麦(Triticum Aestivum L.)。结论:本研究建立了实时荧光PCR-HRM检测方法,可以快速判定小活络丸中小麦粉掺伪样品。     

利用多重连接探针扩增结合熔解曲线法鉴别五味子与南五味子掺杂

目的 探究多重连接探针扩增技术(MLPA)结合熔解曲线在五味子和南五味子鉴别中的应用。方法 以五味子和南五味子为研究对象,基于其ITS2序列设计探针进行MLPA反应,通过分析荧光熔解曲线的Tm值对二者进行鉴别,并将此方法应用到市场随机收集的31份五味子和南五味子商品中,通过对聚合酶链反应(PCR)产物测序验证此方法的准确性。结果 两对探针都表现出很好的特异性和灵敏度,均只出现对应的单一熔解曲线峰,五味子产生82.3℃的熔解曲线峰,南五味子产生80.7℃的熔解曲线峰。31份五味子商品中,16份商品的熔解曲线Tm值与五味子吻合,15份商品的熔解曲线Tm值与南五味子吻合,实验结果与测序结果一致。结论 该研究建立的方法特异性强,灵敏度高,且操作简单方便,可以快速鉴别五味子及其掺混品。     

参桂鹿茸丸中人参掺伪检查研究

目的：建立参桂鹿茸丸中人参掺伪检查方法,考察企业是否存在使用西洋参或其边脚料替代人参投料的现象,为中药监管提供技术支持。方法：以西洋参特征组分拟人参皂苷F₁₁为掺伪检测依据,采用超高效液相色谱-串联质谱法,采用C₁₈(100 mm×2.1 mm,1.8μm)色谱柱,以甲醇和0.1%的甲酸水溶液为流动相梯度洗脱,流速0.3 mL·min^-1,柱温25℃;电喷雾正离子模式(ESI⁺),多反应监测(MRM)模式进行检测。结果：拟人参皂苷F₁₁进样浓度在12.32～616.00 ng·mL^-1范围内呈良好的线性关系(R²>0.9999);重复性试验的RSD为2.1%;平均回收率为102.6%,RSD=2.1%(n=9);43批样品中,16批样品检出西洋参,检出率高达37%。结论：该方法灵敏、准确,可作为参桂鹿茸丸中人参掺伪的检查方法。     

纳米级差示扫描荧光法在阿达木单抗热分析中的应用

目的:探讨纳米级差示扫描荧光法(nanoDSF法)检测阿达木单抗熔解温度(T_m)的可行性及潜在应用。方法:采用nanoDSF技术对0.25、0.5、1、5、10、50 mg·mL^-1 6个不同浓度下的阿达木单抗T_m进行检测，检测过程中参数设置：升温区间为25～95℃,升温速率为1℃·min^-1,收集内源性荧光信号测得T_m,重复检测5次。通过将阿达木单抗与制剂缓冲液的T_m检测结果进行比较，确认方法的特异性；通过6个不同浓度下阿达木单抗5次T_m检测结果的离散度评估，得到方法的精密度；通过将0.25、0.5、1 mg·mL^-1 3个浓度下阿达木单抗的T_m检测结果与相应浓度下的差式扫描量热法(DSC法)检测结果进行比较，对nano DSF技术的检测准确性进行评价；进行上述方法学验证后，将该技术应用于阿达木单抗原研药与6种生物类似药T_m的相似性评价。此外，本研究还通过收集抗体分子...     

掺杂、掺伪中药饮片的鉴别分析

目的探究掺杂以及掺伪的中药饮片的鉴别方法,并对检测方法进行分析。方法通过对常见的几种掺杂掺伪的中药饮片进行对比分析,概括总结了常见的中药饮片的掺杂掺伪的鉴别方法,并对几种掺杂掺伪的中药饮片的常规鉴别方法进行了对比分析。结果经检测,本地区内生产经营以及销售使用的中药饮片确实存在少量的掺杂掺伪现象,染色掺伪、形态掺伪、同源掺伪、重量掺伪以及浸提过的饮片掺伪等方法切实有效可靠。结论对于本地区内生产经营以及销售使用的中药饮片,有关部门需要加大检查和打击的力度,提高鉴别真假的能力,染色掺伪、非药用部位掺伪、形态掺伪、同源掺伪、重量掺伪以及浸提过的饮片掺伪等方法经检验确实有效可靠,值得大力推广和应用。     

熔解曲线分析检测临床常见4种革兰阳性菌的方法建立

目的 构建熔解曲线分析法同时检测4种临床常见革兰阳性病原菌,为临床感染性疾病的诊疗提供快速、敏感的分子生物学检测信息.方法 选取临床最常见的革兰阳性病原菌:金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌做为本课题研究的检测菌种.根据检测菌种的不同,分别选取不同菌种的特异性靶序列,设计种特异性引物.对种特异性引物分别用标准菌株、临床分离目标菌株、临床分离非目标菌株、非细菌性病原体以及人源基因组DNA进行常规PCR扩增以及扩增产物测序,验证引物的特异性.对目标菌种引物进行荧光PCR预实验,筛选Tm值差异较大的多对引物,进行熔解曲线分析法实验,并对熔解曲线法的反应条件与反应体系进行优化.对优化后的熔解曲线法进行特异性验证.通过检测加入人血液中的不同细菌浓度对该方法进行敏感性分析.应用所构建的方法分别检测临床分离目标菌种各20株,分析每种菌种的熔解曲线图,熔点温度(Tm值)及其标准差(SD)的变化,评价所构建方法的稳定性.结果 ①对所设计的种特异性引物经常规PCR扩增产物电泳分析显示,目标菌株均有目的特异性扩增产物,非目标菌株、非细菌性病原体以及人源基因组DNA未出现特异性电泳条带.特异性扩增产物测序所得序列比对分析显示与目的菌种序列相符.②对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌的4对引物同时进行熔解曲线分析和mecA基因熔解曲线分析的条件优化结果:预变性温度94℃、120s,变性温度94℃、20s:退火温度53℃、12s;延伸温度68℃、13s;扩增循环数为40个循环,熔解曲线分析温度75℃～95℃.最佳的引物浓度为300nmol/L.③所建立的方法经特异性分析显示,上述4种目标菌种均有特异性熔解曲线,Tm值依次为81.02℃;80.32℃;82.37℃:83.10℃,峰高(cm)/峰宽(cm)均大于2.6,以此为典型的熔解曲线判断标准,则非目标菌、非细菌性病原体以及人源基因组DNA分析未见典型的熔解曲线.④方法的敏感性分析显示,上述4种目标菌和mecA基因可检测到的血液细菌浓度依次为:550、520、470、500与203CFU/mL.⑤对上述4菌和MRSA的临床分离菌各20株进行检测,结果显示,其平均Tm值依次为(80.96±0.688)℃,(80.20±0.729)℃,(82.42±0.599)℃,(83.20±0.713)℃和(80.11±0.15)℃.结论 本研究所设计的针对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌和mecA基因检测引物具有较好的菌种特异性,可用于相应病原菌熔解曲线分析法的建立;所构建的熔解曲线法具有较好的特异性、敏感性和稳定性;并具有快速、简便、成本低廉的特点,可用于临床样本的检测;但葡萄球菌属内和肠球菌属内的Tm值较接近,必要时,可进一步用单对引物检测分析以鉴定到种.     

掺杂、掺伪的中药饮片鉴别方法探讨

目的：探讨对于掺杂、掺伪的中药饮片的鉴别方法。方法：鉴别2010年1月至今本区域内生产、经营以及使用单位拥有的中药饮片,对中药饮片（紫河车、姜半夏、金银花、金钱白花蛇等）是否掺杂、掺伪进行鉴定、分析。结果：本区域内生产、经营以及使用单位拥有的中药饮片存在少量掺杂以及掺伪的现象,同源掺伪、形似掺伪、染色掺伪、重量掺伪、非药用部位掺伪、浸提过的饮片掺伪方法等鉴别方法切实有效。结论：对于本区域内生产、经营以及使用单位拥有的中药饮片需要加大鉴别掺杂、掺伪力度,提高鉴别中药材的能力,同源掺伪、形似掺伪、染色掺伪、重量掺伪、非药用部位掺伪、浸提过的饮片掺伪方法等鉴别方法值得推广！     

探针熔解曲线技术检测结核杆菌耐药的研究

目的评价探针熔解曲线技术检测结核杆菌耐药效果。方法利用探针熔解曲线技术对46例涂阳肺结核患者的痰标本进行异烟肼和利福平耐药检测,以传统罗氏药敏试验为金标准,对探针熔解曲线技术的检测效果进行评价。结果在46例菌株中,用探针熔解曲线进行异烟肼耐药基因检测,与罗氏药敏的符合率为91.3%,进行利福平耐药基因检测,符合率为84.8%。结论探针熔解曲线检测异烟肼和利福平的耐药性与罗氏药敏方法具有很好的一致性,具有简便快速,灵敏度高,特异性好的优点,对临床及时准确进行抗结核治疗具有重要意义。     

位点特异性PCR鉴别两面针掺伪飞龙掌血的方法研究

目的:探讨DNA条形码技术对鉴定两面针掺伪飞龙掌血的可行性，建立两面针特异性快速聚合酶链式反应(PCR)分子鉴定方法。方法:通过对两面针和伪品飞龙掌血DNA条形码进行对比分析，寻找单核苷酸多态性(SNP)位点并设计特异性鉴别引物，优化PCR反应体系与程序，进行退火温度、引物酶、反应循环数、灵敏度及专属性等方法学考察。结果:ITS2条形码适用于两面针及伪品飞龙掌血的鉴别，所建立的位点特异性PCR鉴别方法，在退火温度为56℃、循环数为33次时，伪品飞龙掌血经过特异性引物扩增后，在200～300 bp之间检出一条单一DNA条带，而两面针则无此条带。结论:所建立的位点特异性PCR方法可准确检测两面针中是否含有飞龙掌血，为两面针质量监测提供一种新型的鉴定手段。     

基于高通量测序技术对人参花及其易混淆品鉴定研究

目的 利用高通量测序技术对人参花及其易混淆品进行鉴定，并利用ITS2测序技术验证高通量测序技术对物种鉴定的准确性。方法 对人参花掺伪样品扩增产物进行高通量测序，使用cutadapt、PEAR、PRINSEQ、Usearch、RDP classifier、SINTAX软件获得分类单元(operational taxonomic unit，OTU)序列，舍弃菌类、unclassified等非绿色植物序列；为避免假阳性情况发生，删除序列数<100条或碱基数<200 bp的OTU序列。对人参花、西洋参花、三七花的ITS2扩增产物进行测序，利用MEGA 11.0对人参花、西洋参花、三七花的ITS2、OTU、GenBank上下载的碱基序列构建邻接法系统聚类树、遗传距离、种间信息位点及对ITS2、OTU碱基序列分别进行Blast分析来验证高通量测序技术对物种鉴定的准确性。通过构建ITS2及OTU碱基序列二级结构对人参花、西洋参花、三七花进行比对分析，根据物种间二级结构的不同对物种进行鉴定。结果 高通量测序共得到54 653条有效序列，人参花、三七花、西洋参花的序列号分别为OTU1、OTU2、OTU3及对应的有效序列分别为31 325，857，442条。通过对各物种的ITS2及OTU碱基序列进行Blast检索，均支持各个物种。人参花与西洋参花、三七花种间遗传距离分别为0.010，0.033，人参花与西洋参花、三七花分别有2，7个信息位点；邻接法系统聚类树显示各个物种均独立聚为一支，其中人参花与西洋参花聚为一大支与三七花并列。人参花与西洋参花二级结构一致，但与三七花在臂Ⅳ及臂Ⅳ与臂Ⅰ之间有A、B、C 3处不同。结论 基于高通量测序技术能够准确鉴定人参花、西洋参花、三七花，对掺伪样品亦具有较强的鉴别能力，为市售人参花样品鉴定提供一定思路。     

人参与西洋参(Ⅰ)

综述01西洋参提取物CVT一E001的化学和药理学标准 〔英〕/专利,7402西洋参多糖5一2的分离、理化性质和生物活性 研究己中刀论文,3栽培、组织培养和鉴别03人参不同栽培群体(包括一西洋参种)遗传关系 的随机扩增多态DNA分析〔中〕/论文,404西洋参营养特点的研究Vn:氮肥施用方法对西 洋参产量的影响〔中〕/论文,305西洋参营养特点的研究u:西洋参硝酸还原酶 的研究〔中〕/论文,206人参(包括西洋参)愈伤组织的培养〔日〕/专利, 607可产生人参皂普的西洋参愈伤组织〔日〕/专利, ll08Ri质粒转化的西洋参的研究l:西洋参毛状根 培养系统的建立与…     

多重连接依赖式探针扩增技术及其在医学上的应用

多重连接依赖式探针扩增（MLPA）是近年发展起来的新技术,其在基因检测和基因诊断等方面有较高的灵敏度。本文着重介绍MLPA技术的原理、特点及其在多种领域的研究和基因诊断上的应用。     

常见中药饮片掺伪、掺杂的鉴别与快速检验

目的掌握常见的中药饮片掺伪、掺杂的鉴别方法与快速检验的方法。方法根据中药正品的典型特征、性状及来源进行比对,并结合薄层色谱与杂质等检验的项目来进行判断。结果与结论通过以上的方法可以快速鉴别常见的中药饮片掺伪、掺杂,并结合相应项目的检验来判断中药饮片是否合格,来杜绝掺伪、掺杂的中药饮片进入到临床中。     

关于中成药水蜜丸制剂掺伪米粉监管方法的研究

目的： 为了解决中成药水蜜丸掺伪米粉无检测方法的问题,引入普通PCR方法和荧光探针PCR 方法并制定相应新标准,以完善中成药掺伪检测的监管体系。方法：以通宣理肺丸为例,着重介绍引入PCR方法在完善中成药米粉掺伪检测体系中发挥的新作用。方法通过优化样品前处理和DNA提取过程,采用生物信息学分析和试验验证对检索得到的引物和探针特异性进行评估,并对2种方法的特异性、检出限、精密度和重复性进行考察和比较,对市售样品进行筛查。结果：试验通过评估DNA分子提取质量,选定了天根DNA提取试剂盒;建立了普通PCR方法和荧光探针PCR方法,并获得了适合于本研究的特异性引物和探针;2种PCR方法的检出限均为1 g·Kg^-1;普通PCR方法精密度和重复性良好,荧光探针PCR方法的精密度RSD为1.56%(Ct值=29.74),重复性RSD为1.98%(Ct值=29.88)。 试验对3个厂家9批次样品进行筛选,结果表明6批次A厂家的样品掺入了米粉。PCR产物经过克隆测序后,与NCBI数据库比对,确认为水稻(Oryza sativa L.)。根据不同PCR检测方法的特点,通过参考其他行业标准,首次制定了中成药掺伪米粉的PCR检验检测标准。结论：建立了水蜜丸中普通PCR和荧光探针PCR掺伪检测方法并制定相应检测标准,通过新方法和新标准的建立,弥补了掺伪检测在监管中的漏洞,完善了中成药监管的标准化体系。     

AFLP法构建人参、西洋参基因组DNA指纹图谱

目的　采用扩增片段长度多态性DNA(AFLP)分子遗传标志技术,分析人参、西洋参基因组DNA多态性。方法　人参、西洋参干燥根基因组DNA,经EcoRI/MseI酶切并与其相应的人工接头连接后,使用选择性引物进行PCR扩增。结果　经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,成功构建出多态性丰富和重复性好的人参、西洋参DNA指纹图谱。结论　AFLP法有望成为一种独立的切实可行的手段,将在人参、西洋参等药用植物的鉴定、生物进化、系统发育研究及指导道地性药材的科学栽培等方面发挥重要作用。     

铁丝威灵仙药材、饮片及其制剂心脑静片掺伪威灵仙的检测方法研究

目的：建立铁丝威灵仙掺伪威灵仙的鉴别分析方法,为铁丝威灵仙药材、饮片及其制剂心脑静片的质量监管提供技术支持。方法：样品前处理方法为水提-酸水解法,以威灵仙的专属性水解成分齐墩果酸作为鉴别指标,采用高效液相色谱法,选择Waters Xbridge^TM C₁₈(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,流动相为乙腈(A)-水(B),梯度洗脱,流速1 m L·min^-1,柱温30℃,检测波长205 nm,进样量10μL。结果：本研究建立的铁丝威灵仙药材、饮片及其制剂心脑静片掺伪鉴别方法,经验证,阴性无干扰,齐墩果酸检测限为1.96μg·m L^-1。共测定7批铁丝威灵仙饮片,14批心脑静片制剂,发现1批饮片掺伪,心脑静片样品未发现掺伪现象。结论：所建立的方法准确、快速、通用性强,可有效鉴别铁丝威灵仙药材、饮片及其制剂心脑静片中掺伪威灵仙的问题,并为含铁丝威灵仙的其他相关制剂掺伪鉴别方法的建立提供参考。