濮阳市首例发热伴血小板减少综合征病例流行病学调查及基因组特征分析

目的报告濮阳市首例发热伴血小板减少综合征病例, 通过流行病学调查和基因测序了解其流行病学特点并分析濮阳市首例新型布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)分离株S、M、L片段分子特征。方法采用流行病学调查方法, 分析流行病学特点, 用Vero细胞分离病毒, 提取SFTSV核酸, 实时荧光定量PCR进行检测;构建多重PCR法对病毒核苷酸序列进行特异性扩增, 利用二代测序仪进行全基因组测序, DNAStar、MEGA11等生物信息软件进行同源性分析, 构建系统进化树。结果流行病学调查结果显示, 患者及其密切接触者14 d内均无旅居史, 有野外作业史, 无蜱虫叮咬史;血液样本检测SFTSV核酸阳性;SFTSV基因型为E型, 其S、M、L片段基因均为E型, 与GenBank中已知的SFTSV核苷酸序列进行比对, 核苷酸序列同源性分别为94.8%～99.9%、94.0%～99.8%、95.7%～99.7%。结论该患者确诊为濮阳市首例SFTSV感染引起的发热伴血小板减少综合征, 与河南近年来分离株基因分型差异较大,...     

全基因组测序在环境样本新型冠状病毒检测中的应用

目的:通过对环境样本进行全基因组测序,为全基因组测序在检测环境标本中SARS-CoV-2的应用提供实践基础,为新冠肺炎疫情的溯源和防控工作提供科学依据.方法:采用新冠病毒全基因组靶向扩增结合Illumina二代测序的技术对5例SARS-CoV-2核酸阳性环境样本进行全基因组测序,应用多种分析软件及在线病毒变异分析平台,...     

Nanopore高通量测序检测呼和浩特市4例SARS-CoV-2感染者病毒基因组

目的对呼和浩特市6例确诊为SARS-CoV-2感染患者进行全基因组测序, 了解病毒特征, 追溯病毒来源。方法采用Nanopore三代高通量测序技术对6份咽拭子样本进行病毒基因组测序, 基于ARTIC病毒基因组组装流程, 使用生物信息学软件将病毒序列与参考序列进行比对, 分析进化情况。结果获得4份样本的全基因组序列, 均属于SARS-CoV-2变异株Delta (B.1.617.2-like), Pangolin分型为AY.122。测序时长1.5 h/样本, 测序长度27 009～29 560 bp, 覆盖度90.32%～98.85%。共鉴定出50个碱基位点突变、46处氨基酸变异, 错义突变占比74%(37/50), 错义突变中以ORF1ab基因占比最高45.95%(17/37)。结论 Nanopore单分子测序技术在病毒全基因组测序中具有读长长、测序时间短的特点。与武汉参考株比对发现, 该病毒的核苷酸位点变异存在多态性, 要密切关注病毒变异情况, 切实做好防控措施。     

肾移植后BK病毒感染者实时荧光定量PCR检测

背景：对于BK病毒感染、BK病毒相关性肾病的认识缺乏规范的实验室诊断程序和标准化的无创性检验方法。 目的：建立肾移植后患者尿液和外周血BK病毒感染负荷实时荧光定量PCR检测方法。 方法：针对BK病毒基因组,自主设计特异性引物BKV-F和BKV-R,Taqman荧光探针BKV-P,Taqman荧光探针BKV-P的5’端标记有荧光基团,在除5’端外的任意一个位置上标记有淬灭基团;然后处理待测样本,进行PCR反应。 结果与结论：将检测阳性的扩增产物进行基因测序,测序结果经BLAST比对后证实为BK病毒基因序列;利用上述方法对56份样本进行检测,其中,20份BK病毒血清样本及20份BK病毒尿液样本检测均为阳性,有S型扩增曲线。动态范围测定显示在103~1010 copies/mL之间标准曲线具有良好的相关性。5份健康人尿液样本,5份血液样本及6份临床常见的其他病原体血液样本检测均为阴性,无S型扩增曲线。结果表明该方法可进行定性、定量检测,特异性好,反应快速,一般30 min即可得到反应结果,并且成本低、假阳性少。     

扬州市境外输入4例病例新冠病毒基因特征分析

目的基于高通量测序技术对2022年1月至2022年10月扬州市4例境外输入新冠肺炎病例的咽拭子标本进行全基因组分析, 了解其序列变异情况, 为后续防控策略的调整提供科学依据。方法利用Illumina iseq100和Oxford nanopore平台对扬州市4例境外输入新冠肺炎病例的咽拭子标本分别进行二代及三代高通量测序, 获取全基因组序列, 分析病毒变异位点与谱系型别。结果基于二代测序平台, 4例输入性病例序列长度为29 758 bp～29 861 bp, 全基因组覆盖度为99.46%～99.90%。基于三代测序平台, 4例输入性病例序列长度为29 778 bp～29 831 bp, 全基因组覆盖度为99.65%～99.83%。与武汉参考株(NC₀45512.2)相比, 4例病例序列分别检出核苷酸突变数为66、72、73、76。选取二代测序结果进行系统进化分析表明, 4条序列均与当时流行的新冠病毒变异株奥密克戎亚型相似(BA.1.1、BA.2、BA.2.3和BA.5.2)。结论两种测序平台分析结果基本一致, 4例输入性新冠肺炎患者感染病毒均与奥密克戎变异株相似,...     

两株GI.1型札如病毒全基因组测序及初步分析

目的对GI.1型札如病毒进行全基因组扩增测序尝试并开展初步分析。方法利用本研究设计的GI组札如病毒全基因组5’末端通用引物及杯状病毒3’末端引物, 对本实验室保存的两株GI.1型札如病毒标本进行全基因组扩增, 然后进行文库构建、上机测序及序列组装。通过BioEdit软件进行序列比对分析, 采用MEGA 7.0软件构建进化树进行进化分析。结果两个标本测序质量优异, 测序方法具有可行性;在全基因组(WGS)、NSP基因、VP1基因及VP2基因进化树中, 均归类为GI.1型;位点变异分布于各个基因片段, 但VP1基因的N端保守性较好, 熵值较低;大部分基因的核苷酸突变尤其是NS3、NS5及VP1基因的核苷酸突变以同义突变为主, 未形成相应氨基酸的突变。结论成功地开展了对GI.1型札如病毒全基因组扩增测序及相关进化分析, 为札如病毒的检测提供了新的思路。     

发热伴血小板减少综合征病例血细胞胞内病毒含量的检测方法研究

目的拟构建发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)病例外周血各群白细胞中发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)感染率的流式细胞检测方法, 为临床评估病例预后, 靶细胞和相关机制研究提供新工具。方法建立检测非洲绿猴肾细胞系(VERO-E6)和人单核白血病细胞系(THP-1)细胞SFTSV感染率的流式方法, 并与定量反转录PCR(qRT-PCR)方法比较验证。应用流式细胞术检测SFTS病例外周血各亚群白细胞胞内SFTSV含量, 并与单细胞测序比较验证, 流式细胞检测结果与病例相关临床数据进行独立样本t检验。结果 qRT-PCR和流式细胞检测结果一致, SFTSV感染后3 d内VERO-E6内病毒含量显著梯度升高, 而THP-1内病毒含量变化不明显。流式细胞技术在部分SFTS病例的B淋巴细胞检测出SFTSV阳性, 与单细胞测序结果一致。结论流式细胞检测胞内SFTSV, 相对于qRT-PCR更适用于混合细胞样...     

基于游离DNA的纳米孔测序在一例肺炎病例病原识别中的应用

目的探讨游离DNA测序在呼吸道感染病原诊断中的应用价值。方法对一例肺炎病例的支气管肺泡灌洗液和血液样本提取游离DNA, 同时进行纳米孔测序和二代测序。结果纳米孔测序从肺泡灌洗液样本中检测到132条1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1, HSV-1)序列, 但从血液样本中未检出HSV-1序列。二代测序从两种样本中均检出HSV-1序列, 产生的病毒序列数与测序深度高于纳米孔测序。实时定量PCR反应和血清学检测证实了该诊断。纳米孔测序与二代测序数据混合组装后获得了HSV-1全长序列, 系统进化分析表明该病毒与美国分离的毒株亲缘关系最近。结论纳米孔测序技术可在更短时间内检测出病原, 有助于感染性疾病病原的快速诊断。     

中国人乳头瘤病毒30型分布及型下分类研究

目的了解国内人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)30型(HPV30)的感染情况及型下系(lineage)分类。方法收集就诊于中国人民解放军总医院妇产科, 并在30 d内进行新柏氏薄层液基细胞学检测女性患者宫颈脱落细胞样品, 从中提取DNA并进行HPV30型特异性聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测;对HPV30阳性样本进行病毒基因组全长PCR扩增和序列分析。结果 1 600例受试者中, 共获得HPV30阳性样品9例(0.56%, 9/1 600), 其中6例HPV30基因组全长PCR扩增成功;9例HPV30毒株在型下系分类上都属于A, 其中A1占66.7%(6/9)、A4占22.2%(2/9)、A5占11.1%(1/9)。结论国内女性中存在HPV30感染, 型下系分类上全部HPV30毒株都属于A。     

病毒载量对SARS-CoV-2测序准确性的影响

目的评估病毒载量对严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)全基因组测序准确性的影响, 为新冠病毒基因监测提供技术支撑。方法提取3例新冠病毒阳性病例的核酸进行4个梯度稀释处理, 同时提取83例新冠病毒阳性病例的核酸进行验证, 通过测序深度、基因组覆盖率和测序深度均一性等指标对测序结果进行评价。结果病毒载量的改变不能影响原始测序数据的质量, 病毒载量对测序数据的准确性具有一定的影响:当Ct值≤32时, 病毒载量变化对测序深度和基因组覆盖率的影响并不显著, 能够达到全基因组测序目的;当Ct达到38时, 覆盖率急剧下降至50%以下, 无法测到病毒的基因组全长。结论通过评估病毒载量对SARS-CoV-2的测序准确性的影响, 我们建议选取Ct值≤32的样本, 产生的测序数据的全基因组覆盖率能够满足后续分析要求。     

广东登革3型病毒株的分离培养和鉴定

目的对2009年发生于广东地区的3例家庭聚集性登革热患者血清进行登革病毒的鉴定和病毒株的培养分离。方法用胶体金法检测患者血清中登革病毒特异性IgM、IgG抗体;C6／36细胞培养患者血清中登革病毒;RT—PCR扩增C．PrM基因序列的片段以检测患者血清中登革病毒RNA,PCR产物经序列测定后进行生物信息学分析。结果3例患者血清学检测均为登革病毒特异性IgM阳性、IgG阴性;特异性RT—PCR产物长约290bp,经琼脂糖电泳和测序分析,证实3例患者血清中均存在登革3型病毒;从1例患者血清中培养分离到了登革病毒株,经RT—PCR和测序证实为登革3型病毒。结论2009年发生于广东地区的3例登革热患者经病毒培养和分子生物学鉴定,证实均为登革3型病毒感染。     

不同样本测序前处理方案对冠状病毒基因组高通量测序结果的影响

目的以基因组最大RNA病毒(冠状病毒)为代表,研究不同测序前样本处理模式对高通量测序获得病毒全基因组序列信息质量的影响。方法以细胞培养的人冠状病毒HCoV-OC43样本为代表,分为4种测序前样本处理模式,即:未处理组、核酸提取前DNase和RNase处理组、核酸提取后DNase处理组、核酸提取前DNase和RNase处理且核酸提取后DNase处理组。不同模式处理后的核酸分为两份,一份直接RNA测序(未扩增),另一份经序列非依赖的单引物扩增(SISPA)后DNA测序。结果尽管不同处理方式下获得的病毒基因组覆盖率差别不大,但是样本核酸提取后经DNase处理组直接测序获得了最高的基因覆盖度和测序准确性,而SISPA扩增可有效提高病毒测序读长(reads)比例与基因组各位点的测序深度。结论本研究为优化冠状病毒等RNA病毒全基因组测序策略提供了技术参考。     

首次在山西省虫媒病毒调查中检测并分离到南定病毒

目的明确山西省五个地区虫媒病毒种类及其分布特征, 对采集的蚊虫样本进行病毒的分离与鉴定。方法于2020年7～9月采集当地的蚊虫标本, 利用实时荧光定量PCR法检测蚊虫标本中的8种虫媒病毒, 通过细胞培养对其进行病毒分离, 使用分子生物学和生物信息学方法对病毒分离物进行鉴定和分析。结果在121批蚊虫样本中, 检测到1批乙型脑炎病毒阳性, 2批库蚊黄病毒阳性以及8批南定病毒阳性。分离到7株病毒分离物, 编号为:SX-YJ-Cxp-4、SX-YJ-Ars-2、SX-YJ-Cxp-1、SX-LY-Cxp-10、SX-GP-Ars-5、SX-GP-Cxp-2、SX-GP-Cxp-4, 鉴定均为南定病毒, 对其中一株进行全基因组测序, 结果显示:山西南定病毒分离株与云南南定病毒分离株属于同一进化分支。结论首次在山西省分离到南定病毒。     

我国首例输入性裂谷热病例病毒全基因组测序分析

目的 对我国首例输入性裂谷热病例病毒进行全基因组测定,分析其进化来源及潜在变异.方法 提取样本核酸,非特异性反转录扩增病毒基因组RNA,使用Ion Torrent二代测序仪进行病毒全基因组测定.对获得的基因组数据进行序列拼接、比对、进化树构建和关键位点分析.结果 通过测定获得了病毒全基因组11 979nt,该测定病毒属E基因分支,序列与先前南非分离株Kakamas相似度最高(＞98％).病毒Gn蛋白C端信号肽区存在1个氨基酸突变.结论 本研究分析测定的裂谷热病毒全基因组与目前非洲流行株高度相似,病毒基因特征未出现明显变异.     

SARS-CoV-2 Omicron变异株TaqMan探针法荧光定量RT-PCR的建立及应用

目的开发和评估一种快速、简单和经济的替代测序的Omicron变异株荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)。方法针对SARS-CoV-2 ORF1ab保守区域、Omicron变异株S基因高频共同突变位点设计引物和TaqMan探针, 建立Omicron株RT-qPCR检测方法, 用经全基因组测序确定型别的样本进行验证, 并对该方法的特异度和敏感度进行评估。结果本研究建立的RT-qPCR分型法可以将Omicron变异株与包括早期A型流行株、Alpha和Delta变异株在内的SARS-CoV-2毒株进行区分, 结果与全基因组测序结果一致, 符合率为100.00%(28/28);与其他6种呼吸道病毒及柯萨奇病毒A组16型无交叉反应;该方法RNA标准品在109～103拷贝/μl之间呈良好的线性关系, 相关系数R2均大于0.99, 检测敏感度为103拷贝/μl。结论本研究设计的针对Omicron变异株的RT-qPCR敏感度高且特异度好, 在任何可以进行PCR检测的实验室中都容易开展, 可极大地促进对Omicron变异株的传播监测。     

新型冠状病毒奥密克戎变异株无症状感染者新冠病毒全基因组测序分析

目的:了解贵阳市 2022 年 9 月新型冠状病毒奥密克戎变异株引起的本土疫情中,无症状感染者新型冠状病毒(Sever acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)的基因组特征.方法:采用新型冠状病毒全基因组靶向扩增结合Illumina二代测序技术,对 2022 年 9 月贵阳市本土疫情中的 6 例无症状感染者的新型冠状病毒核酸样本进行全基因组测序,采用 Nextclade和Pangolin平台判定病毒谱系及型别,分析病毒的变异特征.结果:成功从 6 例新型冠状病毒无症状感染者样本中获得新型冠状病毒全基因组序列,Nextclade分型结果显示这些序列均属于21L型(Omicron),Pangolin分型结果显示均属于BA.2.76.与新型冠状病毒武汉株(NC_045512.2)相比,感染者1、4有76个核苷酸突变位点,感染者2、5有78个核苷酸突变位点,感染者 3、6 有 77 个核苷酸突变位点,突变主要集中在S区(刺突蛋白区).6 条序列的氨基酸变异位点为分别为56、57个.结论:贵阳市持续开展新型冠状病毒全基因组测序,可及时监测和发现新型冠状病毒变异株,为今后我市新冠疫情精准溯源、风险研判与预警、毒株变异研究等方面提供关键数据支撑.     

货车司机远距离传播新型冠状病毒肺炎事件的分子溯源

目的追溯新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019, COVID-19)病例的感染来源及病毒传播路径, 证实经长途货车司机跨省远距离传播COVID-19事件。方法采用全基因组靶向扩增结合二代测序技术, 对2022年3月福建省泉州市本土疫情暴发期间漳州市报告的5例货车司机COVID-19病例鼻咽拭子标本进行新型冠状病毒(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)全基因组测序, 应用在线分析平台判定病毒型别及突变位点, 利用进化分析软件构建系统发育树, 结合流行病学调查数据, 综合分析病例的感染来源及传播路径。结果成功从5例病例中获得2019-nCoV全基因组序列, 序列长度为29 770～29 839 bp, 基因组平均覆盖度为99.53%;病毒分型结果显示5株病毒均为Omicron变异株, 但分属3种BA.2亚分支;序列分析结果显示3例病毒与2022年3月福建省泉州市本土疫情流行的两种进化分支病毒高度相似, 另2例病毒则与该起疫情流行的病毒存在差异较大(核苷酸突变位点差异7～14个、氨基酸突变位点差异5～7个);进化分析结果表明3例病毒...     

一起腹泻疫情病原体鉴定及腺病毒F41型基因组遗传特征分析

目的 鉴定引起山东省泰安市某学校腹泻疫情的病原体,并对其基因组进行遗传特征分析。方法 利用荧光定量PCR方法对本起疫情中收集到的19份腹泻患者及餐厅工作人员的肛拭子、环境样本进行常见腹泻病毒性病原体检测,随后利用高通量测序方法获得阳性样本的病毒基因组序列,并对病毒全基因组序列进行核苷酸和氨基酸序列相似性比较、系统发育分析。结果 19份样本中有7份样本被鉴定为腺病毒阳性,阳性检出率为36.8%;在患者10和患者4餐具样本中测序获得了腺病毒F41型毒株的全基因组序列,两株病毒核苷酸、氨基酸相似性均为100%。基于全基因组、六邻体基因、纤突蛋白基因的系统发育分析表明,本研究的HAdV-F41毒株与中国、美国、日本、伊拉克等国家分离到的毒株亲缘性较高。结论本次泰安地区儿童腹泻疫情是由腺病毒F41型感染引起,且与中国、美国等毒株亲缘性较高,丰富了山东省腺病毒F41型毒株的遗传特征资料,为腺病毒引起的儿童腹泻的防治提供了理论依据。     

新冠病毒感染者病毒RNA脱落时间的影响因素研究

目的了解新冠病毒感染者病毒RNA脱落时间与病毒单核苷酸突变和感染者人口、基础疾病等因素的关系, 为新冠病毒感染动力学的研究提供更多线索。方法收集江苏省2021年7月至9月暴发的一起新冠肺炎聚集性疫情感染者流行病学、临床表现、基础疾病等资料, 采集病例鼻咽拭子样本, 采用二代测序技术对样本进行病毒全基因组测序。利用在线分析平台判断病毒型别、分析突变位点, 利用Cox比例风险模型分析新冠病毒RNA脱落时间与各研究因素的关系。结果本起新冠疫情最终获得病毒全基因组序列的人员350例, 其中女性占60.3%, 年龄中位数49岁[四分位数间距(IQR, 37～65岁)], 中位病毒RNA脱落时间33天(IQR, 26～44天)。全基因组测序分析显示, 同武汉参考株序列相比, 感染者序列存在34～41个核苷酸突变位点, 属于VOC/Delta变异株(B.1.617.2进化分支), C346T、C1060T、T2803C、T7513C、A29681C为本起疫情350例病例新冠病毒基因组序列主要单核苷酸变异位点(SNP)。单因素Cox回归分析显示, 年龄、基础疾病、临床分型、疫苗接种情况、SNP T28...