恙虫病东方体0t56蛋白序列生物信息学分析

目的分析恙虫病东方体Ot56蛋白序列中的变异区和保守区,为恙虫病的蛋白与核酸诊断提供参考。方法从GenBank获取目标序列,用Lasergene、MEGA、Vector NTI suite、AthePort和NCBI Blast等工具进行分析。结果120条Ot56氨基酸序列的相似性为61.4%～100.0%,变异度为0.0～57.1;氨基酸的105～171、179～215、248～285、375～428和447～503区域为高变异区;膜外区200～400具有变异度高、抗原性强的特性。113条Ot56cDNA序列的相似性为41.8%～100.0%,变异度为0.0～116.1;其中303～481、562～667、756～842、1136～1243和1386～1568等5个区域属高变异区,而0～54、97～171、265～303、439～482、1015～1047和1477～1542为6个保守片段。结论恙虫病东方体Ot56蛋白具有5个高变异区,第200～400位氨基酸附近可能是株(型)特异性表位所在区域,其重组蛋白具有潜在的株(型)鉴定价值。根据cDNA6个保守片段设计引物,进行Ot56核酸检测可能在不同株(型)恙虫病东方体检测中具有较高的敏感性。     

佛山市南海区鼠类自然感染恙虫病东方体基因型分析

目的 调查佛山市南海区鼠类自然感染恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi, Ot)的情况，了解当地Ot基因型的分布及特点，为防控恙虫病提供科学依据。方法 2017年7月利用鼠夹和鼠笼，在佛山市南海区恙虫病高发镇街采集鼠类动物样本，应用巢式聚合酶链反应(nested polymearse chain reaction, nPCR)扩增技术检测Ot 56kDa型特异性抗原(type-specific antigen, TSA)基因核酸片段，通过核酸序列比对确定Ot基因分型。用MEGA 10.0.5、DNAStar 7.1、MegAlign等生物信息学软件进行同源性与遗传进化分析。结果 共捕获鼠类200只，褐家鼠检出56kDa TSA基因片段6份，黄胸鼠检出1份，阳性率为3.5%(7/200)。南海序列(L65、L68、L118、L119、L122、L150和L153)在核苷酸水平与Kawasaki、Gilliam、TA763、Kato、Kuroki、Karp基因型相似性为71.8%～100.0%,氨基酸水平相似性为54.9%～100.0%。同源性和系统进化分析表明，南海...     

恙虫病合并慢性血吸虫病发病特点及恙虫病的分型

目的了解恙虫病合并血吸虫病的发病特点以及恙虫病的分型情况。方法收集病例资料并对其进行分析,采用外斐反应和间接免疫荧光方法（IFA）检测患者血清中的恙虫病东方体（Ot）IgG抗体,用巢式PCR法扩增患者血液中的Ot 56kD蛋白基因,并进行核酸序列测定和分析。结果患者有血吸虫肝改变、肝功能受损、脾肿大、焦痂。外斐氏反应检测OXk 1：40,IFA检测Ot IgG抗体Kato型1：160、Karp型1：40,PCR检测Ot 56kD蛋白基因片断阳性,其序列分析结果与PG9、P25、CM438等一些泰国Ot株同源性最高（98%）,与Ot Karp、Gilliam、Kawasaki、TA678、Kato株同源性均在95%以下。结论证实了该患者为恙虫病合并慢性血吸虫病,其Ot血清型可能为Kato＋Karp,遗传进化关系与一些泰国Ot株关系较为密切。     

恙虫病东方体Karp株核酸疫苗的构建及其免疫功能初步研究

目的构建恙虫病东方体Karp株Sta56抗原候选核酸疫苗并初步探讨其可能诱导的免疫功能。方法从连有恙虫病东方体Karp株编码56000u表膜蛋白基因开放读码框全长的T载体质粒pMD18/Sta56中双酶切出目的基因,定向亚克隆构建核酸疫苗质粒载体pVAX1-Sta56,转染Hela细胞,WesternBlot分析Sta56蛋白的表达及其免疫原性,转染L929细胞,接种恙虫病东方体,Giemsa染色细胞内恙虫病东方体数目比较,初步探讨pVAX1-Sta56可能诱导的细胞免疫现象。结果pVAX1-Sta56连有正确读码框架的Sta56全长基因。转染有pVAX1-Sta56的Hela细胞培养上清可检测到被兔抗恙虫病东方体Karp株抗血清识别的特异条带。转染有pVAX1-Sta56的L929细胞内恙虫病东方体数目显著少于转染pVAX1的L929细胞(P<0.01)。结论成功构建能够表达Sta56表膜蛋白抗原的核酸疫苗载体pVAX1-Sta56,并能诱导产生细胞免疫功能。     

恙虫病东方体Karp株Sta56基因的克隆及序列比较的研究

目的 扩增恙虫病东方体Karp株主要表膜抗原Sta56的开放读码框(ORF)全长，并进行序列比较研究。方法 小鼠接种传代和体外细胞扩增分离恙虫病东方体Karp株，用PCR方法扩增恙虫病东方体Karp株Sta56基因，并采用TA克隆技术构建测序载体，对测序结果进行同源性分析比较。结果 扩增出Sta56的ORF全长，并TA克隆到测序载体pMD18—T vector，测序结果与Karp标准株的同源性为99．4％。结论 Sta56全长ORF克隆扩增成功，为进一步构建表达载体，进行Sta56蛋白表达研究提供基础。     

恙虫病东方体56kD表达抗原基因片段的、表达及纯化抗原在恙虫抗体检测中的应用

目的：构建恙虫病东方体56kD表面抗原基因（sta56)片段的重组表达质粒，在E.coli中表达Sta56重组抗原，重组抗原纯化后应用于间接法ELISA，金标快速免疫导析法检测恙虫病东方体特异性抗体，方法：从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出sta56基因的ORF及其中长1053bp的大片段，用TA克隆技术将此大片段克隆以该重组质粒为模板，扩增出不同长度的截短的sta56片段，定向插入pPROEX HTb及pET30a载体，化大肠杆菌DH5a或BL21（DE3），IPTG诱导表达，应用SDS－PAGE观察重组蛋白表达情况，应用Western blot分析重组抗原的活性；采用电洗脱，亲和层析等方法纯化重组蛋白。纯化的重组蛋白直接包被聚乙烯96孔板，用于间接法ELISA检测恙虫病东方体IgG，或以胶体金标记重组抗原，运用金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体IgM和IgG抗体，结果：（1）从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出含sta56基因的ORF，并成功构建含sta56 ORF大片段的重组质粒TOPO－sta56.(2)以截短的sta56基因片段构建重组表达质粒pHTbOt957,pHTbO498,pHtbOt342和pETOt957,pETOt498,pETOt342，各重组子均可在E.coli中以融合蛋白的形式有效表达，SDS－PAGE显示各表示重组子表达不同分子量的重组蛋白，Western blot证实各重组蛋白均能被恙虫病患者阳性血清所识别。（3）电洗脱、Ni-NTA并和层析均可用于重组蛋白的纯化，并获得高纯度的重组蛋白。（4）纯化的重组蛋白应用于间接法ELISA检测恙虫病东方体特异性IgG，与间接免疫荧光法IFAT比较，其敏感性和特异性分别91．7％和76．5％。（5）纯化的重组蛋白应用于金标免疫层析法，可直接快速检测恙虫病东方体特异性IgM和IgG。与间接免疫荧光法IFAT比较，其检测IgG的敏感性和特异性分别为94．2％和84．2％，结论：恙虫病东方体Karp株sta56基因可在大肠杆菌获得高效表达。重组蛋白具有免疫反应性，纯化后可用作免疫诊断抗原；以重组抗原建立的间接法ELISA检测IgG，适用于大规模的流行病学调查，以胶体金标记重组抗原建立的免疫层析法用于同时检测IgM和IgG抗体，具有简便，快速的特点，适于在缺乏实验条件的基层医院，农村对门诊病人进行诊断。     

恙虫病东方体56 kD表面抗原基因片段的克隆、表达及纯化抗原在恙虫病抗体检测中的应用

目的　构建恙虫病东方体 5 6 k D表面抗原基因 (sta5 6 )片段的重组表达质粒 ,在 E.coli中表达 Sta5 6重组抗原 ,重组抗原纯化后应用于间接法 EL ISA、金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体特异性抗体。　方法　从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出 sta5 6基因的 ORF及其中长 10 5 3bp的大片段 ,用 TA克隆技术将此大片段克隆以该重组质粒为模板 ,扩增出不同长度的截短的 sta5 6片段 ,定向插入p PROEX HTb及 p ET30 a载体 ,转化大肠杆菌 DH 5α或BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,应用 SDS- PAGE观察重组蛋白表达情况 ,应用 Western blot分析重组抗原的活性 ;采用电洗脱、亲和层析等方法纯化重组蛋白。纯化的重组蛋白直接包被聚乙烯 96孔板 ,用于间接法 EL ISA检测恙虫病东方体 Ig G,或以胶体金标记重组抗原 ,运用金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体 Ig M和 Ig G抗体。　结果　 (1)从恙虫病东方体 Karp株基因组中扩增出含 sta5 6基因的 ORF,并成功构建含 sta5 6 ORF大片段的重组质粒 TOPO- sta5 6。(2 )以截短的 sta5 6基因片段构建重组表达质粒 p HTb Ot95 7、p HTb O4 98、 p HTb Ot342和 p ETOt95 7、 p ETOt4 98、p ETOt342 ,各重组子均可在 E.coli中以融合蛋白的形式有效表达 ,SDS- PAGE显示各表示重组子     

海南省发热患者血标本中恙虫病东方体groEL基因检测

目的了解海南省发热病人中感染恙虫病东方体的状况,并确定其基因分型。方法利用巢氏PCR方法,检测海南省各家医院2009~2010年送检的117份不明原因发热病人血标本的groEL基因的特异性片段,对所检测到的部分目的片段进行基因测序,从基因水平进一步证实阳性结果,并对序列同源性及进化分析。结果从117份发热病人血标本中发现有恙虫病东方体阳性15份,检出率为12.8%。取10份PCR阳性产物进行测序,核酸序列基本一致,彼此间仅存在3个核苷酸的差异,构建进化树进行聚类分析,结果示海南省恙虫病东方体序列与R.tsutsugamushi(M31887)恙虫病东方体在同一分支上,同源性高。结论海南省发热病人中存在恙虫病东方体感染的状况,应加强相关监测和防控措施,为给海南省制定恙虫病防治策略提供科学依据。     

105例恙虫病疑似患者巢式PCR检测结果分析

目的对泰州市靖江105例恙虫病疑似患者全血进行恙虫病东方体(Ot)检测,分析该地区恙虫病感染情况,为恙虫病预防控制提供科学依据。方法采集靖江市2013年10~11月的105例恙虫病疑似患者全血样品进行巢式PCR检测,并进行个案调查,记录结果,用描述性分析方法对检测结果及个案资料进行分析。结果 105例疑似患者中62例检出恙虫病东方体核酸阳性(阳性率59.0%)。发病人群年龄以50~80岁为主,占69.4%,实验室诊断病例中农民占82.3%,男女性别之比1:1.7。结论靖江市恙虫病发病率较高,应针对流行特征采取综合防制措施。     

Genotype identification of Orientia tsutsugamushi isolated from Nan Peng Lie Islands in China

目的：为确定我国南澎列岛是否为恙虫病疫源地,对来自该地的８个恙虫病东方体分离株进行基因鉴定。方法;应用套式聚合酶链反应（NPCR）和限制片段长度多态性分析（RFLP）,NPCR的引物来自恙虫病东方体５６kDa蛋白基因,NPCR阳性产物由HincII和PstI消化并产生特异性酶切图谱予以分析。结果;南澎列岛的8个恙虫病东方体分离株属三个型,即Karp,Kato和一新型恙虫病东方体。结论：南澎列岛是恙虫病疫源地。     

乙型肝炎病毒核心启动子基因变异及其意义

研究乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）核心启动子（ｃｏｒｅｐｒｏｍｏｔｅｒ，ＣＰ）区基因变异及其意义。方法运用多聚酶链反应（ＰＣＲ）直接测序的方法，对我国４８株ＨＢＶＣＰ区核苷酸序列进行分析。结果６７％的标本在一个或一个以上位点发生了突变，常见变异分布于ｎｔ１７５４～１７６６及ｎｔ１８０１～１８１１；ｎｔ１７７７～１８００及ｎｔ１８１２～１８３６为保守区；ｎｔ１７６４变异多见于ＨＢｅＡｇ阴性患者；ＣＰ与ＨＢＶＸ基因重叠部分有１６个位点发生变异，其中９处导致Ｘ蛋白的氨基酸改变。结论ＨＢＶＣＰ区核苷酸变异较为常见，但与病毒基因转录密切相关的序列十分保守；ｎｔ１７６４变异与ＨＢｅＡｇ阴性变异株（Ｅ阴性变异株）形成有关，但并非重症肝炎的特征性变异；与Ｘ基因重叠处变异的意义需进一步研究。     

新疆部分地区人群及动物感染恙虫病东方体调查

目的 调查新疆部分地区人群及动物感染恙虫病东方体(Ot)情况,并对媒介昆虫进行调查.方法 采用多种方法捕获可能感染Ot动物取脾,当地牧民静脉取血,从野鼠体表捕获恙螨,用试剂盒提取DNA,应用巢式PCR( nPCR)检测Ot-Sta56基因;接种昆明小白鼠进行Ot病原传代分离.结果 共采取人群血液2 430份,在6份血液中检测并分离到Ot;捕获动物13种5 783个(只),从5种啮齿动物(小家鼠、灰仓鼠、大砂土鼠、草原兔尾鼠、灰旱獭)、2种鸟类(麻雀、灰腹鹡鸰)的脾中检测并分离到Ot,从绵羊血液中检测到Ot.其他动物体内未检测到Ot.从野鼠体表分离恙螨5种,从博乐纤恙螨体内检测分离到Ot.基因序列分析表明,新疆地区存在恙虫病东方体的基因型以Karp型为主,可能存在Saitama型.结论 新疆地区存在人群及动物感染Ot,其基因型以Karp为主,可能存在Saitama型.     

抗恙虫病东方体噬菌体抗体库的构建和初步筛选

目的 构建抗恙虫病东方体噬菌体抗体库并进行初步筛选,获得与恙虫病东方体膜抗原特异性结合的抗体克隆,为研制恙虫病的快速诊断试剂盒奠定基础.方法 从感染恙虫病东方体小鼠的脾细胞中提取RNA,经逆转录、PCR扩增出抗体轻链和重链基因,将轻链基因和表达载体pComb3进行酶切、连接.转化大肠杆菌XL1-blue,构建轻链库;再对轻链重组质粒和重链Fd基因进行酶切、连接,转化大肠杆菌XL1-blue,构建组合文库,以辅助噬菌体VCS M13进行超感染.用恙虫病东方体56 kDa型特异性抗原作为筛选抗原,进行4轮富集筛选后用ELISA法进行阳性克隆的鉴定.结果 构建了库容为3.46×106的鼠源性抗恙虫病东方体的噬菌体Fab片段抗体库.经过4轮富集筛选,抗体库中的目的 抗体得以富集约160倍,并用ELISA法对其进行鉴定,得到了7个阳性克隆.结论 构建的抗恙虫病东方体噬菌体抗体库,库容为3.46×106,滴度为2.5×1012 cfu/ml,基本上达到了建库要求,能够满足多样性的需求,并成功的筛选出抗恙虫病东方体56 kDa蛋白的抗体,用过氧化物酶标记的抗M13抗体进行了初步鉴定,认为具有一定的特异性.     

广州地区HCMV低传代临床病毒株UL143基因的多态性研究

目的 研究广州地区人巨细胞病毒(HCMV)临床低传代分离株UL143基因的多态性.方法 对3株经多重PCR鉴定的HCMV临床低传代分离株进行HCMV UL143基因全序列扩增,扩增产物克隆到pMD18-T载体上测序,并将其序列与GenBank中公布的其它临床分离株UL143基因一起进行分析.结果 D3株UL143基因因碱基缺失形成多处终止密码无法产生有功能的蛋白:Toledo株UL143基因开放读码框由279个核苷酸组成,编码蛋白由92个氨基酸残基组成;其它临床分离株UL143基因开放读码框均由252个核苷酸组成,DNA序列比较保守,变异均为碱基替换,编码蛋白由83个氨基酸残基组成,氨基酸序列也很保守,不同临床分离株氨基酸变异率为1.2%～2.4%;HCMV UL143蛋白翻译后修饰位点在除Toledo株之外的所有分离株中均高度保守,没有缺失或新增;不同临床分离株UL143蛋白二级结构有所不同;除Toledo株外,其余分离株UL143蛋白的等电点均为8.75.结论 临床低传代分离株HCMV UL143基因DNA及其编码产物的氨基酸序列极为保守,但仍存在一定多态性.     

2012～2013年广州市人感染恙虫病东方体基因型分析

目的了解广州市人感染恙虫病东方体基因型的分布及特点。方法收集2012~2013年广州市恙虫病临床诊断病人全血,测定型特异性抗原基因部分序列,并进行基因序列同源性及系统进化分析。结果 133份标本中检测到40份阳性,其中Karp型21株,Kato型10株,Gilliam型5株,TA763型3株,未知型别1株。同源性分析显示其传播来源可能与台湾、日本、泰国等有关。结论广州市恙虫病东方体流行型别具多样性,来源复杂,开展更多分子流行病学研究将有助于其防控。     

广州地区HCMV临床病毒株UL137基因的结构特征与多态性

【目的】研究广州地区新生儿感染人巨细胞病毒（HCMV）临床低传代分离株UL137基因的结构特征与基因多态性。【方法】从62份被证实为临床HCMV感染的新生儿尿液标本中分离获得3株低传代临床病毒株，经多重PCR鉴定后分别命名为HCMVD2、D3和D52。对3株临床分离株进行HCMVUL137基因全序列PCR扩增，PCR产物纯化后进行基因克隆，构建HCMVUL137-pMD18-T重组质粒；基因测序；将HCMVUL137基因序列呈报GenBank，并进行基因生物信息学分析。【结果】成功从广州地区新生儿感染HCMV患儿体内分离3株HCMV临床病毒株。克隆测序后呈报GenBank并被收录，收录序列号分别为：DQ180388、DQ180376、DQ180360。通过序列分析，结果显示低传代分离株UL137基因DNA序列高度保守，同源性在96．91％～100％之间．其变异均为碱基替换：编码蛋白均由96个氨基酸残基组成，同源性在90．63％～100％之间，超半数的变异发生在第61～81位氨基酸残基之间：编码蛋白翻译后修饰位点包括PKS、MYS、cAMPs三类，其中4个PKS和44～49位的MYS高度保守，cAMPs位点仅在5株病毒出现；编码蛋白等电点在11．50～12．00之间，呈强碱性。【结论】广州地区临床低传代分离株HCMVUL137基因核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列极为保守，但仍存在-定多态性。提示HCMVUL137ORF可能是-个具有重要功能的基因。     

新疆昌吉部分地区动物感染恙虫病东方体调查

目的了解新疆昌吉部分地区野生动物自然感染恙虫病东方体(Ot)的情况。方法采用多种方法捕鼠类,提取DNA,应用巢式PCR检测Ot-Sta56基因;阳性核苷酸序列片段测序,通过美国国家生物技术信息中心网站对基因序列进行BLAST比较分析。结果共捕获鼠432只、鸟类53只,仅在木垒县的鼠类、鸟类脾样本中检测到阳性片段,感染率分别为5.3%、11.1%;其他县市未检测到阳性。DNA序列分析表明,鼠类、鸟类阳性标本中扩增产物的核苷酸序列相同,碱基长度均为442bp。BLAST表明目的基因与Karp型的碱基序列同源性最高(98.5%),应属于Karp型。结论新疆昌吉地区木垒县啮齿类及鸟类动物中可能存在Ot感染。     

承德市部分地区鼠传病原体的调查研究及序列分析

目的 了解承德市部分县区鼠中3种病原体(莫氏立克次体、恙虫病东方体、无形体)的自然感染状况,为承德地区鼠传疾病监测和防控提供参考依据。方法 采用粘鼠板和鼠笼在承德市6个县区捕获鼠(野鼠、家鼠),取鼠肝、脾、肾和肺脏器标本提取总DNA。通过实时荧光定量PCR进行莫氏立克次体和恙虫病东方体检测。利用巢氏PCR对标本进行无形体16S rRNA基因片段扩增,并对产物进行测序,应用生物软件Mega 6.0进行分析。结果 承德市6个县区共检测鼠脏器标本59份,检出无形体片段1份,阳性率为1.7%。未检测到莫氏立克次体和恙虫病东方体。1份PCR阳性产物测序成功,序列分析结果显示检出的序列为沃尔巴克体,与已知序列进行同源性比对,显示与序列号为AY335931株同源性高达88%。结论 初步认定承德市部分县区鼠中存在无形体科病原体,未发现莫氏立克次体和恙虫病东方体病原体。     

海南省2019—2020监测年度A(H1N1)pdm09流感病毒基质蛋白基因特性分析

目的分析2019—2020监测年度(2019年4月1日—2020年3月29日)海南省A (H1N1) pdm09亚型流感病毒基质蛋白基因(Matrix, M)进化规律和M2蛋白氨基酸位点变异情况。方法选取14株2019—2020年海南省分离的A (H1N1) pdm09亚型流感病毒进行基因序列测定,采用Neighbor-Joining方法进行种系进化分析,通过系统进化树比较海南流行株与疫苗株的差异。测序结果用MEGA 10.1.8和DNASTAR7.0.1软件进行基因特性分析及基因同源性分析。结果 2019—2020监测年度,海南省A (H1N1) pdm09亚型流感病毒分离株占分离株的4.9%。序列分析显示,海南省A(H1N1) pdm09亚型流感病毒与国际疫苗株A/Brisbane/02/2018的M基因在核苷酸系统进化树6B.1分支上,核苷酸与氨基酸同源性范围为98.7%～100.0%、98.8%～100.0%。12株分离株胞外区编码区S23N氨基酸发生变异;跨膜区14株分离株均发生S31N位点突变,突变率为100.0%;1株I39V位点氨基酸变异;9株分离株在胞浆区E70D位氨基酸位点发生变异。结论 2019—2020监测年度海南省A (H1N1) pdm09亚型流感病毒活动水平较低,与疫苗株相匹配,对金刚烷胺类药物耐药,应特别关注M2蛋白氨基酸变异情况,为临床抗流感病毒药物的使用提供科学依据。     

恙虫病东方体Karp株47kDa蛋白成熟肽的克隆与表达

目的 :克隆表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi,Ot)Karp株 4 7kDa表面蛋白的成熟肽 ,探索其作为疫苗及诊断抗原的可能性。方法 :采用PCR方法 ,从 OtKarp株菌种基因组DNA中扩增出 4 7kDa成熟蛋白基因片段 ,将该片段克隆于原核表达载体pQE30 ,构建成重组质粒pQE30 4 7,转化大肠杆菌 (E coli) ,经IPTG诱导表达 ,SDS_PAGE和Western_blotting检测目的蛋白的表达。结果 :①获得长约 12 72bp的OtKarp株 4 7kDa外膜蛋白基因 ;②SDS_PAGE和免疫印迹显示该重组质粒转化的E coli有一相对分子量约为 4 3× 10 4 的独特蛋白带 ;③重组表达质粒序列分析结果显示pQE30 4 7中插入的基因片段的序列与已报告的OtKarp株 4 7kDa外膜蛋白基因序列基本一致 ,并与已知序列相同。结论 :获得了OtKarp 4 7kDa蛋白基因 ,并在E coli中实现了表达 ,表达的重组蛋白具有免疫反应性