沉默CC型趋化因子受体5对人乳腺癌细胞黏附及迁移的影响

构建CC型趋化因子受体5(CCR5)基因shRNA的真核表达载体,探讨沉默CCR5对乳腺癌细胞黏附与迁移能力的影响。在多种人乳腺癌细胞中检测CCR5的基因表达,选择CCR5表达较高的MDA-MB-231细胞做为基因沉默的研究对象;设计并合成2对靶向人CCR5基因的RNA沉默序列,连入基因沉默载体pSilencer 2.1-U6中,构建沉默质粒shCCR5-1 和shCCR5-2,定量PCR和蛋白印迹法检测CCR5基因沉默的效率;以细胞黏附实验和Transwell趋化小室实验分别检测沉默CCR5对MDA-MB-231细胞黏附和迁移能力的影响。结果表明,沉默CCR5可以抑制MDA-MB-231细胞的黏附能力,同时显著降低MDA-MB-231细胞的迁移和趋化。     

γδT细胞及其表达的趋化因子受体在疾病中的功能研究进展

γδT细胞是一种特殊类型的免疫细胞,它在多种疾病的发生发展中发挥了重要作用。研究表明γδT细胞迁移到病变部位是由于γδT细胞表面表达的趋化因子受体与组织或细胞分泌的趋化因子相互作用。本文就γδT细胞、γδT细胞表达的几个趋化因子受体及其配体与疾病的生物学关系进行综述。     

皮肤归巢T淋巴细胞的趋化性及趋化因子受体的表达

目的 :探讨由接触性过敏原或结核菌素诱发的细胞介导的皮肤炎症反应中 ,皮肤归巢T淋巴细胞的趋化性及其趋化因子受体的表达。方法 :取斑贴试验阳性或结核菌素皮肤反应试验阳性受试者的皮肤标本 ,利用 4 8孔微趋化板技术、流式细胞仪等检测皮肤归巢T淋巴细胞的趋化性及其趋化因子受体的表达。结果 :CC型趋化因子eotaxin、MIP 1α和CXC型趋化因子IL 8对于皮肤归巢T淋巴细胞有趋化效应 ,但这些细胞对RANTES无反应。皮肤归巢T淋巴细胞上CCR3、CCR5、CXCR1和CXCR2呈动态表达 ,而粘附分子ICAM 1则是高表达。在体外培养基中 ,趋化因子受体的表达即趋化运动的能力和粘附分子的表达受IL 2和IL 4的调节。结论 :在细胞介导的皮肤炎症反应中 ,趋化因子及其受体通过与T细胞源性的生长因子IL 2和IL 4的相互作用决定了皮肤归巢T淋巴细胞的定向迁移、粘附、聚集和循环 ,同时也决定了嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的聚集     

血清淀粉样蛋白A对小胶质细胞迁移的影响及机制研究

探究血清淀粉样蛋白A(SAA)对小胶质细胞迁移的影响及机制。采用Transwell小室法检测SAA诱导原代小胶质细胞和鼠源N9小胶质细胞的迁移能力。用Transwell检测甲酰肽受体2(FPR2)拮抗剂和TLR2中和抗体对SAA诱导N9小胶质细胞迁移的影响。实时荧光定量PCR检测SAA作用N9小胶质细胞后,FPR2和Toll样受体2(TLR2)的表达变化。Western blot检测SAA对N9小胶质细胞下游信号通路激酶表达的影响。用Transwell检测信号通路抑制剂对SAA诱导的N9小胶质细胞迁移的影响。结果显示:SAA以浓度依赖性方式促进原代小胶质细胞和N9小胶质细胞迁移。FPR2拮抗剂和TLR2中和抗体抑制了SAA诱导的N9小胶质细胞迁移。SAA促进了N9小胶质细胞内FPR2和TLR2受体的mRNA转录水平增加。SAA刺激N9小胶质细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和核因子κB(NF-κB)信号通路的激活,表现为细胞外调节蛋白激酶(ERK)、p38和c-Jun氨基末端激酶(JNK)磷酸化水平增加,I?Bα表达水平降低。p38、JNK和NF-κB信号通路抑制剂抑制了SAA诱导的...     

抗体封闭趋化蛋白受体5对1型糖尿病发病的影响

目的:研究体内封闭趋化蛋白受体5(CCR5)分子对严重联合免疫缺陷小鼠(severe combined immunodeficientNOD,NOD.Scid)1型糖尿病发病的影响.方法:将发病非肥胖性糖尿病小鼠(1只)的脾细胞腹腔注射至NOD.Scid小鼠体内,将这些小鼠随机分成2组(每组8只):抗CCR5组小鼠腹腔注射抗CCR5膜外第一襻的多克隆抗体,1周3次,共计12次;对照组相同方法注射PBS,同时测定其血糖和体重.脾细胞注射后70 d或当小鼠出现重度糖尿病临床表现时处死,进行组织学观察和脾细胞分泌细胞因子的ELISA测定.结果:脾细胞射后70 d内,抗CCR5组小鼠糖尿病发病率为37.5%(3/8),对照组为100%(8/8);胰腺炎积分抗CCR5组较对照组差异显著(P＜0.05);抗CCR5组IL-2、IL-10、IFN-γ水平分别为25.2、27.3 Pg/ml和0.238 ng/ml,对照组为57.7、31.6 Pg/ml和18.03 ng/ml,前者的IL-2和IFN-γ水平显著低于后者(P＜0.05).结论:在NOD.Scid小鼠体内注射抗体封闭CCR5可以部分抑制1型糖尿病的发生.     

Glycodelin －A 对 CD4＋T 细胞表达趋化因子受体的影响

目的：通过研究妊娠相关蛋白－A（Glycodelin －A）对 CD4＋T 细胞表达趋化因子受体的影响,探讨Glycodelin －A 影响 CD4＋T 细胞的可能机制。方法抽取正常育龄女性外周血,将全血加入不同浓度 Glycodelin －A 后于体外环境下分别培养6、24、48 h。多重荧光标记后利用流式细胞术（FCM）分析 CD4＋T 细胞表面 CXCR4、CCR2、CCR5表达率。结果Glycodelin －A 对 CD4＋T 表达 CXCR4表达无明显调节作用,适宜浓度下对 CD4＋T 表达 CCR2起上调作用,对 CD4＋T 表达 CCR5起下调作用。结论Glycodelin －A 可通过改变 CD4＋T 细胞表达趋化因子受体 CCR2、CCR5表达影响 CD4＋T 细胞功能。     

过表达趋化因子受体4的内皮祖细胞影响血管平滑肌细胞迁移、增殖

目的 研究过表达趋化因子受体4(chemokine receptor 4,CXCR4)的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)迁移、增殖的影响.方法 分离培养并鉴定大鼠骨髓来源EPCs.CXCR4的重组腺病毒感染EPCs后,流式细胞术、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别检测细胞膜CXCR4受体及mRNA表达,CCK-8法、Transwell法分别检测EPCs增殖活性、迁移能力.建立过表达CXCR4的EPCs与VSMCs非接触共培养模型,Transwell法、CCK-8法检测EPCs对VSMCs的迁移、细胞存活的影响.结果 CXCR4重组腺病毒感染EPCs 48 h后,EPCs细胞膜CXCR4受体和mRNA表达明显增高(P＜0.01),过表达CXCR4对EPCs增殖活性无明显影响,但可增强EPCs定向迁移能力(P＜0.01).共培养模型中,SDF-1α诱导下,CXCR4组VSMCs迁移、细胞存活率明显降低(P＜0.05),无SDF-1α诱导下空白对照组、GFP组及CXCR4组VSMCs的迁移、细胞存活率整体高于SDF-1α诱导下各组(P＜0.05).结论 过表达CXCR4可增强EPCs的迁移能力,在SDF-1/CXCR4调控轴中加强EPCs对VSMCs迁移和增殖的抑制作用,可用于防治血管再狭窄的细胞治疗.     

小窝蛋白-1对N-甲基-D天冬氨酸诱导的脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白带状闭合蛋白1的破坏作用研究

目的:探索小窝蛋白(Cav)-1对N-甲基-D天冬氨酸(NMDA)诱导的脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白带状闭合蛋白1(ZO-1)和血脑屏障完整性的破坏作用.方法:体外培养人脑微血管内皮细胞HBEC-5i并构建血脑屏障模型.以不同浓度的NMDA孵育HBEC-5i,并观察其对细胞活力的影响.细胞分别用NMDA受体(NMDAR...     

基于时间序列模型评估淀粉样蛋白引起的脑血管内皮功能损伤

建立时间序列模型评估β-淀粉样蛋白(Aβ)引起的脑血管内皮功能损伤,探讨相关标记物对脑血管内皮功能损伤的影响和贡献程度。将永生化人脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)与2.5 μmol/L Aβ共同孵育,在2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24 h分别测定胞浆Ca²⁺、线粒体膜电位(MMP)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性和细胞活力,借助时间序列模型探讨相关标记物对细胞损伤的影响和贡献程度。脉冲响应分析表明,给胞浆Ca²⁺一个正冲击后,细胞活力被抑制并持续走低;给eNOS和MMP一个正冲击后,细胞活力上升,并在早期上升速度较快,晚期上升速率有所下降。方差解析表明胞浆Ca²⁺水平在脑血管内皮细胞损伤中占主要作用,且这种影响随着疾病进程的发展而下降。结合模型研究推断在损伤早期干预Ca²⁺通道有可能改善Aβ引起的脑血管内皮功能损伤。     

趋化因子受体-5相关的心脏移植物血管病变的研究进展

心脏移植物血管病变（CAV）是影响心脏移植物长期存活的主要因素,也是导致受者在术后1年死亡或再次心脏移植的主要原因。目前,普遍认为CAV的发病机制主要是免疫性因素和非免疫性因素共同参与的血管内皮损伤,使血管内膜增厚,最终引起移植心脏缺血。趋化因子及其受体共同参与调控移植物局部的免疫应答。其中,趋化因子受体-5（CCR5）可能在CAV发病机制中起着重要的作用,但其调控CAV的机制目前尚不明确。迄今,CAV的治疗方法仍较为局限;但随着对CCR5研究的不断深入,出现了一些新的研究成果,为CAV的治疗和预防提供了新的方向。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的分离、培养原代脑微血管内皮细胞,建立体外血脑屏障模型。同时探索高纯度、活性好的脑微血管内皮细胞的分离培养方法。方法取3周大鼠大脑,分离皮质,经过匀浆、葡聚糖离心以及消化后,取纯度较高的脑微血管段种植于胶原蛋白包被过的塑料培养瓶中进行培养。显微镜观察及检测Ⅷ因子相关抗原。结果镜下细胞呈长梭形,7d左右细胞可融合,Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测为阳性,且阳性细胞占绝大部分。结论本实验成功分离大鼠脑微血管内皮细胞,并进行原代培养,为脑微血管内皮细胞的进一步研究提供了模型,也为构建更高级的大鼠体外血脑屏障奠定基础。     

无血清培养对小鼠脑微血管内皮细胞凋亡的影响及其机制

目的　研究无血清培养诱导小鼠脑微血管内皮细胞凋亡及其可能机制。方法　培养用小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd .3。用流式细胞术检测凋亡细胞的百分比;用免疫细胞化学法检测Bax及Bcl- 2蛋白表达;用WesternBlot检测caspase 3蛋白表达。结果　bEnd .3细胞经无血清饥饿体外培养12 ,2 4 ,36h后细胞凋亡率明显增加,分别为(13.79±0 .99) % ,(17.80±1.39) % ,(2 0 .5 1±0 .5 5 ) % ,与各自正常血清培养的对照组凋亡率相比,P <0 .0 1。Bax表达明显增强,Bcl -2表达明显减弱,caspase 3明显增强。结论　无血清饥饿培养可诱导bEnd .3细胞发生凋亡,其发生机制与Bax/Bcl 2的变化及caspase 3的激活有关。     

小鼠脑微血管内皮细胞的体外培养

目的 探讨脑微血管内皮细胞的体外培养方法并进行细胞超微结构研究及组织型纤溶酶原激活物（ＴＰＡ）活性测定。方法 取新生小鼠脑组织,通过匀浆、过筛、胶原酶消化、差速粘附等技术对鼠脑微血管内皮细胞进行原代培养,待细胞铺满瓶底时,用０．１２５％胰酶－０．０２％ＥＤＴＡ消化,离心收集内皮细胞,进行传代培养。原代、传代各取８例,吸取培养液用酶联免疫吸附试验测试ＴＰＡ活性。结果 经Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学鉴定     

体外分离、培养大鼠脑微血管内皮细胞的若干问题

目的 建立一种程序简便、经济、获得细胞纯度较高的体外分离、培养大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)的方法。方法 以SD大鼠为实验材料，采用两步滤过法获得微血管段，胶原酶消化，低分子右旋糖苷密度离心获得BMECs，接种后4h换液使获得的细胞纯化。倒置显微镜下观察细胞的形态，细胞Ⅷ因子相关抗原(ⅦF-Ag)免疫细胞化学法鉴定细胞及其纯度，通过碱性磷酸酶(AKP)的表达来分析BMECs被微动脉和微静脉污染的程度，通过测定BMECs分泌ET-1的量，鉴定培养的BMECs活力。结果 经分离培养获得的BMECs在倒置显微镜下呈多角形或“铺路石”形，单层贴壁生长。培养的细胞Ⅷ因子相关抗原免疫组化试验阳性，细胞纯度为90％。AKP染色阳性细胞百分比为93％，总积分112。原代培养内皮细胞的ET-1含量为388．03pg／ml，传代后为591．75pg／ml。结论 采用两步滤过法获得脑微血管段，胶原酶消化，低分子量右旋糖苷密度离心可分离和培养大鼠BMECs。该方法较其他方法程序简单，获得细胞纯度高。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定

目的探讨大鼠脑微血管内皮细胞培养方法。方法 5～7 d龄SD大鼠脑皮质用胶原酶消化得到脑微血管段后,接种于培养瓶进行原代培养。培养的细胞采用倒置显微镜进行形态学观察,免疫荧光法鉴定Ⅷ因子相关抗原,MTT法测定细胞活力。结果倒置显微镜下细胞呈单层＂铺路石样＂排列的典型特征;Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测得阳性细胞率达95%;MTT法测定结果显示第120 h细胞活力最强。结论该培养方法能成功地分离并培养出纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞,对更深入地研究脑微血管内皮细胞的生物学特性及功能具有重要意义。     

通络救脑注射液及其有效成分对拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞的保护作用

目的通过观察通络救脑注射液及其有效成分对拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞活性的影响,以及对血管生成素-1（angiopoietin-1,Ang-1）及其受体内皮特异性酪氨酸激酶受体-2（endothelial-specific tyrosine kinasereceptor 2,Tie-2）表达的影响,以评价其对拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞的保护作用。方法利用氧糖剥夺方法复制人脑微血管内皮细胞拟缺血损伤模型,通络救脑注射液及其有效成分分别作用不同时间后,采用四甲基偶氮唑盐染色法测定细胞活性,采用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）漏出率检测细胞损伤程度,采用蛋白印迹法检测内皮细胞Ang-1和Tie-2表达水平。结果通络救脑注射液可显著提高拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞活性,降低LDH漏出率,增加内皮细胞Ang-1和Tie-2的表达,两个有效成分发挥疗效的时间有所不同,复方注射液作用明显优于两个有效成分。结论通络救脑注射液对拟缺血损伤人脑微血管内皮细胞具有保护作用,其机制与增加Ang-1及其受体Tie-2表达有关,显示中药组方可发挥整合调节的治疗优势。     

大鼠原代脑微血管内皮细胞体外分离与培养的实验研究

目的 探讨获取大鼠脑微血管内皮细胞(BMEC)的简单、有效方法,为构建体外血肿瘤屏障(BTB)模型提供材料.方法 采集出生3～5 d的Wistar胎鼠大脑皮质,应用酶消化法及葡聚糖离心法获得脑微血管段后,接种于培养皿中进行原代培养,采用倒置显微镜对所培养的细胞进行形态学观察;以Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色法鉴定细胞;将BMEC与C6脑胶质瘤细胞共培养,构建体外BTB模型,并采用免疫组化法和免疫荧光法检测BMEC间紧密连接相关蛋白occludin的表达.结果 体外培养2h时脑微血管段贴壁,12～48 h见圆形生发中心形成,2～3d单层内皮细胞自生发中心长出,4～5 d见较大单层内皮细胞团,5～7 d可见融合成片的内皮细胞单层,外观呈“铺路石”样;第Ⅷ因子免疫组化结果显示“铺路石”样细胞胞质呈棕黄色染色;紧密连接相关蛋白occludin的免疫组化和荧光结果证明共培养的BMEC间表达BTB的特性.结论 本方法能成功地进行大鼠原代BMEC培养,构建大鼠体外BTB模型,进而应用于BTB的生理、生化及药理学研究.     

人促甲状腺激素受体HEK 293T细胞稳定表达株的构建

目的 构建人促甲状腺激素受体（hTSHR）稳定表达株,用于研究抗甲状腺新药。方法 AgeⅠ/NheⅠ双酶切载体GV266和hTSHR基因,T4连接酶连接构建GV266-hTSHR表达质粒。转染GV266-hTSHR到293T细胞后,Western blot证明hTSHR表达。用Opti-MEM、Lipofectamine 2000、辅助质粒在293T细胞构建GV266包装质粒。qPCR测定包装病毒滴度。用GV266包装质粒、GV266-hTSHR表达质粒共转染293T细胞获得GV266-hTSHR-293T稳定表达株。绿色荧光蛋白(GFP)荧光鉴定稳定表达株。结果 GV266-hTSHR构建物阳性大肠杆菌克隆的DNA测序结果与hTSHR序列比对100%吻合。Western blot显示,过表达hTSHR的 HEK 293T细胞出现相对分子质量为62×103的目的条带。qPCR测定包装质粒滴度达到了2×108 TU/mL。GV266-hTSHR-293T细胞稳定表达株表达GFP荧光。结论 构建了GV266-hTSHR表达质粒,获得了GV266-hTSHR-HEK 293T稳定表达株,为研究抗甲状腺多肽提供了必要的实验材料。     

片仔癀对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响

目的 观察片仔癀对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移的影响,并探讨其作用机制.方法 用MTT法检潮片仔癀对HUVEC增殖的影响,用划痕损伤实验观察片仔癀对HUVEC的迁移的影响.结果 片仔癀干预6、12、24、48 h后,与空白对照组比较,各剂量组抑制HUVEC的增殖能力(P＜0.01),且有剂量和时间依赖;片仔...