聚合酶链反应加限制性内切酶多态性分析快速诊断细菌感染的临床研究

目的　探讨细菌 16S 2 3SrRNA基因区间检测在临床细菌感染病原诊断中的应用价值。方法　以 16S 2 3SrRNA基因区间为靶序列 ,在其保守序列内设计共同引物 ,对临床新生儿败血症 (42例 )血标本及疑似化脑 (6例 )患儿的脑脊液标本进行PCR扩增及进一步的RFLP分析 (聚合酶链反应加限制性内切酶长度多态性分析 ) ,参照已建立的常见菌种的特异 16S 2 3SrRNA基因区间图谱以诊断病原菌 ,同时用血培养法作为对照。结果　 42例新生儿败血症血培养 15例阳性 ,阳性率为 35 7% ;2 7例PCR检测阳性 ,阳性率为 6 4 3 % ,PCR阳性率明显高于血培养 (P <0 0 1)。血培养阳性的 15例中 14例PCR检测阳性 ,两者菌种相符。 15例正常对照组的血标本其血培养及PCR检测均阴性。 6例脑脊液标本 ,其中 1例培养为表皮葡萄球菌 ,经PCR检测也为葡萄球菌 ;2例培养阴性 ,经PCR检测图谱分析为葡萄球菌 ;1例培养为新型隐球菌的脑脊液标本PCR检测阴性 ;另 2例培养及PCR检测均阴性。结论　运用PCR RFLP法检测细菌 16S 2 3SrRNA基因区间具有特异、敏感、快速、准确的特点 ,为临床细菌感染的病原诊断提供新的方法。     

细菌16S rRNA基因荧光定量PCR诊断新生儿败血症

目的探讨新生儿败血症的快速可靠诊断方法,以提高临床检测细菌的速度及准确性。方法以细菌16SrRNA基因为靶序列,设计通用引物及TaqMan探针,建立细菌16SrRNA基因实时荧光定量PCR反应体系;选择临床引起新生儿败血症的常见菌如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大肠埃希菌等进行浓度梯度实验;对临床疑为新生儿败血症的830例感染性疾病的新生儿抽取静脉血分别做细菌16SrRNA基因荧光定量PCR和血培养检测。结果临床常见分离株金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌荧光定量PCR检测结果均为阳性;巨细胞病毒、EB病毒、乙肝病毒,新型隐球菌及白色念珠菌,人基因组DNA及空白对照均为阴性。细菌荧光定量PCR最低能检测到3个细菌,其荧光定量CT值为37．90;对临床疑为感染性疾病的830例患儿标本中,荧光定量PCR检测血标本阳性率5．18％（43／830）,血培养阳性率2．41％（20／830）,前者明显高于后者,差异具有统计学意义,P〈0．01,30例非感染性疾病患儿血标本荧光定量PCR检测及细菌培养均为阴性。若以血培养作为对照,荧光定量PCR方法的诊断敏感性为100％,特异性为97．16％,正确诊断指数为0．972。结论建立了细菌16SrRNA基因荧光定量PCR诊断新生儿败血症方法。其检测快速、简便,为新生儿败血症提供早期、敏感的病原学诊断依据。     

16SrRNA基因PCR加基因芯片杂交快速诊断新生儿败血症

目的　探讨新生儿败血症的快速诊断方法。方法　 (1)以 16SrRNA基因为靶序列 ,设计引物及寡核苷酸探针 ;将探针固定在特制的玻片上制作成基因芯片 ;(2 )对临床疑为细菌感染的 2 85例新生儿抽取静脉血分别做血培养和细菌 16SrRNA基因检测 :于血标本及脑脊液中抽提DNA后采用聚合酶链反应 (PCR)扩增 ,将扩增产物加样在基因芯片上杂交后进行激光扫描及读片。结果(1)PCR检测阳性率 5 96 % (17/2 85 )明显高于血培养的 2 81% (8/2 85 ) ,差异有显著意义 (P <0 0 1)。若以确诊败血症作为对照 ,PCR的诊断敏感性为 10 0 % ,特异性为 96 75 % ,正确诊断指数为 0 96 8。(2 )对 17份PCR阳性标本进一步做基因芯片杂交 ,结果通用探针均阳性 ,其中G 探针阳性 12份、G-探针阳性 5份 ;8份PCR和血培养均阳性的标本 ,基因芯片杂交探针阳性菌株与血培养细菌阳性结果完全一致。结论　基因芯片杂交技术检测临床标本中 16SrRNA基因能快速诊断新生儿败血症 ,除较血培养等方法有更好的敏感性和特异性外 ,还能快速明确系何种病原菌感染 ,因此有较大的推广及应用价值     

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目的 探讨新生儿化脓性脑膜炎(以下简称化脑)新的快速诊断方法.方法 2003年8至2006年2月浙江大学医学院附属儿童医院采用脑脊液细菌16S rRNA基因芯片技术对24例临床上疑似化脑患儿脑脊液(CSF)的细菌DNA进行测定,同期进行与CSF细菌培养的对照.结果 (1)49株细菌PCR扩增产物基因芯片杂交结果显示,33株C+菌其G+探针和通用探针均阳性,G-探针阴性;16株G-菌中,G-探针和通用探针均阳性,G+探针阴性,均能与相应特异的探针发生杂交.(2)大肠埃希菌DNA的PCR产物其16S rRNA基因芯片的最小检出量为1pg,约等于10个拷贝教,相当于2个细菌.(3)16S rRNA基因芯片检测24份脑脊液标本发现11份阳性,阳性率为45.83%(11/24),明显高于脑脊液培养的阳性率12.50%(3/24),差异有统计学意义(P<0.01).结论 脑脊液细菌16S rRNA基因芯片检测技术特异性强、敏感性高,需标本量少,是早期快速诊断儿童化脑的可靠方法,具有较大的应用价值.     

16SrRNA基因PCR加反相杂交检测细菌DNA方法的建立与初步应用

目的探讨聚合酶链反应(PCR)加反相杂交技术在细菌DNA检测中的应用。方法以16SrRNA基因为靶序列,设计引物及寡核苷酸探针,采用PCR法加反相杂交检测标准菌株及临床标本细菌NDA。结果对20种标准菌株进行PCR扩增,均出现371bp长度的DNA片段,敏感性试验可检测出1×10-12g的细菌DNA,与人基因组及病毒无交叉反应;22份血培养阳性标本及4份脑脊液培养阳性标本均扩增出371bp长度DNA条带,反相杂交区分革兰阳性或阴性细菌与培养结果相符。结论16SrRNA基因PCR加反相杂交技术检则细菌DNA,具有特异、敏感、快速、准确的特点,可为细胞感染的临床诊断提供依据。     

细菌16S rRNA基因实时荧光定量及分型方法的建立

目的：细菌培养、组织学、免疫学及普通PCR方法等在病原菌的检测方面都存在一定的不足,不能满足临床的需要,探索快速可靠的败血症和化脓性脑膜炎等细菌性感染疾病诊断的新方法是目前亟待解决的关键问题。方法：分析细菌16S rRNA 基因序列,在高度保守区自行设计通用引物和探针,以及革兰阳性和阴性分型探针,对12种标准菌株、23种临床培养分离株、乙型肝炎病毒、新型隐球菌及白色念珠菌、人基因组DNA等进行了荧光定量检测, 分析三种探针检测结果的相关性。结果：细菌16S rRNA基因荧光定量PCR具有较好的敏感性和特异性,最低能检测到10个拷贝的16S rRNA基因,即相当于2个细菌,与病毒、真菌及人基因组DNA等无交叉阳性反应;12种标准菌株、23种临床培养分离株均进行三种探针的荧光定量检测：通用探针均为阳性,18株革兰阳性菌株通过革兰阳性探针（G+Probe探针）检测为阳性,17株革兰阴性菌株通过革兰阴性探针（G-Probe探针）检测为阳性,反之均为阴性,吻合率100％。结论：建立了用通用引物和分型双荧光探针的细菌荧光定量PCR定量、分型方法。其检测方便,快速、敏感性和特异性高,符合率好,同时进行定量和分型,在病原菌检测方面具有推广及应用价值     

新生儿化脓性脑膜炎的临床特点与早期诊断

目的探讨新生儿化脓性脑膜炎的临床特点与早期诊断方法。方法选择2010年3月-2011年12月就诊于本院新生儿科疑似化脓性脑膜炎患儿100例,均于本院应用抗生素前行腰椎穿刺术,留取脑脊液(CSF)标本行常规、生化检测及培养,同时留取CSF 1 mL行PCR检测16 S rRNA。结果临床诊断为化脓性脑膜炎者40例,其中发热36例(90%),惊厥29例(72.5%),呼吸暂停5例(12.5%),前囟饱满23例(57.5%)。临床诊断为化脓性脑膜炎40例患儿,其CSF PCR检测均为阳性。CSF培养阳性5例,该5例CSF参数异常,PCR检测均呈阳性。PCR检测16 S rRNA阳性58例,PCR阳性率明显高于CSF培养、CSF参数(χ2=65.09,P=0.00;χ2=6.48,P=0.01)。结论新生儿化脓性脑膜炎临床特点不典型,CSF检查存在一定局限性,CSF培养阳性率低,结合PCR检测能提高阳性率。     

应用微滴式数字PCR技术快速诊断新生儿侵袭性真菌病

目的 探讨微滴式数字PCR（ddPCR）技术在快速、精确诊断新生儿侵袭性真菌感染（IFI）中的临床应用价值。方法 选择真菌高度保守序列18S rRNA为目标序列，通过引物设计，建立ddPCR检测真菌体系。在深圳一家医院新生儿重症监护室采集了有IFI高危因素和/或临床症状的83例患者血样（n=83），采用血培养及ddPCR法分别对血样进行真菌检测。结果 ddPCR检测真菌体系的特异性为100%，灵敏度可以达到3.2 copies/μL，重复性良好。临床试验中，22例确诊/临床诊断IFI患儿血样中，ddPCR检测阳性19例。61例拟诊/非IFI患儿血样中，ddPCR法检测结果有2例阳性。结论 初步证明ddPCR技术可用于新生儿IFI的检测，该技术是新生儿IFI筛查甚至诊断很有前途的工具。     

应用巢式聚合酶链反应和测序检测肺炎支原体23S rRNA中点突变

目的 建立快速检测肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae,MP)耐药性的实验方法并应用于临床以了解MP耐药现状.方法 应用巢式PCR直接检测咽拭子标本MP-23S rRNA基因并对扩增产物进行电泳检测或DNA测序分析;通过MP培养及体外药物敏感性试验测定临床分离株的红霉素最小抑菌浓度,以验证23S rRNA基因检测结果的可靠性.结果 200例临床标本经MP-IgM抗体、咽拭子MP种特异性16S rRNA基因巢式PCR扩增和MP分离培养测定证实为MP 64例.应用巢式PCR技术扩增MP-23S rRNA基因,并对扩增产物进行测序,将基因序列与基因库中MP标准株基因序列进行比较,与标准株序列相同的共计26例,其余38例存在23S rRNA点突变:35例在2063位点发生了A到G的点突变,1例在2063位点有A到C的点突变,2例在2064位点有A到G的点突变;耐药率为59.4%.MP耐药基因检测方法灵敏度达102 ccu/ml,MP培养及药物敏感性试验证实23S rRNA基因检测结果可靠.结论 建立的MP耐药基因检测方法能直接检测临床标本中的MP耐药基因.59%的受检标本23S rRNA基因发生点突变.     

细菌16S-23S rRNA 基因特异DNA图谱的分子诊断

目的　应用聚合酶链反应 (PCR)、限制性内切酶片段长度多态性分析 (RFLP)及测序技术 ,建立检测不同属种细菌的 16S 2 3SrRNA基因区间的特异图谱。方法　对临床上常见的细菌进行PCR扩增、RFLP、分子克隆及序列分析 ,同时对临床标本进行培养与PCR RFLP比较。结果　 2 7株不同细菌行PCR扩增后 ,得到不同DNA图谱。其中 15种细菌经PCR扩增即可区分 ,另 10种经HinfI或AluI酶切后才能区分。肺炎克雷伯菌与坚韧肠球菌的差异只在第 779位碱基上不同 ,XmaIII酶能区别。 42例临床诊断为新生儿败血症者 ,15例培养阳性 ,阳性率 3 5 7% ;而PCR阳性者则为 2 7例 ,阳性率为 64 2 9% ,明显高于血培养 (P <0 0 1)。 6例脑脊液标本中 ,1例PCR及培养均阳性 (表皮葡萄球菌 ) ;2例培养阴性标本 ,其PCR也阳性 ;经图谱分析为葡萄球菌 ,1例培养为新型隐球菌的脑脊液标本PCR检测为阴性。另 2例PCR及培养均阴性。结论　建立了PCR RFLP技术快速检测细菌 16S 2 3SrRNA基因区间的方法 ,具有特异、敏感、快速、准确的特点 ,为临床细菌感染的病原诊断提供新的科学依据。     

Rapid diagnosis of bacterial sepsis with PCR amplification and microarray hybridization in 16S rRNA gene

In this study, blood culture and PCR-microarray analysis were used to examine 172 cases of suspected septicemia. Primers and oligonucleotide probes, based on the sequences of bacterial 16SrRNA gene, were arrayed by imprinting on microarray slides. Blood specimens collected from 172 cases of suspected septicemia were cultured and then tested separately by PCR for the bacterial 16S rRNA. Of the 172 clinical cases, 17 cases tested positive by PCR. The number of positives identified by PCR (9.88%) was significantly higher than the number of positives identified by the blood culture (4.65%). When blood culture was used as control, the sensitivity of PCR was 100%, the specificity was 97.85%, and the index of accurate diagnosis was 0.979. When the 17 PCR positive specimens were further analyzed by hybridization against the microarrays, five were found to be probe positive for E. coli, four were positive for S. epidermidis, four were positive for CoNS, and two were positive for Bacillus and Propionibacterium, respectively. In the eight specimens showing positive results by both PCR and blood culture, the species determined by microarray analysis corresponded with the result obtained from blood culture. Detection of the bacterial 16SrRNA genes in clinical specimens by PCR and microarray analysis can be used to accurately diagnose neonatal sepsis. This method has a higher sensitivity and specificity than blood culture and can provide a rapid way for the etiological diagnosis of neonatal septicemia.     

Rapid diagnosis of bacterial meningitis by using multiplex PCR and real time PCR

BACKGROUND: The purpose of the present study was to improve a method for a rapid identification of bacteria in bacterial meningitis by using multiplex polymerase chain reaction (PCR). METHODS: Ten species of bacteria which cause meningitis in children were investigated, and cerebrospinal fluid from patients with purulent meningitis was studied. The ribosomal RNA genes of bacteria are essential, and are highly conserved in the bacterial kingdoms with consensus region. The 23S rRNA region shows a larger variation among species than in the 16S rRNA region. The authors set primers in the universal region and specific region of 23S rRNA, then amplified these regions by multiplex PCR and real-time PCR. RESULTS: All species of bacteria showed one band by PCR using universal primer. Haemophilus influenzae and Streptococcus pneumoniae showed two bands by multiplex PCR using a combination of universal primers and specific primers. The authors detected H. influenzae within 15 min by using real-time PCR. CONCLUSION: It was possible to identify clinically significant bacterial species in cerebrospinal fluid by multiplex PCR, and to identify H. influenzae by real-time PCR within a short period.     

儿童感染幽门螺杆菌对克拉霉素耐药情况及耐药机制初步研究

目的了解儿童幽门螺杆菌(Helicobacter pylor,Hp)对克拉霉素的耐药情况,探讨Hp对克拉霉素耐药性与23S rRNA基因突变的关系。方法。108例胃黏膜标本均取自2002年10月-2004年1月在浙江大学医学院附属儿童医院进行胃镜检查的患儿,经分离培养鉴定为Hp菌株后,分别采用E-test法和琼脂稀释法检测克拉霉素的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),确定Hp菌株对克拉霉素的耐药性。提取所有108株Hp基因组DNA进行PCR扩增,用限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)检测克拉霉素耐药菌株的点突变。结果Hp菌株对克拉霉素耐药率为14．8％(16／108)。16株耐药菌株23S rRNA V功能区PCR扩增片段RFLP分析,13株被BsaⅠ酶切,提示2144位点存在A→G点突变,3株被BbsⅠ酶切,提示2143位点存在A→G点突变,所有敏感菌株均不能被BsaⅠ和BbsⅠ酶切,提示无23S rRNA基因相应位点的点突变。同时本研究中并未发现突变形式与耐药程度的相关性。结论儿童Hp感染对克拉霉素耐药率较高;23S rRNA基因点突变是Hp对克拉霉素耐药的重要因素。耐药菌株存在A2144G和A2143G突变,以前者为主。     

Detection of bacterial DNA by PCR and reverse hybridization in the 16S rRNA gene with particular reference to neonatal septicemia

AIM: The clinical diagnosis of sepsis is difficult, particularly in neonates. It is necessary to develop a rapid and reliable method for detecting bacteria in blood and cerebrospinal fluid (CSF). Polymerase chain reaction (PCR) and reverse hybridization of the 16S rRNA gene would permit fast and sensitive determination of the presence of bacteria and differentiate gram-positive bacteria from gram-negative ones in clinical specimens. METHODS: We developed a pair of primers according to the gene encoding 16SrRNA found in all bacteria. DNA fragments from different bacterial species and from clinical samples were detected with PCR, and with reverse hybridization using a universal bacterial probe, a gram-positive probe and a gram-negative probe. RESULTS: A 371 bp DNA fragment was amplified from 20 different bacterial species. No signal was observed when human DNA and viruses were used as templates. The sensitivity could be improved to 10(-12) g. All 26 culture-positive clinical samples (22 blood samples and 4 CSF samples) were positive with PCR. The gram-negative and gram-positive probes hybridized to clinical samples and to known bacterial controls, as predicted by Gram's stain characteristics. CONCLUSIONS: Our results suggest that the method of PCR and reverse hybridization is rapid, sensitive and specific in detecting bacterial infections. This finding may be significant in the clinical diagnosis of sepsis in neonates.