超声作用下CTGF-siRNA对大鼠肝纤维化基因治疗的实验研究

目的探讨利用超声微泡造影剂介导携带结缔组织生长因子-小干扰RNA(CTGF-siRNA)真核表达质粒转染大鼠肝细胞的有效性。方法 (1)构建CTGF-siRNA真核表达质粒;(2)将40只实验大鼠随机分为7组:正常组,实验对照组,CTGF-siRNA质粒组,超声联合微泡组,超声联合微泡介导基因低、中、高剂量组;(3)建立肝纤维化模型,基因治疗4周后处死大鼠,超声及病理切片HE染色评价肝纤维化程度,masson染色观察胶原纤维含量,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝组织中CTGF、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达。结果 (1)CTGF-siRNA基因治疗后超声及病理切片显示干预组纤维化程度降低;(2)masson染色显示超声介导微泡基因组胶原纤维含量表达量随着剂量增高而降低(P<0.05);(3)RT-PCR显示超声介导微泡基因组CTGF、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达明显低于其他组,且随着质粒剂量增大而减少(P<0.05)。结论超声微泡作用下CTGF-siRNA基因能特异地作用于靶位点,有效抑制肝纤维化进程,提高对肝纤维化干预的特异度。     

DMN肝纤维化模型肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原和TIMP-1 mRNA表达及复方861的干预作用

目的研究二甲基亚硝胺(DMN)肝纤维化模型Ⅰ型胶原(CoL-1)、Ⅲ型胶原(CoL-Ⅲ)和基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1) mRNA表达以及复方861的干预作用.材料和方法采用1%DMN 1ml/kg腹腔注射模型组大鼠,复制DMN诱导的大鼠肝纤维化模型,同时复方861灌胃3g/kg,共8周,以RT-PCR法观察肝纤维化模型肝组织CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ及TIMP-1 mRNA表达水平.结果DMN大鼠肝纤维化模型组CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ及TIMP-1 mRNA分别为0.827±0.094、0.953±0.033及0.924±0.110,明显高于正常对照组(P＜0.01);复方861治疗组CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ及TIMP-1 mRNA为0.497±0.057、0.851±0.065和0.648±0.107,明显低于模型对照组(P＜0.01或P＜0.05).结论DMN肝纤维化模型肝组织CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ及TIMP-1 mRNA表达水平增高,复方861能够抑制肝组织CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ及TIMP-1 mRNA的表达,从而发挥其抗肝纤维化的作用.     

超声辐照微泡介导肝细胞生长因子基因逆转大鼠肝纤维化

目的 探讨超声辐照载肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)基因的超声微泡造影剂逆转大鼠肝纤维化的可行性. 方法 将成模后的40只Wistar大鼠随机分为5组,即(1)超声+载基因超声微泡造影剂组(HGF+ US/MB),(2)超声+单纯质粒组(HGF+ US),(3)质粒+超声微泡造影剂组(HGF+MB),(4)单纯质粒组(HGF),(5)单纯模型组(MA).经股静脉注入超声微泡造影剂,同时超声基因转染治疗仪辐照肝区,辐照条件为300 kHz,2 W/cm2,辐照10 s,间隔10 s,共20 min.于超声辐照后14 d行磁共振弥散加权成像(diffusion weighted imaging,DWI)检查;然后处死各组大鼠,取肝组织HE染色,观察肝纤维化恢复情况;Western Blot检测HGF蛋白在大鼠肝脏中的表达. 结果 HGF+ US/MB组的表观弥散系数(apparent diffusion coefficient,ADC)值明显高于其他各组;相反地,指数表观弥散系数(exponential apparent diffusion coefficient,EADC)低于其他各组;病理组织片可见HGF+ US/MB组汇管区纤维结缔组织增生,但肝小叶结构完整,其余各组纤维组织增生程度强于HGF+US/MB组.同时,HGF+US/MB组的HGF蛋白的表达均高于其他各组(P＜0.05). 结论 超声靶向破坏微泡能够介导HGF基因在肝组织内高效表达,并产生抗纤维化效应,为肝纤维化的基因治疗提供一种新的基因转移途径.     

赖氨大黄酸对胆汁淤积性肝纤维化大鼠Smad2、Smad3表达的影响

目的探讨赖氨大黄酸(RHL)对胆汁淤积性肝纤维化模型大鼠Smad2、Smad3表达的影响。方法采用胆总管结扎(BDL)的手术方法建立大鼠胆汁淤积性肝纤维化模型,将大鼠随机分为5组:对照组、模型组、赖氨酸组、低剂量RHL组[35mg/(kg·d)]、高剂量RHL组[70mg/(kg·d)]。应用实时荧光定量PCR的方法检测大鼠肝脏组织中Smad2、Smad3mRNA的相对表达量。Western blot的方法检测Smad2、Smad3蛋白时相对表达量的变化。结果与模型组大鼠比较,经RHL治疗后胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝脏组织中Smad2、Smad3mRNA相对表达量降低,差异有统计学意义(P0.05);与模型组大鼠相比,经RHL治疗后胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝脏组织中Smad2、Smad3蛋白的相对表达量降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论 RHL能够抑制肝纤维化的发展,可能是通过抑制Smad2、Smad3mRNA和蛋白的表达,阻断TGF-β1/Smads信号传导通路实现的。     

HGF诱导脐带间充质干细胞通过TGF-β/Smad通路改善大鼠脂肪肝炎合并肝纤维化的作用机制

【目的】探讨肝细胞生长因子(HGF)诱导脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)通过转化生长因子β(TGF-β)/Smad通路改善大鼠脂肪肝炎合并肝纤维化的作用机制。【方法】取SPF级Wistar大鼠随机分为正常对照组、实验模型组(模型空白组、模型治疗1组和模型治疗2组)。实验模型组大鼠给予高脂饲料喂养联合皮下注射40%四氯化碳(CCl4)橄榄油溶液;正常对照大鼠予普通饲料喂养及皮下注射橄榄油溶液,建模6周后正常对照组与模型空白组予尾静脉注射PBS缓冲液;模型治疗1组予hUC-MSCs注射;模型治疗2组予含HGF的hUC-MSCs注射,观察3周后,所有大鼠采血检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)水平,然后处死,称量体重、肝湿重,计算肝指数;留取肝脏组织进行HE、Masson染色评估肝脏组织病理情况,观察肝脏损伤及肝纤维化情况;采用免疫组化方法检测肝脏组织中的TGF-β1、Smad3的表达水平。【结果】与模型空白组相比,正常对照组、模型治疗1组、模型治疗2组中大鼠肝湿重、肝指数及ALT、AST水平均显著下调;ALB水平显著上升,差异有统计学意义(P<0.05)。模型空白组可见明显大泡性脂肪变性,伴有明显的肝纤维化,甚至形成不具正常结构的假小叶;模型治疗两组肝纤维化程度、脂肪细胞数量较模型空白组显著减轻,且模型治疗2组的脂肪变性及肝纤维化程度较模型治疗1组稍有减轻。与模型空白组大鼠相比,正常对照组、模型治疗1组、模型治疗2组中大鼠的TGF-β1、Smad3表达水平均显著下调,差异有统计学意义(P<0.05)。【结论】hUC-MSCs治疗脂肪肝炎合并肝纤维化大鼠有一定的作用,HGF诱导的hUC-MSCs作用效果优于hUC-MSCs,其作用机制可能与抑制TGF-β/Smad信号通路有关。     

外源性硫化氢对大鼠肝纤维化胶原合成和凋亡调节蛋白Bcl-2及Bax表达的影响

目的探讨外源性硫化氢(H2S)对四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化大鼠的胶原合成和凋亡调节蛋白Bcl-2及Bax的影响。方法将80只SD大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、低剂量硫氢化钠(NaHS)组和高剂量NaHS组。处死大鼠后用HE染色及Van Gieson染色观察胶原合成、肝纤维化程度并分级,TUNEL染色了解肝细胞凋亡并以免疫组化法检测细胞凋亡指标Bcl-2及Bax。结果模型对照组大鼠肝胶原合成活跃,肝纤维化程度均达到Ⅲ^Ⅳ期,Bax在第6周末表达达最高峰,而Bcl-2则在第8周末表达达高峰,高剂量和低剂量NaHS组肝胶原合成减少,且肝纤维化程度明显减轻,多处于ⅠⅣ期,Bax在第6周末表达达最高峰,而Bcl-2则在第8周末表达达高峰,高剂量和低剂量NaHS组肝胶原合成减少,且肝纤维化程度明显减轻,多处于Ⅰ^Ⅱ期(P<0.01),肝细胞凋亡减少,Bcl-2及Bax的表达下降,与模型对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01);并且各指标在高剂量NaHS组与低剂量NaHS组比较差异亦有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。此外,至第8周末,高剂量NaHS组部分指标已接近正常。结论外源性H2S可以减少CCl4诱导的大鼠肝纤维化胶原合成,减轻肝纤维化程度,下调凋亡调节蛋白Bcl-2及Bax的表达,发挥重要的抗大鼠肝纤维化作用,且与剂量呈正相关。     

虎杖对急性肺损伤大鼠肺组织AQP-1 mRNA表达的影响

目的：探讨中药虎杖对急性肺损伤大鼠肺组织AQP-1 mRNA表达的影响。方法将60只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组,模型组,虎杖低、中、高剂量组、强的松对照组,每组10只。造模并以虎杖煎剂治疗后,使用荧光定量RT-PCR法测定大鼠肺组织AQP-1mRNA的表达。结果 AQP-1 mRNA表达：虎杖高剂量组为（4.332±0.221）,虎杖中剂量组为（7.727±0.527）,与模型组比较均明显增高,差异均有统计学意义（P〈0.05）。虎杖低剂量组与模型组比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论虎杖可能是通过促进肺组织AQP-1 mRNA的表达,改善肺组织正常水液代谢功能,从而起到对急性肺损伤大鼠的治疗作用。     

激动素(Kinetin)对四氯化碳肝纤维化大鼠疗效的研究

目的观察Kinetin对四氯化碳大鼠肝纤维化作用的影响.方法用四氯化碳、猪油拌玉米粉、酒精诱导大鼠肝纤维化模型.6周后对肝纤维化大鼠给予3种不同剂量的激动素进行治疗,并与模型对照组和干扰素α-2b治疗组比较,观察各组肝脏炎症活动度、肝纤维化计分和胶原纤维体视学的变化.结果各Kinetin治疗组与同期模型对照组肝脏炎症活动度、纤维化计分和胶原纤维体视学比较均明显减少(P＜0.05),与同期干扰素α-2b治疗组比较无明显差异(P＞0.05).各Kinetin组随剂量增大存在明显显效关系.结论激动素能抑制四氯化碳肝纤维化大鼠肝内胶原纤维的形成,其抑制性作用与其剂量有关.     

镇肝熄风汤对SHR大鼠Ang Ⅱ 1型受体蛋白和mRNA表达的影响

目的研究不同剂量镇肝熄风汤对自发性高血压大鼠(SHR)腹主动脉血管组织中Ang Ⅱ 1型受体(AT1R)蛋白和Ang Ⅱ 1型受体(AT1R) mRNA表达的影响。方法 60只24周龄的SHR大鼠随机分为:模型组、镇肝熄风汤低剂量组、镇肝熄风汤中剂量组、镇肝熄风汤高剂量组、复方罗布麻组,每组12只; 12只24周龄的同源雄性魏-凯二氏大鼠(WKY)作为:正常对照组。每组灌胃给药45天后,Western Blotting检测方法,检测腹主动脉血管组织中AT1R蛋白表达;实时聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法,测定大鼠AT1R mRNA基因表达。结果与模型组比较,正常组、镇肝熄风汤中剂量、高剂量组和复发罗布麻组AT1R蛋白表达和AT1R mRNA表达明显降低(F=863. 465,P 0. 01)。结论镇肝熄风汤可以调低SHR大鼠腹主动脉血管组织中AT1R蛋白表达和AT1R mRNA表达,减少SHR大鼠的血管收缩能力,起到有效降低SHR大鼠血压作用。     

超声辐照携TIMP-1siRNA微泡对大鼠肝纤维化的影响

目的 探讨携TIMP-1 siRNA的造影剂微泡在超声辐照条件下对肝纤维化大鼠组织学改变的影响。方法二甲基亚硝胺建立肝纤维化模型，6周后分组并静脉质粒注射，2天后观察肝、肾、肺、脑、心肌组织内基因荧光表达；12天后检测肝组织内TIMP-1 mRNA、蛋白表达及胶原纤维变化。结果2天后，超声照射微泡组基因荧光表达明显增强，较其他组织差异显著，P〈0．001；12天后，其TIMP-1 mRNA及蛋白表达、胶原含量均较单质粒组及对照组减低，P〈0．001。结论超声辐照携TIMP-1 siRNA超声微泡有将目的基因定位释放作用，TIMP-1 siRNA转染肝纤维化大鼠可改善肝纤维化结构，为肝纤维化的基因治疗提供了新的思路及方法。     

吲哚氰绿排泄试验与参与肝纤维化的细胞因子-TGF-β1mRNA的相关性研究

目的探讨吲哚氰绿(ICG)排泄试验与参与肝纤维化的细胞因子-TGFβ1mRNA表达相关性,验证ICG排泄试验可以作为诊断早期肝纤维化的一个敏感指标。方法 42只清洁级Wistar大鼠随机分为正常组(N组)和CCl4组(C组)。C组通过CCl4皮下注射造模,于造模后第2、4、6、8周分别测定ICG15分钟潴留率,用半定量RT-PCR法检测大鼠肝组织TGF-β1mRNA表达。结果成功建立肝纤维化模型,准确测定ICG15分钟潴留率。TGF-β1 mRNA量:正常组、第2、4、6、8周组间TGF-β1mRNA量差异具有显著性(P0.01);与正常组相比,第4、6、8周组TGF-β1mRNA量差异具有显著性(P0.01);第2周组TGF-β1mRNA量差异具有显著性(P0.05),余各组间差异均具有显著性(P0.01)。结论 ICG排泄试验与肝纤维化的细胞因子-TGF-β1mRNA表达具有良好相关性,该试验可以作为诊断早期肝纤维化的敏感指标。     

超声造影剂及超声辐照对TIMP-1 siRNA在肝纤维化大鼠肝组织中表达的影响

目的观测超声造影剂及超声辐照对TIMP-1 siRNA质粒转染肝纤维化大鼠肝组织内TIMP-1基因表达的影响。 方法采用二甲基亚硝胺（DMN）方法建立大鼠肝纤维化模型，72只造模大鼠在第6周随机均分成3组，质粒组（P组）、质粒＋造影剂及超声照射组（P＋U组）、对照组。2d、6d及12d后各组分别随机取8只处死、取肝、肾、肺、脑、心肌组织快速冷冻切片，荧光显微镜下观察各组织内TIMP-1 siRNA荧光表达；FQ—PCR测定肝组织TIMP-1 mRNA表达。 结果2d后，P组肝、肾、肺、脑、心肌组织内均有少量TIMP-1 siRNA绿色荧光表达，组间无显著差异，P＞0．05；P＋U组肝组织内TIMP-1 siRNA荧光表达明显增强，较其它组织差异显著，P＜0．001。P组及P＋U组肝组织TIMP-1 mRNA表达量均较对照组明显降低，P＜0．001；P＋U组降低较P组显著，P＜0．001；P＋U组6d时TIMP-1 mRNA表达量最低，后依次为48h、12d。 结论TIMP-1 siRNA对肝纤维化大鼠TIMP-1基因表达抑制作用明显；超声造影剂及超声辐照能够明显增高基因转染效率，并有将基因载体靶向定位于肝组织释放的作用。     

骨髓间充质干细胞移植对百草枯中毒导致肺纤维化的影响

目的 观察外源性骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对大鼠急性PQ中毒导致的肺纤维化是否产生治疗作用及其可能的机制.方法 取54只SD雄性大鼠,随机(随机数字法)分成3组:A组为空白对照组,B组为PQ+ PBS组,C组为PQ+BMSCs组.其中B组、C组均以120mg/kg的PQ溶液予以一次性灌胃染毒,染毒后6hC组大鼠予以尾静脉注入BMSCs 1×106个/mL,而B组大鼠则予以注入相应剂量的PBS.观察各组大鼠的一般情况,于染毒后7d、14 d、28 d处死未死亡的大鼠,取左下肺组织,行HE和Masson染色观察各组肺组织的病理改变情况,根据Szapiel肺泡炎和肺纤维化的分级法进行肺纤维化评分,并行免疫组织化学检测肺组织中TGF-β1及HGF的表达情况;取右下肺,检测HYP对比各组肺组织中的HYP含量的变化情况.结果 肺组织病理改变:染毒7d后可见B组肺泡炎性改变明显,肺泡腔内可见大量渗出液;C组的肺泡炎性渗出相对B组为轻.14 d可见B组肺泡间质水肿及渗出减轻,但肺间质胶原纤维增多;C组间质纤维化沉积程度相对B组较轻.28 d时B组肺间隔增厚普遍可见胶原纤维沉积,肺泡扩张明显,肺泡间隔断裂,肺泡结构紊乱;C组间隔中的胶原纤维化较B组轻,肺泡基本结构仍可见.HYP含量:B组大鼠肺组织HYP含量随着染毒时间的延长呈进行性增加,28 d时达最高峰,各时间点与A组比较均增高(P＜0.01);C组HYP的含量随时间的延长呈进行性增加,28 d达到最高峰,各时间点均较B组减少(P＜0.01).肺组织TGF-β1及HGF的表达:B组大鼠肺组织TGF-β1表达含量增多且分布范围较A组广,TGF-β1的表达在7d为最高峰,此后逐渐减少,但各时间点均高于A组(P＜0.05);C组大鼠肺组织各时间点TGF-β1表达含量均较B组少(P＜0.05).B组肺组织HGF的表达随着时间点延长逐渐增多,但各时间点比较差异无统计学意义(P＞0.05);B组与A组比较略有增多,但差异无统计学意义(P＞0.05);C组肺组织HGF表达含量随着时间的延长逐渐增多,各时间点比较差异有统计学意义(P＜0.05),各时间点与A组及B组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 外源性BMSCs移植对PQ诱导的肺纤维化程度有一定的抑制作用,可能与其上调HGF表达、下调TGF-β1的表达有关.     

急性肺损伤大鼠肺组织肝脏X受体α表达的研究

目的 观察内毒素性急性肺损伤(ALI)大鼠肝脏X受体α(LXRα)的改变,探讨LXRα在ALI发病中的作用机制.方法 将48只Wistar大鼠随机均分为两组.采用尾静脉注射脂多糖(LPS)5 mg/kg复制大鼠ALI模型,对照组静脉注射生理盐水2.5 ml/kg.于致伤后1、2、4和8 h取大鼠动脉血进行血气分析及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平检测;取肺测定肺湿/干重(W/D)比值、髓过氧化物酶(MPO)活性及肺组织病理学改变;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺组织LXRα mRNA、TNF-α mRNA表达;用酶联免疫吸附法(ELISA)检测TNF-α含量变化;用免疫组化法观察肺组织LXRα蛋白表达情况.结果 与对照组比较,ALI组致伤后各时间点动脉血氧分压(PaO2)均显著降低,肺W/D比值、MPO活性均显著升高(P均<0.05);病理观察显示肺组织受损;肺组织LXRα mRNA表达下降,TNF-α mRNA表达升高(p均<0.05),肺组织匀浆和动脉血清中TNF-α亦显著升高,4 h达高峰.免疫组化显示对照组肺组织表达较高水平LXRα蛋白,ALI组在LPS致伤后可见LXRα蛋白表达较对照组显著下降(P均<0.05).结论 正常大鼠肺组织可表达LXRα,LPS可引起ALI大鼠肺组织LXRα的基因和蛋白表达下降,这可能与ALI发病有关.     

异氟烷干预下人羊膜间充质干细胞移植对大鼠脑梗死的影响

目的:观察人羊膜间充质干细胞(AM-MSCs)移植同时予以异氟烷治疗对脑梗死大鼠神经功能恢复的影响。方法:大鼠100只,采用线栓法建立大脑中动脉阻塞脑梗死模型,随机分成假手术组、脑梗死组、AMMSCs移植组、异氟烷组、(AM-MSCs+异氟烷)组,造模后6 h给予相应治疗。移植后7 d各组随机处死6只,采用RT-PCR、Western Blot检测脑组织中GAP-43、AQP4 mRNA和蛋白表达的变化。移植后24 h、3 d及造模后1、2、3、4周行动物神经功能缺损(NSS)评分,在移植后21~28 d进行Morris水迷宫试验。4周后处死行免疫组化、HE染色观察病理学变化。结果:移植后7 d,(AM-MSCs+异氟烷)组大鼠脑组织中GAP-43mRNA和蛋白表达高于脑梗死组、AM-MSCs组、异氟烷组(P0.05);异氟烷组和AM-MSCs组的大鼠脑组织中GAP-43 mRNA和蛋白表达水平高于脑梗死组(P0.05)。(AM-MSCs+异氟烷)组的AQP4 mRNA和蛋白表达低于其他各组(P0.05);AM-MSCs组和异氟烷组低于脑梗死组(P0.05)。移植后1周,(AM-MSCs+异氟烷)组的NSS评分低于异氟烷组、AM-MSCs移植组,异氟烷组、AM-MSCs移植组低于脑梗死组(P0.05)。移植后3~5 d,(AM-MSCs+异氟烷)组平均逃逸潜伏期较异氟烷组、AM-MSCs组、脑梗死组缩短(P0.05或P0.01)。(AM-MSCs+异氟烷)组的目标距离百分比高于异氟烷组和AM-MSCs组(P0.05),并高于脑梗死组(P0.01)。伤后4周,脑梗死组未见神经轴索通过,异氟烷组、AM-MSCs移植组可见少量神经轴索样结构,(AM-MSCs+异氟烷)组可见较多神经轴索样结构(P0.05)。CM-Dil的阳性细胞数(AM-MSCs+异氟烷)组高于AM-MSCs组,异氟烷组高于脑梗死组,假手术组最少(P0.05)。结论:异氟烷干预联合AMMSCs移植治疗大鼠脑梗死可明显改善大鼠的神经学功能。     

脓毒症大鼠肺基质金属蛋白酶-2/9表达与血必净干预

目的 观察创伤弧菌脓毒症大鼠肺基质金属蛋白酶(MMP)-2/9和组织型金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-1/2的动态表达及血必净干预.方法 温州医学院生命科学院实验室,清洁级SD大鼠110只,随机(随机数字法)分为正常对照组(A组,n=10)、创伤弧菌脓毒症组(B组,n=50,采用大鼠左下肢皮下注射创伤弧菌悬液制作创伤弧菌脓毒症大鼠模型)及血必净干预组(C组,n=50,感染后0.5 h腹腔注射血必净4 mL/kg).B、C组大鼠于染菌后1,6,12,24,48 h麻醉后活杀,留取右肺标本.观察大鼠行为学变化,采用考马斯亮蓝法测肺通透性,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法测肺MMP-2/9,TIMP-1/2 mRNA的表达,免疫组化法和双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测肺MMP-2/9和TIMP-1/2的表达.数据采用单因素方差分析,并用LSD-t法进行组间两两比较,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 B组和C组肺通透性显著高于A组,C组显著低于B组.B组和C组MMP-2/9,TIMP-1/2mRNA显著升高,B组分别于6 h(0.344±0.108),6 h(1.230±0.377),12 h(0.523±0.098),12 h(0.280±0.070)达高峰(P＜0.05),C组分别于12 h(0.256±0.074),6 h(0.968±0.225),12 h(0.746±0.316),12 h(0.356±0.035)达高峰(P＜0.05),C组MMP-2/9mRNA升高趋势显著低于B组(P＜0.05),TIMP-1/2mRNA显著高于B组(P＜0.05).B组和C组MMP-2/9,TIMP-1/2蛋白也升高,B组分别于12 h(0.692±0.191),12 h(0.061±0.017),24 h(1384.42±91),24 h(41.04±3.60)达高峰(P＜0.05);C组分别于24 h(0.217±0.065),12 h(0.045±0.013),24 h(1617.22±103),24 h(47.66±3.58)达高峰(P＜0.05);C组MMP-2/9蛋白升高趋势低于B组(P＜0.05),TIMP-1/2蛋白早期与B组差别不大,后期显著高于B组(P＜0.05).结论 MMP/TIMP比例失衡是创伤弧菌脓毒症大鼠肺损伤机制之一,血必净可促进MMP/TIMP比例恢复平衡,对创伤弧菌脓毒症大鼠肺损伤具有保护作用.

Abstract：

Objective To detect the expression of MMP-2/9 and TIMP-1/2 in the lung of Vibrio vulnificus sepsis rats and observe the intervention of Xuebijing injection. Method One hundred and ten SD rats of clean grade were randomly(random number) divided into normal control group (group A, n = 10),Vibrio vulnificus sepsis group (group B, n = 50. Sepsis was reproduced in rats with subcutaneous injection in left lower limb with Vibrio vulnificus) and Xuebijin intervention group ( group C, n = 50. Rats were intraperitoneal(ip) with the dose of Xuebijing 4mL/kg at the time of 30 min later after infection). The rats in group B and C were sacrificed at 1 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h after infection, the expression of MMP-2/9 and TIMP-1/2 were examined by PCR, Immunohistochemistry or ELISA methods, the lung permeability were measured by Coomassie Brilliant Blue method. Experimental data used single factor analysis of variance, and between groups by LSD method for pairwise comparison,P ＜0.05 statistically significant difference. Results The lung permeability increased both in group B and C compared with group A,and in group B were relatively higher. The lung MMP-2/9, TIMP-1/2mRNA expression in groups B and C compared with in group A was markedly higher, and reached the peak at 6 h(0. 344 ± 0. 108 ),6 h ( 1. 230 ± 0.377 ), 12 h (0.523 ±0.098),12 h(0.280±0.070) (P＜0.05) in group B while at 12 h(0.256 ±0.074),6 h(0.968±0.225) ,12 h(0.746 ±0. 316) ,12 h(0.356 ±0.035) (P ＜0. 05) in group C; the MMP-2/9mRNA expression in group C decreased(P＜0. 05) compared with the group B while the TIMP-1/2mRNA expression increased(P＜0. 05). The lung MMP-2/9, TIMP-1/2 protein expression in groups B and C compared with the group A(0.345±0.109) also increased, and the peak was at 12 h (0. 692 ± 0. 191 ), 12 h (0. 061 ±0.017) ,24 h(1384.42 ±91) ,24 h(41.04 ±3.60)in group B while at 24 h(0. 217 ±0.065) ,12 h(0. 045± 0. 013 ) ,24 h ( 1617.22 ± 103 ) ,24 h (47.66 ± 3.58 )in group C, the MMP-2/9 protein expression in group C was lower than in group B(P＜0.05), the TIMP-1/2 protein expression in group C was similar to in group B early while marked increased(P＜0.05)later. Conclusions MMP/TIMP imbalance was one of the mechanisms of the lung injury in the rats with Vibrio vulnificus sepsis, Xuebijing could restore the balance of MMP/TIMP ratio.     

黄芪、大黄复方制剂对培养大鼠系膜细胞增殖和细胞外基质分泌的影响

背景:糖尿病肾病是糖尿病最严重的血管并发症之一。中药制剂黄芪、大黄组成复方在临床用于防治糖尿病肾病多年,具有确切的保护糖尿病患者肾脏的作用,但其作用机制需观察探讨。目的:观察以黄芪、大黄复方组成的中药制剂肾康丸对高糖培养大鼠系膜细胞增殖及细胞外基质分泌的影响。设计:随机对照观察。单位:南方医科大学珠江医院中西医结合肾病中心和南方医科大学南方医院药局。材料:血清药理学实验于2005-04在南方医科大学实验动物研究中心完成。细胞培养实验于2005-04/07在南方医科大学细胞培养室完成。选择健康雄性Wistar大鼠16只,体质量190～220g。方法:16只大鼠随机分为4组,正常血清组、开搏通组、肾康丸大小剂量组(肾康丸主要由黄芪、大黄、水蛭、芡实、玉米须等组成,由南方医科大学珠江医院药剂科生产,制剂号20031214)。①开搏通及肾康丸高低组分别按5mg/kg,2.4g/kg和1.2g/kg体质量灌服相应药物混悬液。正常血清组灌服等容积生理盐水。连续灌胃7d,麻醉,分离药物血清。②体外培养大鼠系膜细胞,用不同浓度葡萄糖(10,20,30和40mmol/L)分别刺激24,48,72和96h后,四甲基偶氮唑盐法测增殖。③培养的系膜细胞随机分为6组,低糖组(10mmol/L),高糖组(30mmol/L),正常血清组(30mmol/L葡萄糖),开搏通(50g/L开搏通药物血清)组(30mmol/L葡萄糖)及肾康丸高低高糖(30mmol/L葡萄糖)。培养72h后,采用四甲基偶氮唑盐法测定各组细胞增殖,酶联免疫法测系膜细胞分泌纤连蛋白水平,反转录-聚合酶链反应法测系膜细胞重纤连蛋白mRNA的表达。主要观察指标:①不同浓度葡萄糖对大鼠系膜细胞增殖的影响。②各组系膜细胞增殖及分泌纤连蛋白和纤连蛋白mRNA表达情况。结果:①不同浓度的葡萄糖对系膜细胞增殖的影响:与低糖组(10mmol/L)比较,20mmol/L葡萄糖在实验的96h里能促进系膜细胞增殖,但仅在72h和96h具有统计学意义(P<0.05)。30mmol/L葡萄糖在实验的24h至96h里均能显著促进系膜细胞增殖(P<0.05或P<0.01),72h内随着作用时间的延长,促进增殖作用越明显,72h后作用减弱,但仍有统计学意义;40mmol/L浓度的葡萄糖在48h内对系膜细胞增殖有促进作用(P<0.05),48h后作用减弱,甚至转为抑制。②药物血清对系膜细胞增殖的影响:高糖组吸光度值明显高于低糖组(P<0.01)。与高糖组比较,开搏通、肾康丸高低剂量组吸光度值均明显降低(P<0.01或P<0.05)。正常血清组与高糖组比较差异无显著性(P>0.05)。③药物血清对系膜细胞分泌纤连蛋白的影响:高糖组细胞上清中纤连蛋白含量显著高于低糖组(P<0.01)。与高糖组比较,开搏通及肾康丸高低剂量组纤连蛋白含量均显著降低(P<0.01或P<0.05),而正常血清组纤连蛋白含量变化无显著性差异(P>0.05)。④药物血清对系膜细胞中纤连蛋白mRNA表达的影响:高糖组纤连蛋白条带明显比低糖组明亮,且其与β-actin条带吸光度比值明显升高(P<0.01)。与高糖组比较,开搏通及肾康丸高低剂量组纤连蛋白条带亮度显著降低,与β-actin条带吸光度比值也显著减少(P<0.01),而正常血清组上述变化无显著性差异(P>0.05)。结论:高糖可以促进系膜细胞增殖,增加系膜细胞分泌纤连蛋白,提高系膜细胞中纤连蛋白mRNA的表达。肾康丸能明显抑制上述作用。肾康丸可以抑制高糖诱导的系膜细胞增殖及细胞外基质分泌。     

黄芪对内毒素性急性肺损伤大鼠肝细胞生长因子表达的影响

目的：探讨黄芪在急性肺损伤（ALI）时对肝细胞生长因子（HGF）表达的影响，评价黄芪在ALI中的治疗机制。方法：制备内毒素（LPS）性ALI模型。设正常对照组（生理盐水1ml／kg）、模型组（LPS5mg／kg）、黄芪治疗组（黄芪8mg／kg）。用逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）检测各组大鼠肺组织匀浆中HGFmRNA表达的变化；用免疫组化法检测各组大鼠肺组织中HGF阳性细胞数的变化。结果：RT—PCR检测结果显示，ALl时HGF mRNA表达明显增加（P〈0．05），黄芪能促使HGFmRNA表达进一步升高（P〈0．05）。免疫组化显示，ALI时HGF阳性细胞表达产物增加（P〈0．01），黄芪能促进HGF的表达（P〈0．05）。结论：黄芪通过促进HGF的表达来促进ALI的修复。