乙肝病毒X基因参与肝细胞脂肪变性的作用及机制的初步研究

目的 探讨沉默HBx基因对HepG2.2.15细胞脂质代谢相关基因表达的影响.方法 设立空白对照组(HepG2.2.15细胞)、阴性对照组(HepG2.2.15细胞转染阴性HK质粒)、shHBx转染组(HepG2.2.15细胞转染shHBx质粒)和HepG2组(HepG2细胞).构建针对HBx基因的shHBx质粒,转染...     

乙肝病毒X基因阻断降低肝癌细胞HepG2.215与纤维连接蛋白的黏附

目的探讨乙肝病毒X基因（HBX）在肝细胞癌（HCC）侵袭转移中的作用。方法利用psiRNA-hH1neo质粒,构建针对HBX的shRNA表达载体psiRNA1、psiRNA2、psiRNA3,转染肝癌细胞株HepG2.215,用荧光定量PCR仪检测siRNA对HBX mRNA表达的抑制作用,用Western blot法检测siRNA对HBX蛋白表达的抑制作用。以Transwell小室测定HepG2.215细胞与纤维连接蛋白（Fn）的体外黏附能力。结果成功构建shRNA表达载体,shRNA表达载体均可不同程度地抑制HBX的表达,其中psiRNA1对HBX的抑制作用最强,对HBX mRNA抑制率达80.27%,对HBX蛋白的抑制率为65.59%;细胞体外黏附能力受到明显抑制,在培养至48、72h后,对照组和转染组跨膜细胞数分别为442.6±57.1vs376.4±55.2和588.2±70.1vs513.6±68.5,两时相点均有明显差异（P〈0.05）。结论阻断HBX的表达可明显抑制肝癌细胞HepG2.215的体外侵袭性生长。     

乙肝病毒X基因与人肝细胞癌关系的研究

目的 探讨乙肝病毒（ＨＢＶ）Ｘ基因与肝癌发病的关系，为从分子水平上研究肝癌病因提供有关信息。方法 采用ＰＣＲ技术对ＨＢＶ不同状态的１０２例原发性肝细胞癌（ＰＨＣ）、３６例肝硬化（ＬＣ）及２８例慢性肝炎（ＣＨ）血清中ＨＢＶＸ基因进行了检测。结果 在ＨＢＶ５项标志均阴性的５３例ＰＨＣ检出Ｘ基因２０例（３７．７％），３１例ＬＣ中检出５例（１６．１％），１１例ＣＨ中检出２例（１８．２％）。所有ＨＢＶ Ｘ基     

乙肝病毒X蛋白在肝细胞癌发生、发展与侵袭转移中的作用

我国80%以上的肝细胞癌患者有乙肝病毒(hepatitis Bvirus,HBV)感染的背景,这是肝细胞癌和其他恶性肿瘤的显著区别之一。HBV和肝细胞癌发生及发展都有密切联系,HBV感染者发生肝细胞癌的概率大约是非感染者的100~400倍[1]。在HBV基因组中,X基因与肝细胞癌的关系最受瞩目。HBx蛋白在乙肝病毒感染者的肝脏中检出率可以达到86%~97%[2,3]。HBx是个多功能蛋白,作用非常广泛,包括激活宿主细胞和病毒自身基因的转录、调控凋亡、抑制细胞中受损DNA的修复以及激活信号转导通路等,本文主要阐述其和肝细胞癌发生、发展及侵袭转移的关系。1HBx蛋…     

乙肝病毒X蛋白与肝细胞肝癌

乙肝病毒（hepatitis B virus，rmv）慢性感染是肝细胞肝癌（hepatocelluar carcinoma，HCC）的重要原因之一。HBV慢性携带者发生肿瘤的相对危险性明显增加。现有研究表明：HBV诱导HCC的机制主要涉及HBVDNA与肝细胞基因组的整合以及乙肝病毒X蛋白的致癌作用。X蛋白是乙肝病毒X基因的表达产物，具有反式激活功能，可通过从转录水平激活细胞生长调节基因、对细胞调亡的调节、抑制受损DNA的修复等机制导致HCC的发生，X蛋白的这些作用通过其与细胞内其他蛋白质的相互作用以及激活细胞内的信号传导通路来实现。另外，HBV基因序列内的突变也可能在肝癌的发生中起重要作用。本文就近年来该方面的研究进展作一综述。     

巢式PCR在乙肝病毒X基因检测中的应用

目的:探讨巢式PCR方法在乙肝病毒X基因(HBV X)检测中的意义.方法:随机抽取中国医学科学院肿瘤医院1998年1月至2000年12月的8例HCC标本石蜡切片,提取组织DNA,应用巢式PCR法进行HBV X基因检测.结果:在8例标本中,7例在200 bp～300 bp处出现条带,大小符合引物设计HBV X基因,检出率为87.5%.结论:应用巢式PCR法进行HBV X基因检测具有方法简单、敏感性高等特点,可用于石蜡切片等少量标本的检测.     

巢式PCR在乙肝病毒X基因检测中的应用

目的 :探讨巢式PCR方法在乙肝病毒X基因 (HBVX)检测中的意义。方法 :随机抽取中国医学科学院肿瘤医院 1 998年 1月至 2 0 0 0年 1 2月的 8例HCC标本石蜡切片 ,提取组织DNA ,应用巢式PCR法进行HBVX基因检测。结果 :在 8例标本中 ,7例在 2 0 0bp～ 30 0bp处出现条带 ,大小符合引物设计HBVX基因 ,检出率为 87.5 %。结论 :应用巢式PCR法进行HBVX基因检测具有方法简单、敏感性高等特点 ,可用于石蜡切片等少量标本的检测。     

用精原细胞介导法制备乙肝病毒X基因转基因小鼠的实验研究

目的：探讨精原细胞介导法制备乙肝病毒X基因转基因小鼠的可行性。方法：构建乙肝病毒X基因表达载体pcDNA3-X;应用微量注射针将脂质体包裹的pcDNA3-X表达载体直接注入C57BL／6N雄性小鼠睾丸的曲细精管内，于第一次注射后6周，与雌鼠交配，用PCR法和免疫组化法检测仔鼠基因组中的外源DNA和肝组织中表达的pX蛋白。结果：测序结果与文献报道一致，并且X基因在Hela细胞中表达；共产仔鼠16只，其中1只为阳性仔鼠，阳性率为6．25％。结论：初步证明用精原干细胞介导法制备X基因转基因小鼠是可行的。     

环状RNA在乙肝病毒相关性肝细胞癌中的研究进展

肝癌是常见的恶性肿瘤之一,肝细胞癌是最常见的病理类型,在我国80％以上的肝癌患者合并了乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)感染.近年来研究发现,环状RNA(circular RNA,circRNA)作为非编码型 RNA(non-coding RNA,ncRNA)中的一员,其可由pre-mRNA反向剪接...     

血清乙肝病毒X基因的检测方法及意义

目的 探讨血清乙肝病毒（ＨＢＶ）Ｘ基因的检测方法及肝病患者Ｘ基因检测的意义。方法 通过ＰＣＲ扩增法探讨ＨＢＶ Ｘ基因的检测方法,对扩增产物的序列进行测序分析,并对３０例肝癌及３２例肝硬化患者血清ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ与Ｘ基因进行检测。结果经琼脂糖电泳与序列分析表明,扩增产物与Ｘ基因序列一致。血清学检测显示,２例肝癌与２例肝硬化患者血清中Ｘ基因检测阳性,但ＨＢｓＡｇ检测阴性。结论 应用ＰＣＲ法能在血清中扩增出完整Ｘ基因片段,为研究Ｘ基因的序列变化与肝癌发生的关系提供了一个有效途径。部分肝病患者血清ＨＢｓＡｇ阴性,但在血清中能检出Ｘ基因,提示肝组织中存在Ｘ基因整合。     

原发性肝癌患者及慢性乙肝病毒携带者肝组织中乙型肝炎病毒X基因的变异

目的:探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X基因及其变异与原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生、发展的关系。方法:采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,检测22例乙型肝炎表面抗原(hepatitis Bsurface antigen,HBsAg)阳性的HCC患者及15例慢性乙肝病毒携带者(chronic asymptomatic carrier,CAC)患者肝组织中HBVX基因,并对PCR产物进行基因测序,同时检测5例无HBV携带者正常肝脏组织中HBV X基因。结果:22例HCC患者癌组织及15例CAC患者肝组织中HBVX基因检出率分别为68.18%和46.67%,5例正常肝脏组织中均未检测到HBVX基因,差异有统计学意义(P<0.05)。肝癌组织及HBV携带者肝组织中HBV X基因检出率差异无统计学意义(P>0.05)。肝癌组织及携带者肝组织中HBV X基因发生1 762T/1 764A双突变率分别为93.33%和2/7,肝癌组织中双突变率高于携带者肝组织(P=0.004 3),未发现1 762T及1 764A单独发生突变。结论:HCC患者肝组织中HBV X基因检出率高,肝癌组织中发生1762T/1764A双突变的频率高,HBV X基因及1762T/1764A双突变与HCC的发生可能有重要关系。     

乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因融合表达蛋白对肝癌细胞端粒酶活性的影响

目的建立HBV X-HCV C融合蛋白细胞表达模型,并探讨其对细胞端粒酶活性的影响.方法双酶切质粒pXT1-X,得到完整的HBV X基因片段后,将其插入到质粒PBK-CMV和PBK-HCV C的相应酶切位点,得到重组质粒PBK-X和PBK-X-C;再将质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C分别导入肝癌细胞株HepG2中,G418筛选,RT-PCR、蛋白印迹鉴定HBV X和HCV C蛋白表达.PCR-ELISA法检测端粒酶活性.结果质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C在HepG2细胞中有稳定表达.表达融合蛋白的细胞的端粒酶活性较转染空载体的细胞及单独表达HBV X、HCV C蛋白的细胞明显升高.结论HBV X-HCV C融合蛋白能显著上调端粒酶活性,提示HBV、HCV可能具有协同致癌作用.     

乙型肝炎病毒X基因变异和慢性乙型肝炎患者临床与组织病理学指标的相关性

 目的 探讨慢性乙型肝炎患者肝组织内乙型肝炎病毒（HBV）X基因部分区段的变异与HBV相关各临床与组织病理学指标的关系。方法 以83例慢性乙型肝炎肝穿刺活检标本作为研究对象,20例HBV相关性肝细胞癌作为对照;HBV X基因变异的研究采用PCR扩增和直接双向测序。免疫组化二步法显示肝组织内四种病毒蛋白的表达;荧光实时定量PCR检测肝组织内HBV DNA含量。结果 HBV X基因nt1583～1793区段错义突变主要出现在对应的X蛋白aa87（nt1632、1633）、88（nt1635、1636）、116（nt1719）、118（nt1726、1727）、119（nt1730）、127（nt1752）、130（nt1762）和131（nt1764）位氨基酸。nt1725～1730（aa118/119）突变与肝组织内HBcAg显著低表达（P=0.006）,和HBV DNA低拷贝数（P=0.004）明显相关,尤以ACTGAC（TD）型突变最为明显;相反,nt1762/1764（aa130/131）位点突变则伴肝组织内HBcAg显著高表达（P=0.005）和高水平的HBV DNA含量（P=0.006）。同时,肝癌组中nt1725～1730 野生型所占比率明显高于慢性肝炎（P<0.05）,而nt1762/1764 突变型所占比率肝癌组与肝炎组相比显著增高（P<0.01）。结论 肝组织内,在nt1725～1730突变能显著降低HBcAg 的表达和HBV DNA水平,nt1762/1764突变则相反。肝组织内HBV的高负载可能与肝细胞癌的发生有关     

乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因融合表达蛋白对肝癌细胞胰岛素样生长因子1受体表达的影响

目的 建立HBV X-HCV C融合蛋白细胞表达模型,并探讨其对细胞胰岛素样生长因子-1的影响.方法 双酶切质粒pXT1 -X,得到完整的HBV X基因片段后,将其插入到质粒PBK-CMV和PBK-HCV C的相应酶切位点,得到重组质粒PBK-X和PBK-X-C;再将质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C分别导入肝癌细胞株HepG2中,G418筛选,RT-PCR、蛋白印迹鉴定HBV X和HCV C蛋白表达.流式细胞仪、蛋白印迹检测IGF-1受体蛋白表达.结果 质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C在HepG2细胞中有稳定表达.表达融合蛋白的细胞的胰岛素样生长因子-1受体活性较转染空载体的细胞及单独表达HBV X、HCV C蛋白的细胞明显升高.结论 HBV X-HCV C融合蛋白能显著上调胰岛素样生长因子-1受体活性,提示HBV、HCV可能具有协同致癌作用.     

Specific anti-viral effects of RNA interference on replication and expression of hepatitis B virus in mice

HHepeaptaitdisan Bv ivriidruase.is HthBeV p riontofetcyptieon m eism obnere o off t hthee fa mmoilsytcommon and severe viral infections because infectedindividuals are at high risk of developing liver cirrhosis,and eventually,hepatocellular carcinoma.While aneffective vaccine is available,present treatment regimentsfor hepatitis B are costly and often have limit of effects.Only about one-third of patients treated with alphainterferon show a sustained response.Nucleosideanalogues do not elimi…     

Expression of cytokines in mouse hepatitis B virus X gene-transfected model

The expression profile in the mouse hepatitis B virus X (HBx)-transfected model was investigated in order to lay a foundation for further study on the implication of cytokines expression in hepatitis B virus (HBV) infection.Hydrodynamic injection method via the tail vein was used to establish the animal HBx-transfected model.By using microassay,the differential expression of gene in each group was analyzed,which was further confirmed by using real-time PCR and semi-quantitative PCR.Most of chemokine genes such as Ccl2,Ccl5,Ccl9,MIG and IP-10 were up-regulated in the HBx-transfected mouse model versus the control mice,which was coincided with the microarray results.Western blotting and immunohistochemistry were applied to detect the expression of MIG and IP-10 in the liver tissues.Simultaneously,ELISA was adopted to measure the content of IFN-γ in the liver tissues.DNA microassay revealed that the expression of 611 genes changed in HBx-transfected mice as compared with that in pCMV-tag2B-transfected mice,and most of the screened chemokines were up-regulated (including MIG and IP-10).Additionally,IFN-γ protein levels were increased by 20.7% (P<0.05) in pCMV-tag2B-HBx-transfected mice as compared with the untreated mice.IFN-γ protein levels were reduced by 53.9% (P<0.05) in pCMV-tag2B-transfected mice as compared with the untreated mice,which was consistent with the up-regulation of MIG and IP-10.It was suggested HBx transfection could induce the expression of MIG and IP-10 in the liver tissues,which might play the roles in HBV-related liver immunity and cytokines-mediated antiviral effect.     

乙型肝炎病毒X基因的克隆与鉴定

目的 构建乙型肝炎病毒X基因原核表达质粒pQE30-HBx,以进一步研究其基因产物的功能及致病机制.方法 以肝炎患者血清DNA为模板,用PCR方法扩增乙型肝炎病毒X基因,构建乙型肝炎病毒X基因原核表达质粒pQE30-HBx,经酶切电泳验证重组质粒的正确性,并对X基因进行测序鉴定.结果 PCR结果显示,扩增片断大小约465 bp,与预期相同.重组质粒经酶切电泳判断有目的片段插入,方向正确,经测序证实插入片段是乙型肝炎病毒X基因,编码框无误.结论 成功构建乙型肝炎病毒X基因重组质粒pQE30-HBx.     

乙型肝炎病毒X基因区序列的系统发育树分析

目的:研究利用乙型肝炎病毒X基因区序列构建系统发育树进行基因型分析的可靠性。方法:从美国NCBI基因库中下载HBV全基因序列共2 49条,其中166条为已知基因型的序列,83条为未知型序列。利用ClustalX 1.8软件和TreeView软件对已知基因型的X区序列构建进化树图,分析由该方法获得的基因型是否与原来的吻合,并对未知型序列进行基因型分析,再用S区的进化树分析加以验证。结果:已明确基因型的166条序列利用X基因区序列分析得到的基因型与原先的基因型完全吻合。用X区和S区序列分析方法对83条未知型序列分析的结果是一致的,分别获得A型16条、B型17条、C型2 7条、D型2 1条及F型2条,未发现E、G和H型。结论:利用乙型肝炎病毒X基因区序列进行基因型分析是完全可靠的,有助于HBV的致病机制研究。     

小干扰RNA(siRNA)对小鼠乙型肝炎病毒复制和表达影响的实验研究

目的建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,并在此基础上观察小干扰RNA(siRNA)对小鼠乙型肝炎病毒复制和表达的影响。方法用水动力学方法,向小鼠尾静脉注射1.5倍的HBV真核表达质粒pHBV1.5建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染模型,明确感染后,再将其与针对乙型肝炎病毒核心区的siRNA表达载体(psiHBV4)共注射,于注射后第6天取血测血清HBsAg,HBeAg(MEIA),通过RT-PCR检测肝组织HBVC区mRNA转录子的水平。同时设立PBS对照组,空载体对照组和无关干扰对照组。结果注射后第6天血清中HBsAg,HBeAg在pHBV1.5感染组中高表达。psiHBV4干扰组中HBeAg的表达受到了明显的抑制,与感染组比较差异有显著性(P<0.01),RT-PCR显示肝内HBVCmRNA水平亦明显降低。而无关干扰对照组则无相应的干扰作用。结论RNAi能特异,高效的抑制小鼠体内HBV的复制和表达,同时通过水动力学方法,成功建立了小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,为进一步研究乙型肝炎病毒奠定了基础。