鼠内皮抑素基因腺病毒载体的构建及对血管内皮细胞的生长抑制

构建含鼠内皮抑素基因的腺病毒载体（pAd／mEnd），并观察内皮抑素蛋白对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）的生长抑制、细胞周期和凋亡的影响。结果发现pAd／mEnd感染BEL7402细胞后，能有效表达内皮抑素蛋白，显著抑制HUVEC增殖，阻滞HUVEC细胞S期，凋亡指数显著增加。     

人IL-2重组腺病毒转染人肺腺癌细胞的体外生物学特性及体内抗肿瘤研究

目的 :研究感染hIL 2重组病毒的人肺腺癌细胞 (Anip973)的体外生物学特性及小鼠体内抗肿瘤作用。方法 :将携带有hIL 2基因的重组腺病毒 (rAd hIL 2 )感染人肺腺癌细胞系 ,通过细胞生长实验、克隆形成实验等观察其对Anip973肿瘤细胞的作用 ;利用PCR技术对转染后的细胞进行检测并应用ELISA试剂盒检测转染后的细胞IL 2的分泌量 ;通过肿瘤局部注射rAd hIL 2的方法观察其在小鼠体内的抗肿瘤作用。结果 :rAd hIL 2经扩增、纯化后 ,滴度可达 10 1 0 PFU ml,当病毒量为30MOI时 ,对Anip973细胞的转染率达 90 %以上。转染的Anip973肿瘤细胞其生长能力、克隆形成率等无明显变化。 2 4小时细胞培养上清IL 2的分泌量为 2 0pg 1ml 2× 10 5细胞。体内实验表明注射rAd hIL 2的小鼠肿瘤生长缓慢 ,体积明显小于对照组 (P <0 0 5 ) ,生存期显著延长。结论 :腺病毒介导的细胞因子基因hIL 2转染的Anip973肿瘤细胞体外生物学特性未见明显变化 ,而体内实验则有明显的抗肿瘤作用。     

人血管抑素K1-5重组腺病毒载体的构建

血管抑素K1 5是目前被认为最强的抑制血管生成的因子之一 ,研究表明其能明显抑制血管内皮细胞增生及牵移。我们采用腺病毒作为载体 ,成功构建了携带血管抑素K1 5基因的腺病毒 ,为下一步进行体内外实验奠定了基础。材料和方法 :试剂质粒pUC19及pCA13均购自加拿大MicrobixBiosystems公司 ,Trizol试剂盒及逆转录试剂盒购自美国Invitrogen公司 ,内切酶及LipofectAmine 2 0 0 0试剂盒购自美国GibcoBRL公司 ,PCR产物回收试剂盒、质粒DNA制备试剂盒和病毒DNA提取试剂盒均购自德国Qiagen公司 ,2 93细胞购自MicrobixBiosystems公司 ,正常…     

人内皮抑素克隆表达及对血管内皮细胞生长的抑制 …

目的 获得具有抑制血管内皮细胞生长活性的重组人内皮抑素（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）。方法 从肝细胞中分离总ＲＮＡ,经反转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）得到ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ全基因。用原核细胞表达载体构建了ｐＢＶ２２０／ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ重组质粒,经ＤＮＡ测序确认后,将其转化大肠杆菌ＤＨ５α进行表达、初步纯化及活性测定。结果 经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,表达产物相对分     

荷人鼻咽癌裸鼠血血管内皮生长因子和内皮抑素的研究

目的：探讨不同病期荷人鼻咽癌裸鼠血血管内皮生长因子（VEGF）以及VEGF与内皮抑素（ES）比值的变化，以及它们与肿瘤发展的关系。方法：采用BALB/c裸小鼠复制荷人鼻咽癌裸鼠模型，通过ELISA方法和EIA方法分别测定不同病期荷人鼻咽癌裸鼠血VEGF和ES的浓度，并计算二者的比值。结果：发现荷瘤鼠血中VEGF含量在种瘤5 d组[(81.79±13.20) μg/L]或10d组[(87.78±2.76) μg/L]与正常裸鼠[(82.06±9.78) μg/L]比较未见明显差异（P>0.05），而种瘤20 d组[(101.58±10.71) μg/L]显著高于正常裸鼠（P<0.05）。种瘤30 d组、40 d组[(97.20±9.98) μg/L]、[(88.22±12.94) μg/L]与正常裸鼠、种瘤5 d组、10 d组比较未见明显差异（P>0.05）。随着荷瘤时间的延长，瘤宿主血VEGF含量逐渐升高，种瘤20 d组明显增高并达高峰，种瘤30 d组、40 d组降至正常水平。V/E比值在种瘤5 d组低于正常裸鼠（P<0.05），30 d组、40 d组持续在低水平（P<0.05）。结论：提示肿瘤的发展与血VEGF和VEGF/ES比值的变化有关。     

血管内皮生长因子和内皮抑素对血管生成的作用研究进展

血管内皮生长因子（VEGF）是一种多功能糖蛋白，是由肿瘤细胞或宿主的非内皮细胞分泌的特异的内皮细胞有丝分裂因子，是最主要的促进血管生成因子。它具有促进血管通透性增加、血管内皮细胞分裂、增殖及诱导血管生成等作用。内皮抑素（ES）是胶原XⅧC末端降解片段，体内、体外实验表明内皮抑素能有效抑制血管内皮细胞增殖、迁移及新生血管形成，是一种特异性的目前为止作用最强的血管形成抑制荆。但其确切的抗血管形成的作用机制尚未阐明。现就血管内皮生长因子、内皮抑素在血管生成中的作用作一综述。     

人内皮抑素克隆表达及对血管内皮细胞生长的抑制作用

目的　获得具有抑制血管内皮细胞生长活性的重组人内皮抑素 (recombinanthumanen dostatin)。方法　从肝细胞中分离总RNA ,经反转录多聚酶链反应 (RT PCR)得到endostatin全基因。用原核细胞表达载体构建了pBV2 2 0 /endostatin重组质粒 ,经DNA测序确认后 ,将其转化大肠杆菌DH5α进行表达、初步纯化及活性测定。结果　经SDS PAGE分析 ,表达产物相对分子质量 (Mr)约 2 0× 10 3,薄层扫描显示表达产物可达细菌总蛋白的 30 %。结论　经生物学活性测定 ,表达蛋白能够抑制碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)对牛毛细血管内皮细胞 (BCEC)的增殖作用     

肺癌患者血清血管内皮生长因子、内皮抑素的表达研究

目的探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、内皮抑素(En-dostatin)在肺癌患者血清中的表达以及与肺癌临床病理生理特征的关系。方法采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测初诊肺癌患者47例及18例肺良性病变患者血清中VEGF、Endostatin的表达水平。结果肺癌患者血清中VEGF(60.93±38.23)pg/ml、Endostatin(131.71±50.32)ng/ml水平显著高于肺良性病变者(33.28±26.49)pg/ml,(85.86±36.86)ng/ml(均P(0.01);肺癌晚期、有淋巴结及远处转移及肺腺癌患者血清VEGF、Endostatin高表达。结论检测血清中VEGF及Endostatin均有助于肺癌的诊断及生物学行为的评估。     

重组人血管内皮抑素联合低氧诱导HeLa细胞自噬和凋亡

目的观察重组人血管内皮抑素(rhES)联合低氧对人宫颈癌HeLa细胞自噬和凋亡的影响。方法取对数生长期HeLa细胞在低氧的基础上分别给予以下处理:PBS、rhES、rhES联合3-甲基腺嘌呤(3-MA)。处理24 h后,Hochest33528染色及annexin V-FITC/PI染色集合流式细胞术检测细胞的凋亡率,Western blot法检测微管相关蛋白轻链3(LC-3)、Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果 Hochest33528染色提示低氧联合rhES组可以诱导细胞出现核碎裂;Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测发现3组细胞的凋亡率分别为:(2.94±0.45)%、(21.38±0.92)%、(6.87±0.58)%,低氧联合rhES诱导细胞凋亡比率明显高于其他2组;Western blot法检测结果显示,与其他2组比较,低氧联合rhES处理HeLa细胞后LC-3Ⅱ及Bax表达水平明显升高,而Bcl-2明显降低。结论 rhES联合低氧可以促使HeLa细胞发生自噬和凋亡。     

腺病毒介导人FL与GM-CSF联合抗肿瘤免疫基因治疗实验研究

目的:研究腺病毒介导人F lt3 ligand(hFL)与GM-CSF在体内外的表达、体外生物学活性,体内扩增小鼠脾脏DCs及抑制小鼠EL-4淋巴瘤的效应。方法:应用AdEasy系统,将hFL和hGM-CSF DNA重组到穿梭质粒的两个独立转录单位上,得到重组腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF。采用ELISA、W estern b lot法测定重组腺病毒介导的hFL和hGM-CSF在体内外的表达情况。MTT法测定hFL和hGM-CSF刺激细胞增殖的生物学活性。利用流式细胞分析技术研究重组腺病毒对小鼠脾脏树突状细胞(DCs)的扩增情况。在移植EL-4淋巴瘤的小鼠皮下注射4次重组腺病毒(每次5×109pfu),研究其抑制肿瘤生长的功能。结果:构建得到含有双基因的重组腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF,并在体内、外高效共表达hFL和hGM-CSF。hFL对小鼠骨髓有核细胞,hGM-CSF对TF1细胞,均有明显的刺激增殖作用。Ad-hFL-hGM-CSF显著扩增小鼠脾脏DCs至正常值的50倍。抑瘤实验中,Ad-hFL-hGM-CSF使小鼠EL-4淋巴瘤生长延慢,瘤体比对照组明显减小,抑瘤率为30%,P<0.05。病理切片显示,Ad-hFL-hGM-CSF治疗组肿瘤细胞间隙有大量淋巴细胞浸润。结论:腺病毒介导hFL和hGM-CSF在小鼠体内显著扩增脾脏DCs,并可抑制EL-4淋巴瘤的生长。     

重组人血管内皮抑制素抗肿瘤效应的应用研究

目的探讨基因工程人血管内皮抑制素(endostatin)抑制黑素瘤在小鼠体内生长和转移的作用及其作用机制。方法接种黑素瘤细胞悬液(2×10     

人endostatin、 K5及endostatin-K5重组腺病毒载体的构建及其表达

目的:人endostatin、 K5及endostatin-K5基因克隆, 重组腺病毒载体的构建及其表达产物体外活性检测.方法:采用PCR方法扩增基因, 通过酶切连接方法将3种基因片段克隆到腺病毒shuttle载体pAd5-CMV-H1H2-MCS-6His中;用磷酸钙沉淀法分别将经Pac I酶切的表达人endostatin、 K5及endostatin-K5的腺病毒shuttle载体与Pac I酶切的腺病毒骨架共转染HEK 293细胞;用CsCl密度梯度离心法纯化制备病毒;用重组腺病毒感染HeLa细胞并在不同时间点收获蛋白, Western blot检测24 h、 48 h和72 h的蛋白表达量;通过MTT方法检测蛋白对ECV-304生长抑制作用.结果:成功制备表达人endostatin、 K5及endostatin-K5重组腺病毒载体;Western blot可以检测到蛋白表达, 蛋白表达量随病毒感染HeLa细胞的时间延长而逐渐增高;由重组腺病毒所表达的3种蛋白对ECV304细胞均有明显的生长抑制作用.结论:由含有人endostatin、 K5及endostatin-K5基因的重组腺病毒载体所表达的蛋白对ECV-304生长具有明显的抑制作用.     

气管内应用白介素2重组腺病毒免疫治疗肺转移癌

目的：研究气管内应用白介素2（IL－2）重组腺病毒（IL－2 gene recombinant adenovirus,AdIL-2)对实验性肺转移癌的治疗作用。方法：①小鼠气管内滴入AdIL-2,ELISA法测定局部及外周血IL－2及相关因子的水平。②C57BL／6小鼠尾静脉注射Lewis肺癌3LL细胞建立肺转移癌模型，观察气管内应用AdIL-2对实验性肺转移癌的治疗作用，包括肺转移结节、动物存活期、生存率变化等，并比较自然杀伤活性（Natural killer,NK)和特异性细胞毒（Cytotoxic T lymphocytes,CTL)活性的变化。结果：①气管应用AdIL-2后肺灌洗液中测到IL－2且高于外周血水平，对照组肺灌洗液及外周血中的水平明显低于实验组（P＜0．01）。②气管内滴入AdIL-2对实验性肺转移癌有治疗作用，可使肺转移结节减少、动物的生存期延长及存活率升高，同时对NK、CTL活性有增强作用（P＜0．01）。结论：气管内应用IL－2重组腺病毒可有效表达并对实验性肺转移癌有治疗作用，为肺部肿瘤的治疗提供了一种新方法。     

介导RA538与反义c-myc腺病毒对肿瘤细胞的作用及其分子机理

目的　比较全反式维甲酸诱导基因 RA5 38及反义 c- myc对人胃癌细胞的生物学特性 ,并探讨其作用的分子机理。方法　采用细胞生长曲线、DNA梯度降解试验、原位末端标记、流式细胞仪、逆转录 -聚合酶链反应、蛋白质印迹分析、裸鼠致瘤性、裸鼠皮下移植瘤模型实验等方法 ,对 RA5 38、反义 c- myc重组腺病毒在人胃癌细胞系 (SGC790 1)中的生物学作用及其分子机理进行体内外研究。结果　 RA5 38及反义 c- myc重组体腺病毒 (Ad- RA5 38及 Ad- ASc- myc)对 SGC790 1细胞生长抑制率分别为 76 .3%和 44 .1%。 DNA梯度降解试验、原位末端标记、流式细胞仪显示 Ad- RA5 38及 Ad- ASc- myc诱导 SGC790 1细胞凋亡。它们均能抑制SGC790 1细胞 c- myc、bcl- 2、cyclin D1基因表达 ,并刺激 bax基因表达 ,对 p5 3、p16、TGase、ras基因的表达没有影响。经 Ad- RA5 38及 Ad- ASc- myc处理的 SGC790 1细胞致瘤性消失。Ad- RA5 38及 Ad- ASc- myc对裸鼠皮下移植瘤模型瘤内注射能有效降低肿瘤的生长速度 ,生长抑制率分别为 6 0 .7%和 6 8.9%。结论　 Ad-RA5 38、Ad- ASc- myc对胃癌细胞具有显著的生长抑制及凋亡诱导作用。其作用是 c- myc、bcl- 2、bax、cyclin D1等一系列基因表达变化及其相互作用的结果 ,与 p5 3、p16、TGa     

大肠杆菌表达的新一代重组人内皮抑素复性条件的优化

目的优化新一代重组人内皮抑素(rhED)的复性方案并检测其抗血管生成活性。方法用6 mol/L盐酸胍溶解rhED包涵体后,用稀释法与透析法相结合的方法进行复性,优化最适复性条件。复性结束后用阳离子交换层析纯化。并用rhED特异性单抗和鸡胚绒毛尿囊膜实验检测复性后蛋白的活性。结果通过优化复性条件,rhED的复性率可达到46%。复性、纯化后的rhED能与rhED特异性单抗反应,并在鸡胚绒毛尿囊膜实验中显示出抑制血管生长的活性。结论提高rhED复性率的复性条件可极大地促进新一代rhED的临床前及临床研究。     

人胸腺基质淋巴生成素基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的: 构建含人胸腺基质淋巴生成素基因(TSLP)的重组腺病毒载体并表达, 以研究其免疫学功能。方法: 将由人胚肺细胞扩增得到的TSLP基因, 克隆于真核表达载体pcDNA3. 1中, 再亚克隆至穿梭质粒pShuttle中, 并与腺病毒骨架载体pAdEasy -1共同转化大肠杆菌。以获得的重组质粒线性化后转染HEK293细胞, 并包装成病毒颗粒。采用PCR法对重组腺病毒基因进行鉴定, 并以Westernblot检测TSLP蛋白的表达。结果: 通过细菌内同源重组, 成功构建带有人胸腺基质淋巴生成素基因的重组腺病毒质粒, 转染 293细胞后, 包装的重组病毒经PCR检测表明, 基因组含有目的基因,病毒的滴度可达 1×1011pfu/L。Westernblot证实, 感染的肿瘤细胞中有相应基因产物的表达。结论: 通过菌内重组可高效制备带有特定基因的重组病毒。所制备的Ad -TSLP可成功表达相应基因产物, 为进一步研究这一新型细胞因子的功能奠定了基础。     

小鼠noggin基因的重组腺病毒构建与鉴定

目的：构建小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法：采用基因工程技术。经过2次亚克隆将 noggin 基因片段克隆至穿梭质粒 AdTrack-CMV 上,利用 pAdEasy-1系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染 293T 细胞包装、扩增。采用 PCR 方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白 GFP 报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果：酶切鉴定及 PCR 结果证明 noggin 基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达6．3×10~(10)pfu/ml。结论：应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体。     

TR基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的 :构建含人硫氧还蛋白还原酶 (TR)基因的重组腺病毒载体 ,探讨TR的抗氧化功能与神经退行性疾病的相关性。方法 :从重组质粒pGEM TR上用内切酶切下编码 5 0 0个氨基酸的全长TRcDNA片段 ,并连接穿梭质粒pShuttle,再双酶切pShuttle TR。将带有CMV启动子的目的片段 ,插入E1、E3缺失的Adeno X病毒DNA中 ,以Adeno TRDNA通过脂质体转染HEK2 93细胞 ,获得重组腺病毒Adeno TR进行PCR鉴定及病毒滴度测定。用重组腺病毒感染CV1细胞 ,通过免疫荧光染色与Westernblot分别检测重组腺病毒感染的细胞上和裂解液中TR蛋白的表达。结果 :重组腺病毒Adeno TR的病毒滴度为 4 .4× 10 11pfu/L。PCR、荧光显微镜证实 ,以及Westernbolt分析 ,在相对分子质量 (Mr)约 5 5 0 0 0处均出现特异性条带。结论 :成功地构建了重组腺病毒载体 ,并能介导外源基因TR表达 ,为进一步研究TR的功能及其与疾病的相关性奠定了基础。     

Recombinant adenovirus vector-mediated human MDA-7 gene transfection suppresses hepatocellular carcinoma growth in a mouse xenograft model

Hepatocellular carcinoma is one of the most common tumors in the world.The purpose of the present study was to investigate the inhibitory effects of adenoviral transduction of human melanoma differentiation-associated gene-7(MDA-7)gene on hepatocellular carcinoma,so as to provide a theoretical basis for gene therapy of the disease.The human MDA-7 gene was cloned into replication-defective adenovirus specific to HepG2 cells using recombinant virus technology.RT-PCR and Western blotting assays were used to determine the expression of human MDA-7 mRNA and MDA-7 protein in HepG2 cells in vitro.Induction of apoptosis by overexpression of the human MDA-7 gene was determined by flow cytometry.In-vivo efficacy of adenoviral delivery of the human MDA-7 gene was assessed in nude mice bearing HepG2 cell lines in vivo by determining inhibition of tumor growth,VEGF and CD34 expression,and microvascular density(MVD).The results showed that AdGFP/MDA-7 induced apoptosis of HepG2 cells in vitro and significantly inhibited tumor growth in vivo(P < 0.05).The intra-tumoral MVD decreased significantly in the treated tumors(P < 0.05).We conclude the recombination adenovirus AdGFP/MDA-7 can effectively express biologically active human MDA-7,which leads to inhibition of hepatocellular carcinoma growth.     

人LIGHT基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的 克隆人LIGHT基因，构建其重组腺病毒载体，以研究LIGHT过表达与腺病毒感染对细胞生长的影响。方法 用RT-PCR法从人外周血单个核细胞（PBMC）中克隆人的LIGHT全长基因。将LIGHT cDNA克隆到穿棱载体pAdTrack-CMV-LIGHT重组质粒中，经酶切线性化后，将重组质粒pAdTrack-CMV-LIGHT和骨架质粒pAdEasy-1，以电穿孔法共转染大肠杆菌BJ5183，获得重组腺病毒质粒。最后，将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒，用荧光显微镜、PCR及Western blot分析LIGHT基因的表达。结果 用RT－PCR法从人的PBMC中，扩增出723bp的cDNA，测序证实为人LIGHT基因。荧光显微镜、PCR及Western blot证实，LIGHT重组腺病毒可感染293细胞，并在293细胞内进行有效的复制。结论 成功地克隆了人LIGHT基因，并构建了其重组腺病毒载体，为进一步研究LIGHT基因的功能提供了条件。