负载供肾抗原的受者DC2细胞对大鼠移植肾的影响

目的】观察负载供肾大鼠抗原的DC2(未成熟DC)在体内特异性抑制急性排斥反应及其对移植物的功能和存活时间的影响【方法】健康成年BN大鼠65只和Lewis大鼠80只,以BN大鼠为供者,Lewis大鼠为受者?利用受者大鼠骨髓细胞在体外诱导分化为未成熟的淋巴系DC前体细胞(DC2),并对其进行免疫表型分析,将所获得DC2负载供肾大鼠抗原,观察DC2在体外抑制混合淋巴细胞反应(MLR),以及在大鼠同种异体肾移植模型中特异性抑制移植排斥反应发生的情况,Kaplan-Meier生存分析研究对移植大鼠的存活时间的影响?【结果】负载供肾抗原的受者DC2对MLR具有抑制作用(P < 0.05);输注负载供肾抗原的DC2实验组的大鼠肾移植术后中位生存时间是62(Q1-Q3:51.1 ~ 74.5)d,输注负载无关大鼠抗原和不负载抗原移植的实验组,术后中位生存时间分别是30(Q1-Q3:21.2 ~ 37.5)d和27(Q1-Q3:21.0 ~ 36.5)d,各实验组与对照组的血清肌酐和细胞因子IFN-γ,IL-4和IL-10的mRNA表达之间的差异具有统计学意义(P < 0.05)【结论】大鼠同系受体来源的负载供肾抗原的DC2具有体外抑制MLR的作用,体内能够预防和抑制急性排斥反应的发生,延长生存时间,提高远期存活率     

供者未成熟树突状细胞对大鼠皮肤移植免疫耐受的诱导

目的探讨供者未成熟树突状细胞 (dendritic cells,DC)对同种异体皮肤移植免疫耐受的诱导效果 ,为抗排斥反应治疗提供依据。方法以供者未成熟树突状细胞术前预处理受者 ,或术后联用环孢霉素 (CSA)。根据实验分组对皮肤移植术后移植皮片存活情况观察。结果对照组、未成熟 DC组、未成熟DC联用环孢霉素组 ,其受体存活时间分别为 6 .86± 1.34d、7.5 7± 1.99d、2 2 .4 3± 4 .4 6 d。未成熟 DC组与对照组之间差别无显著性差异 ,而与未成熟 DC联用环孢霉素组有显著性差异 (P<0 .0 0 1)。结论供者未成熟树突状细胞术前预处理移植受体 ,可明显延长移植物存活时间。     

负载供者抗原的第三方树突状细胞延长大鼠移植心脏存活

目的 观察负载供者抗原第三方未成熟DC对大鼠同种异体移植心脏存活期的影响.方法 培养骨髓来源第三方大鼠未成熟DC,负载供者抗原,CTLA-4 Ig致耐受处理.建立大鼠心脏腹部移植模型,A组:心脏移植;B组:心脏移植,术前输注供者源未成熟DC;C组:心脏移植,术前输注第三方未成熟DC;D组:心脏移植,术前输注负载供者抗原致耐受第三方未成熟DC.分别行移植心病理、IFNγmRNA表达和移植心存活时间观察.结果 D组的移植心病理改变轻,IFNγmRNA表达下调,移植心脏存活时间显著延长.结论 负载供者抗原第三方致耐受未成熟DC能够诱导供者特异性免疫耐受,明显延长大鼠移植心脏存活时间.     

不同处理对大鼠移植心脏存活时间的影响

目的 观察供体脾细胞(SPC)与环磷酰胺(CP)联合预处理对大鼠移植心脏存活时间的影响.方法 应用大鼠颈部心脏移植模型,实验分为对照组(未干预组)、CsA组、SPC CP组.CsA组心脏移植后予环孢霉素A(CsA)10 mg/kg,SPC CP组采用供体SPC和CP预处理移植受体,然后行大鼠颈部心脏移植术.观察移植心脏存活情况及组织病理变化.结果 对照组、CsA组、SPC CP组移植心脏存活时间分别为(7.2±2.4)、(15.8±4.3)、(30.4±10.7)天;组织病理检查显示,经SPC PC预处理的移植心脏排斥反应明显减弱.结论 SPC和CP预处理可以诱导受体对移植物的免疫耐受,延长移植心脏的存活期,效果优于CsA.     

RNAi抑制大鼠骨髓源树突状细胞MHC-Ⅱ表达的研究

目的:应用RNAi技术探讨靶向主要组织相容性复合物Ⅱ类抗原反式转录激活因子(C Ⅱ TA)的shRNA质粒载体抑制大鼠骨髓源树突状细胞(DC)表面MHC-Ⅱ类抗原表达的可行性.方法:体外培养大鼠骨髓源DC:流式细胞仪检测DC表面抗原MHC-Ⅱ、OX-62表达情况;体外合成针对C Ⅱ TA mRNA序列特异性C Ⅱ TA shRNA并构建质粒,在阳离子脂质体介导下转染DC;流式细胞仪检测细胞表面抗原MHC-Ⅱ表达水平的变化.结果:(1)经体外培养DC可用于后续反应,体外构建质粒成功;(2)流式细胞仪检测显示C Ⅱ TA-shRNA质粒组中DC转染后MHC-Ⅱ的抗原水平均较对照组明显降低.结论:利用C Ⅱ TA shRNA质粒载体沉默C Ⅱ TA基因从而下调MHC-Ⅱ的表达的策略是可行的,为降低移植排斥反应提供了实验依据.     

Ad-CTLA-4Ig基因导入对胰十二指肠移植大鼠免疫耐受的实验研究

目的 研究基因转导法导入细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4融合蛋白基因(CTLA-4Ig)对诱导大鼠胰腺移植免疫耐受的作用.方法 采用链脲霉素60 mg/kg尾静脉一次性注射法诱导建立Wistar大鼠Ⅰ型糖尿病模型.以SD大鼠为供体,糖尿病Wistar大鼠为受体,用体外低温保存状态下对供器官行腺病毒介导CTLA-4Ig基因转导制作异基因大鼠胰十二指肠移植动物模型.术后监测血糖,记录大鼠功能性存活期.术后3、10、17、28d经大鼠眶后静脉取血,应用ELISA法检测血清IL-2表达,Western blot检测人CTLA-4Ig的蛋白表达.结果 对照组大鼠功能性存活期为(11±1)d,转导组功能性存活期为(33±4)d(P＜0.01);对照组大鼠术后血清中未检测到人CTLA-4Ig蛋白表达,所有转导组存活病例,第10d血清中均有人CTLA-4Ig表达;转导组术后第3d、第10d血清IL-2分别为(33.710±7.803) pg/mL、(47.846±14.050) pg/mL,小于对照组(P＜0.01).结论 体外低温保存状态下对供器官行腺病毒介导人CTLA-4Ig基因转导,可以延长大鼠胰十二指肠移植术后功能性存活期,诱导免疫耐受.     

Immature CD4+ dendritic cells conditioned with donor kidney antigen prolong renal allograft survival in rats

Background  Allogeneic transplant rejection is currently a major problem encountered during organ transplantation. The dendritic cell (DC) is the most effective powerful known professional antigen-presenting cell, and recent studies have found that DCs can also induce immune tolerance, and avoid or reduce the degree of transplant rejection. The aim of this study was to evaluate the effect of transfused immature CD4⁺ DCs on renal allografts in the rat model.

Methods  In this study, we induced CD4⁺ immature DCs from rat bone marrow cells by a cytokine cocktail. The immature CD4⁺ DCs were identified by morphological analysis and then the suppressive activity of these cells conditioned with donor kidney antigen was evaluated in vitro and in vivo.

Results  Immature CD4⁺ DCs conditioned with donor kidney antigen possessed immunosuppressive activity in vitro and they were able to prolong renal transplant survival in an allograft rat model in vivo.

Conclusions  Our study provides new information on efficacious renal transplantation, which might be useful for understanding the function of immature CD4⁺ DCs in modulating renal transplant rejection and improving clinical outcome in future studies.

     

术前输注负载供者抗原的受者未成熟树突状细胞延长移植心存活时间的实验研究

目的:利用负载供者抗原的受者未成熟树突状细胞(imDC)干扰T细胞抗原间接识别途径,观察对同种异体移植心存活时间的影响。方法:用低剂量粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)培养受者小鼠骨髓源性imDC,并在培养过程中加入供者可溶性抗原共同孵育,流式细胞术检测细胞表型,观察其在体外刺激自体T细胞增殖的能力,并于术前1周将约2.0×106个树突状细胞(DC)输入受者体内,观察其对同种异体移植心存活时间的影响。结果:受者DC可通过共同孵育的方式有效负载供者抗原,负载供者抗原的受者imDC在体外不能有效刺激自体T细胞活化增殖,将其于术前输入受者体内,移植心的存活时间由(7.2±1.7)天延长至(17.7±3.3)天。结论:术前输注负载供者抗原的受者imDC,可明显延长移植心的存活时间。     

用负载供体抗原的致耐受性树突状细胞延长大鼠移植肾存活

目的 研究负载供体抗原的致耐受性受体树突状细胞(Dendritic cells,DC)对移植肾存活的影响。方法 以BN、Lewis大鼠为肾移植供、受体;受体骨髓源性DC负载供体淋巴细胞抗原并与共刺激阻断剂CTLA4Ig共孵育;将上述DC于肾移植前24 h经股静脉注入受体(治疗组),未注射DC的受体为对照组;观察各组移植肾存活时间,术后第20天,MTT法检测受体脾细胞对供体及无关抗原刺激的反应。结果移植肾存活时间:与对照组相比,治疗组移植肾存活时间显著延长[(54.6±9.5)d vs(8.3±0.8)d,P<0.01]。术后第20天,治疗组脾细胞对供体抗原刺激的反应明显低于正常对照[(0.17±0.04)vs(0.74±0.06),P<0.01],而受体对无关抗原刺激的反应与正常对照无显著差异[(0.72±0.04)vs(0.69±0.07),P>0.05]。结论 负载供体抗原的致耐受性受体DC可以特异性抑制受体对供体抗原的免疫反应、明显延长大鼠移植肾存活时间。     

不同大肠癌细胞裂解物负载健康人外周血DC瘤苗的体外试验研究

目的探讨3种大肠癌肿瘤细胞裂解物负栽的健康人外周血树突状细胞（DC）刺激同体和异体T淋巴细胞增殖活化的作用。方法对血站来源的健康人外周血采用密度梯度离心法,分离获得DC前体细胞,用临床应用药物GM—CSF、TNF—a和试验用试剂rhlL-4联合诱导培养扩增Dc,制备3种大肠癌细胞裂解物,体外致敏DC,显微镜观察Dc形态演化过程,电镜拍摄微观形态特征,流式细胞仪鉴定DC表型,ELlSA法检测肿瘤抗原致敏DC分泌IL-12水平,检测致敏DC刺激T淋巴细胞分泌的IL—lO和IF阿7水平,3H—TdR法检测成熟DC（mDC）诱导同体和异体T淋巴细胞增殖能力。结果DC形态学呈现典型树突状分化特征,mDC表达特征性免疫表型CDla、CD83,共刺激分子CD86、HLA—DR,分泌高水平IL—12,mDC与同体和异体T淋巴细胞共培养均能有效刺激T淋巴细胞增殖活化,T淋巴细胞不分泌IL-10,分泌较高水平IFN-了,3W480细胞株在各项指标上都具优势,3H—TdR法检测提示mDC不仅可以刺激同体淋巴细胞增殖,同样有效激活异体T淋巴细胞。结论来源于血站的健康人外周血是-种方便的DC前体细胞原料。联合细胞因子的培养方法可以成功诱导出成熟的DCl型细胞,引起Thl型细胞免疫反应;3种大肠癌肿瘤细胞裂解物,尤其是Sw480细胞株裂解物抗原性质稳定,能够有效促进DC分化,提高DC成熟度;负载裂解物的DC不仅刺激同体T淋巴细胞增殖,也可有效激活异体T淋巴细胞增殖,因此应用健康人异体来源的DC瘤苗刺激患者T淋巴细胞增殖,从而产生抗肿瘤免疫反应的设想是可行的。     

鼻咽癌可溶性抗原负载DC诱导CTL杀伤鼻咽癌细胞的体外研究

目的：用负载鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原的树突状细胞(dendritic cells，DC)诱导自身淋巴细胞，使之活化为鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)特异性细胞毒性T细胞(cvtotoxic T lymphocyte，CTL)，观察其对鼻咽癌细胞的体外特异性杀伤作用。方法：用GM-CSF、IL-4和TNF-α体外诱导健康成人外周血单核细胞，使其分化为高纯度DC。用鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原负载成熟DC，流式细胞仪检测负载前后DC的表型特征，MLR检测负载前后DC对同种异体T淋巴细胞增殖的能力。在白细胞介素-2(IL-2)的作用下，用负载鼻咽癌细胞可溶性抗原的DC诱导自身淋巴细胞成NPC特异性CTL，通过杀伤活性实验观察它对鼻咽癌细胞(CNE)的特异性杀伤效应。结果：人外周血单核细胞体外在GM-CSF、IL-4、TNF-α诱导下获得具典型表型特征的成熟DC。负载CNE可溶性抗原对成熟DC表面共刺激分子及特异性表面标志无影响，仍有较强的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力，所诱导的CTL对鼻咽癌细胞(CNE)有明显的特异性杀伤作用。结论：负载鼻咽癌细胞(CNE)可溶性抗原的DC所诱导的CTL在体外对鼻咽癌细胞有特异性杀伤作用，对NPC的临床治疗有潜在的应用价值。     

共刺激阻断剂CTLA-4Ig基因修饰的树突状细胞对移植肾存活的影响

目的探讨共刺激信号阻断剂CTLA-4Ig基因修饰的树突状细胞(dendriticcells,DC)对移植肾存活的影响。方法以BN、Lewis大鼠为肾移植供、受体;用CTLA-4Ig基因重组腺病毒转染供、受体骨髓源性DC使之表达CTLA-4Ig;将供、受体DC于肾移植前24h经股静脉分别注入受体(设为组1、组2),供、受体DC混合后注入受体(组3),未注射DC的受体为对照组;观察各组移植肾存活时间,术后第20天,MTT法检测受体脾细胞对供体及无关抗原刺激的反应。结果与对照组相比,组1移植肾存活时间显著延长[(54.1!11.6)dvs(8.4!0.7)d,P<0.01),组3移植肾存活时间延长更为明显(77.5!15.7)d,P<0.001],组2移植肾存活时间无延长(8.1!0.7)d,P>0.05。术后第20天,组1、组3脾细胞对供体抗原刺激的反应均明显低于正常对照(0.27!0.07)and(0.23!0.06)vs(0.74!0.06),P<0.01,而对无关抗原刺激的反应与正常对照差异无显著性(0.68!0.04)and(0.71!0.05)vs(0.69!0.05),P>0.05。结论CTLA-4Ig基因修饰的供体DC可以明显延长大鼠移植肾存活时间,而受体DC则无此作用,但两种DC联合应用可以使移植肾获得更长的存活时间。     

负载辐射凋亡MB49肿瘤细胞抗原的树突状细胞(DC)疫苗对小鼠膀胱癌的抑制作用

 目的 研究辐射凋亡MB49肿瘤细胞诱导的树突状细胞(dendritic cell,DC)疫苗的制备及对C57BL/6小鼠体内膀胱肿瘤的免疫学效应。方法 采用辐射法获取MB49细胞抗原并用其致敏骨髓来源的DC来制备DC疫苗。用MB49小鼠膀胱癌细胞建立荷瘤动物模型,随机分为实验组和对照组,于肿瘤细胞接种后第7、14天给予相应DC疫苗治疗或者PBS,每组分为2个亚组,分别用于测量瘤质量、体积及用于观察荷瘤小鼠存活情况。结果 负载辐射凋亡肿瘤细胞DC疫苗的实验组荷瘤小鼠,其肿瘤的平均体积和平均质量均显著低于对照组(P<0.01),生存期长于对照组。DC疫苗实验组中有2只小鼠30天内无肿瘤生长,再次皮下接种MB49细胞观察30天仍无肿瘤发生。结论 负载辐射凋亡肿瘤细胞的DC疫苗对膀胱肿瘤荷瘤小鼠具有抑瘤效应和延长生存期的作用。     

小鼠AFP/DC疫苗体外免疫活性检测及对小鼠皮下移植瘤抑制作用

目的将已构建的Balb/c小鼠具有分泌性信号肽的AFP1cDNA和去掉信号肽的AFP2cDNA真核表达载体,分别在小鼠树突状细胞(DCs)中表达,并观察其在体外抗肝癌免疫中的作用和对小鼠皮下移植瘤的抑制作用。方法脂质体转染PcDNA3.1( )/AFP1、PcDNA3.1( )/AFP2至DCs细胞进行表达、鉴定,将DCs疫苗与同源小鼠脾淋巴细胞混合培养,MTT比色法测定脾淋巴细胞的特异性杀伤肝癌细胞的活性。随后建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型,用AFP1/DCs和AFP2/DCs进行皮下注射,观察其对Balb/c小鼠皮下移植瘤的抑制作用;观察各组治疗后皮下移植瘤的体积的大小,治疗组小鼠的存活期,取瘤组织行免疫组化观察Bax凋亡基因的表达情况,观察另一半荷瘤小鼠的生存时间。结果所构建的真核表达质粒pcDNA3.1( /-)/AFP1和pcD-NA3.1( /-)/AFP2在小鼠树突状细胞中获得稳定高效表达,AFP2/DCs明显刺激T淋巴细胞的增殖及提高CTL的特异性杀伤作用,AFP1/DCs和AFP2/DCs皮下注射可显著抑制肝癌H22细胞移植瘤的生长,以AFP2/DCs的效果更明显,治疗2周后AFP2/DCs组小鼠的肿瘤体积(726.7±298.2)mm3明显小于AFP1/DCs组的肿瘤体积(1486.2±457.2)mm3和空质粒对照组的肿瘤体积(2137±547.2)mm3,两组间有统计学差异(P<0.05),AFP2/DCs治疗组、AFP1/DCs治疗组的抑瘤率可达79.2%和39.7%,空质粒对照组和生理盐水对照组的抑瘤率为0;AFP2/DCs治疗组、AFP1/DCs治疗组的小鼠存活期分别为(54.5±4.2)d、(40.2±4.8)d,较空质粒对照组(30.6±6.2)d显著延长。AFP2/DCs治疗组移植瘤组织中Bax阳性细胞的百分率为92%,显著高于AFP1/DCs组(64%)和pcDNA/DCs(21%)和生理盐水组(23%),两组间差异有显著性(P<0.05)。结论成功地构建了真核表达载体PcDNA3.1( )/AFP1和PcDNA3.1( )/AFP2,编码去掉分泌性信号肽的AFP2cDNA真核表达载体转染的小鼠树突状细胞,能够诱导较强的特异性抗肝癌免疫效应。其机制可能与诱导肝癌细胞凋亡有关。