脂联素siRNA对3T3-L1细胞基础葡萄糖转运的影响

目的：构建携带小鼠脂联素（Acrp30）siRNA腺病毒载体，并检测其对小鼠脂肪细胞Acrp30表达以及对3T3-L1脂肪细胞基础葡萄糖转运的影响。方法:设计并化学合成小鼠脂肪细胞Acrp30 siRNA片段，将其亚克隆入AdEaxy XL 腺病毒载体系统，在293细胞内包装扩增为重组腺病毒。用此重组腺病毒感染3T3-L1脂肪细胞，用RT-PCR和ELISA检测其Acrp30 mRNA和蛋白表达。采用2-Deoxy-［3H］D-glucose掺入法测定脂肪细胞葡萄糖转运。结果:设计并构建了小鼠Acrp30 基因特异性siRNA腺病毒载体，该载体感染脂肪细胞后，能显著抑制Acrp30 mRNA和蛋白表达，影响3T3-L1脂肪细胞基础葡萄糖的转运，与对照组相比，差异显著(P<0.05)。结论:构建的Acrp30 基因特异性siRNA腺病毒载体能有效地抑制脂联素在3T3-L1脂肪细胞中的表达，从而影响3T3-L1脂肪细胞基础葡萄糖转运。     

gAd对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖分解代谢关键酶表达的影响

目的通过检测3T3-L1脂肪细胞内糖酵解关键酶的表达情况,探讨课题组前期制备的脂联素球状结构域（gAd）对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖分解代谢的影响。方法用课题组前期制备的gAd（质量浓度依次为10、50、100、300、1 000 ng/mL）干预分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,干预结束后以实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）法检测各组细胞糖酵解关键酶包括己糖激酶、6-磷酸果糖激酶-1及丙酮酸激酶转录表达情况,以Western blot法检测各组细胞丙酮酸激酶翻译表达情况。结果gAd干预组（5个浓度）己糖激酶的转录表达[（2.02±0.16）、（3.47±0.29）、（4.22±0.33）、（5.83±0.45）、（6.65±0.51）倍]显著高于对照组（1.00±0.00）（F=125.789,P〈0.001）,6-磷酸果糖激酶-1和丙酮酸激酶的转录表达也显著高于对照组（F分别为85.399和113.661,P均〈0.001）,同时丙酮酸激酶的翻译表达（12.430%±0.800%、1.700%±3.010%、26.570%±1.114%、52.600%±2.910%、71.130%±10.600%）也显著高于对照组（8.000%±1.610%）（F=161.007,P〈0.01）。结论 gAd促进3T3-L1脂肪细胞摄取胞外葡萄糖的同时,激活了细胞内葡萄糖的分解供能代谢途径。     

生长激素释放肽对心力衰竭大鼠血清和心肌组织中脂联素的影响

目的研究生长素释放肽(GHRP)对脂联素(APN)的影响,探讨GHRP在慢性充血性心力衰竭(CHF)发生、发展中的作用,以期为临床更好地防治CHF提供理论依据。方法采用腹腔注射阿霉素(Adriamycin,ADR)方法建立大鼠CHF模型,采用酶联免疫吸附剂测定(ELISA)检测大鼠血清和心肌组织匀浆中APN含量的变化。结果各组间血清和心肌组织匀浆中APN的含量比较结果显示:模型组APN明显低于对照组和治疗组(P<0.05);治疗组APN比对照组轻度降低,但无明显差异(P>0.05)。结论APN在CHF发生过程中有着重要作用,GHRP具有保护和改善CHF大鼠心功能的作用。     

脂联素促进HIF-1α及炎症因子表达参与RA发病机制的研究

通过研究脂联素(adiponectin,AD)对低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)及炎症因子IL-6、IL-17及TNF-α表达的促进作用,为进一步探讨AD参与类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)发病机制提供理论与实验依据。体内实验:给于所构建的胶原诱导关节炎模型鼠(collagen-induced arthritis,CIA)关节腔内注射AD观察对CIA小鼠发病的影响,并采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测HIF-1α、IL-6、IL-17及TNF-αmRNA表达变化。体外实验:以不同浓度AD刺激RA滑膜成纤维细胞(synovial fibroblast,SF)72h,采用real-time PCR和western blot的方法检测HIF-1α、IL-6、IL-17及TNF-α的表达。结果:CIA小鼠注射AD后,关节局部组织中HIF-1α(P<0.05)、IL-6(P<0.001)及IL-17mRNA(P<0.05)的表达增高;体外实验中,AD呈剂量依赖性地促进RASF中HIF-1α(P<0.001)、IL-6(P<0.05)及IL-17αmRNA(P<0.05)和HIF-1α蛋白表达。提示AD能通过促进HIF-1α及促炎因子的表达而参与RA发病。     

氧自由基对3T3-L1脂肪细胞表达PAI-1的调节及其可能机制

目的： 研究脂肪细胞中氧自由基（ROS）对纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）表达的调节,并探讨其机制。方法：培养3T3-L1细胞,并诱导其分化成为脂肪细胞,以MTT比色法检测细胞的活性。分别以定量PCR、多重免疫分析及夹心ELISA法检测PAI-1 mRNA和蛋白表达的水平,并采用多重磷酸化蛋白分析系统检测细胞内多种信号分子的蛋白磷酸化水平。结果：H2O2可剂量依赖性地增加PAI-1的产生。并且激活了3T3-L1脂肪细胞中多种信号转导通路,包括ERK1/2、JNK、Akt、p70 S6K及JAK/STAT,其中Akt、JAK/STAT及ERK1/2的活化可能参与到H2O2对于PAI-1的调节过程中。结论： H2O2可能通过磷酸化激活Akt、JAK/STAT及ERK1/2,上调脂肪细胞PAI-1的表达。     

醛固酮对3T3-L1前脂肪细胞与脂肪细胞内脂素表达和分泌的影响

目的:探讨醛固酮对3T3-L1前脂肪细胞和脂肪细胞内脂素基因表达和蛋白分泌的影响。方法:10-8和10-6mol/L醛固酮加或不加10-6mol/L安体舒通分别干预3T3-L1前脂肪细胞和脂肪细胞24h和48h,用实时RT-PCR测定内脂素和盐皮质激素受体(MR)mRNA的表达,酶联免疫法测定培养液中内脂素的浓度。结果:醛固酮作用于3T3-L1前脂肪细胞,内脂素mRNA表达减少,培养液中蛋白浓度变化不明显,MR mRNA表达增高。醛固酮作用于脂肪细胞,内脂素mRNA表达和蛋白浓度均降低,MR mRNA表达增高。安体舒通在一定程度上可对抗醛固酮对内脂素的抑制作用。结论:醛固酮抑制3T3-L1脂肪细胞内脂素的基因表达和分泌。     

利拉鲁肽对非酒精性脂肪肝大鼠脂联素及胰岛素抵抗的影响

 目的：观察利拉鲁肽（Lira）对非酒精性脂肪肝（NAFLD）大鼠血清和肝组织脂联素（ADP）及胰岛素抵抗的影响。方法：雄性SD大鼠30只,随机分为3组,分别予普通饮食（ND组）10只、高脂饮食（HFD组）10只和高脂饮食加利拉鲁肽腹腔注射（Lira组）10只。高脂饮食12周建立大鼠NAFLD模型,建模成功后Lira组予利拉鲁肽腹腔注射治疗4周。16周末处死各组大鼠,生物化学法检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、空腹血糖（FBG）、甘油三酯（TG）及总胆固醇（TC）,分光光度计测定游离脂肪酸（FFAs）,酶联免疫吸附法测定胰岛素和ADP。结果：与HFD组比较,Lira组大鼠体质量、肝指数、胰岛素抵抗指数、血清TG、TC、ALT、FBG及肝匀浆TG、TC、FFAs显著下降（均P<0.05）,血清及肝组织ADP明显升高（P＜0.05）,肝脏脂肪变性程度明显减少至恢复正常（P<0.05）,肝组织ADP含量与肝脏FFAs含量呈负相关。结论:利拉鲁肽改善胰岛素抵抗和肝脏脂肪变的可能机制之一与其升高血清及肝组织脂联素水平有关。     

卡维地洛对慢性心力衰竭患者血清脂联素表达及心功能的影响

目的探讨卡维地洛对慢性心力衰竭（CHF）患者血清脂联素（APN）、有关心衰标志物表达及心功能的影响。方法选择行常规治疗的60例CHF患者为对照组,同期60例加用卡维地洛治疗的CHF患者为实验组,疗程6个月。观察治疗前后患者的心功能分级、超声心动图下左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期内径（LVESD）和左心室射血分数（LVEF）及酶联免疫法测定的血清APN、氨基末端脑钠肽前体（NT—proBNP）、心肌肌钙蛋白T（cTnT）水平变化。结果心衰患者的血清APN、NT．proBNP、cTnT水平随着NYHA分级增加而明显升高。治疗6个月后,实验组和对照组治疗总有效率分别为91．7％和7313％,差异有统计学意义（P〈O．01）。治疗后两组患者LVEDD、LVESD均缩小．LVEF明显提高。治疗后,两组血清APN、NT．proBNP、cTnT水平均降低（P〈0．05）,且实验组以上指标较对照组下降更为显著,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论卡维地洛可以显著降低慢性心力衰竭患者的血清APN、NT-proBNP、cTnT水平,明显改善心功能。     

寻常型银屑病患者皮损中瘦素、脂联素与血管内皮生长因子表达的研究

目的 探讨寻常型银屑病患者皮损中瘦素、脂联素及其血管内皮生长因子vascular endothelial growth factor(VEGF)的变化与意义.方法 ①采用免疫组织化学技术检测34例寻常型银屑病患者和21例正常人皮损中瘦素、脂联素与VEGF表达水平.结果 同正常对照组相比,寻常型银屑病患者皮损中瘦素、脂联素以及血管内皮生长因子表达明显高于正常对照组,强阳性率分别为17.65%、17.65%和14.7%,差异有统计学意义(χ2=9.18,P<0.05;χ2=13.34,P<0.05;χ2=18.9,P<0.05),相关分析表明,瘦素表达水平与VEGF表达水平呈正相关(r=0.8,P<0.05),脂联素与VEGF无相关(r=-0.02,P>0.05).结论 寻常型银屑病患者皮损中瘦素、脂联素及其VEGF水平的变化可能与银屑病的发病有关,而血管内皮生长因子的变化可能与瘦素有关.     

胰岛素和人参皂甙 Rg1对脂联素mRNA 表达的影响

目的:探讨不同浓度的胰岛素和人参皂甙Rg1对体外3T3-L1脂肪细胞脂联素(adiponectin) mRNA 表达的影响。方法:通过不同浓度胰岛素和Rg1与3T3-L1脂肪细胞共同培养，以β-actin为内对照，半定量逆转录PCR法测定脂联素 mRNA表达。结果:随着胰岛素浓度的升高，脂联素 mRNA 表达逐渐降低，在胰岛素浓度 ≥100 nmol/L 时具有显著差异（P<0.05）;40 mg/L Rg1能有效逆转高胰岛素对脂联素mRNA 表达的抑制作用（P<0.05）。结论:体外高胰岛素水平可使3T3-L1细胞脂联素表达下降，Rg1可逆转体外高胰岛素降低脂联素表达的作用。     

血管钠肽减轻MPP+所致多巴胺神经元损伤*

 目的：探讨血管钠肽（vasonatrin peptide,VNP）的神经保护效应。方法：原代培养取自小鼠中脑腹侧的多巴胺神经元,暴露于1-甲基-4-苯基吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+）。采用细胞活力分析和免疫荧光染色评价VNP对MPP+神经毒性的影响,并应用多种阻断剂和激动剂探讨VNP神经效应的机制。结果：MPP+造成多巴胺神经元损伤,VNP增强多巴胺神经元的细胞活力,增加神经元轴突数目和长度。VNP还可抑制MPP+造成的神经元β-微管蛋白III解聚。另外,VNP显著升高细胞内cGMP水平。VNP的效应可以被8-Br-cGMP（一种膜通透性的cGMP类似物）所模拟,被HS-142-1［鸟苷酸环化酶偶联的钠尿肽受体（NPR）的阻断剂］或KT-5823［cGMP依赖性蛋白激酶(PKG)的阻断剂］所阻断。结论：VNP通过NPR/cGMP/PKG通路减轻MPP+的神经毒性,提示VNP可能成为一种新的有效药物,治疗帕金森病的神经退行性病变。     

硫化氢抑制小鼠胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞系抵抗素的分泌

目的观察硫化氢(H2S)是否通过AMPK信号通路影响小鼠胰岛素抵抗3 T3-L1脂肪细胞系抵抗素的分泌。方法将细胞分为对照组、胰岛素抵抗3T3-L1组和50μmol/L Na HS组,利用ELISA法检测抵抗素(resistin)的分泌,Western blot检测AMP激活的蛋白激酶(AMPK)及乙酰辅酶A羧化酶(ACC)磷酸化蛋白的表达,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测resistin及AMPK mRNA表达。结果与对照组比较,给予Na HS后抵抗素分泌明显降低(P0.05)。正常和胰岛素抵抗细胞中AMPK和ACC磷酸化蛋白表达显著增加(P0.05)。AMPK通路特异性阻断剂compound C可减弱Na HS对AMPK及ACC蛋白磷酸化的作用,且降低正常和胰岛素抵抗细胞抵抗素的分泌。结论 H2S可能通过激活AMPK通路来抑制小鼠正常和胰岛素抵抗3 T3-L1脂肪细胞的抵抗素分泌。     

脂肪酸诱导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的研究

目的: 观察不同种类、不同浓度脂肪酸对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运的影响，探讨高脂负荷在胰岛素抵抗形成中的意义，并建立最佳的脂肪酸诱导胰岛素抵抗产生的细胞模型。方法: 以3T3-L1前脂肪细胞和诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞为研究对象，利用2-脱氧-［³H］-D-葡萄糖掺入法，观察最大葡萄糖摄取率时最佳胰岛素作用浓度和时间；在此基础上研究不同浓度油酸（C18:1）、棕榈酸(C16:0)对前脂肪细胞和脂肪细胞摄取葡萄糖的影响。结果:胰岛素刺激15 min（P<0.05）-1 h（P<0.01），葡萄糖转运呈升高的趋势，至6 h（P>0.05）逐渐下调；胰岛素浓度升高至50 nmol/L时，葡萄糖转运增加336%（P<0.01），100 nmol/L时达最高峰，是基础状态的492%（P<0.01）。0.125 mmol/L油酸或棕榈酸均可明显抑制胰岛素刺激状态下的3T3-L1前脂肪细胞葡萄糖转运（P<0.05），并呈浓度依赖性抑制；油酸及棕榈酸浓度分别达0.5 mmol/L和1.0 mmol/L时，分化成熟脂肪细胞葡萄糖转运显著受抑（P<0.05）。结论: 胰岛素刺激下的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运有一定的时序性和浓度依赖性，100 nmol/L胰岛素刺激1h，葡萄糖转运率最高。1 mmol/L油酸或棕榈酸作用16-18 h可显著诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的发生。     

PACAP up-regulates the expression of apolipoprotein D in 3T3-L1 adipocytes. DRG/3T3-L1 co-cultures study

The existence of a cross-talk between nerves and fatty tissue is increasingly recognized. Using co-cultures of dorsal root ganglion (DRG)-derived cells and 3T3-L1 adipocytes, we have previously shown that the presence of fat cells enhances neurite outgrowth and number of synapses. Vice versa, neural cells induced expression of neurotrophic adipokines apolipoprotein D and E (ApoD, ApoE) and angiopoietin-1 (Ang-1) by adipocytes. Here, we tested whether pituitary adenylate cyclase-activating peptide (PACAP), which is released by sensory fibres and causes Ca(2+) influx into fat cells, is involved in ApoD induction. Using 3T3-L1 cell cultures, we found that PACAP at a dose of 1 nM up-regulated the expression of ApoD protein and mRNA approx. 2.5 fold. This effect was driven by ERK1/2 acting upon PAC1/VPAC2 receptors. In turn, PACAP-treated 3T3-L1 adipocytes in co-cultures with DRG cells enhanced neurite ramification of neurofilament 200 (NF200)-positive neurons (measured using fluorescence microscopy) and neurofilament 68 protein levels (measured using Western blot analysis). This effect could be blocked using the PAC1/VPAC2 antagonist PACAP(6-38). Scanning cytometry revealed PACAP/ApoD induced low density lipoprotein receptors (LDLR) and ApoE receptor 2 (apoER2) in NF200-positive cells. Thus, a bidirectional loop seems to exist regulating the innervation of fatty tissues: PACAP released from sensory fibres might stimulate fat cells to synthesize neurotrophic adipokines, which, in turn, support peripheral innervation.     

Overexpression of LYRM1 induces mitochondrial impairment in 3T3-L1 adipocytes

Homo sapiens LYR motif containing 1 (LYRM1) is a recently discovered gene involved in adipose tissue homeostasis and obesity-associated insulin resistance. The exact mechanism by which LYRM1 induces insulin resistance has not yet been fully elucidated. In this study, we demonstrated that the overexpression of LYRM1 in 3T3-L1 adipocytes resulted in reduced insulin-stimulated glucose uptake, an abnormal mitochondrial morphology, and a decrease in intracellular ATP synthesis and mitochondrial membrane potential. In addition, LYRM1 overexpression led to excessive production of intracellular of reactive oxygen species. Collectively, our results indicated that the overexpression of LYRM1 caused mitochondrial dysfunction in adipocytes, which might be responsible for the development of LYRM1-induced insulin resistance.     

白细胞介素6导致脂肪细胞胰岛素抵抗机制的初步探讨

目的： 观察IL-6对3T3-L1脂肪细胞胰岛素敏感性的影响并初步探讨其机制。 方法： 用IL-6处理3T3-L1脂肪细胞48h后，观察胰岛素刺激的葡萄糖摄取，IRS-1蛋白表达和酪氨酸磷酸化以及PKB磷酸化水平。同时观察mTOR抑制剂那巴霉素对IL-6作用的影响。结果： IL-6使胰岛素刺激的葡萄糖摄取和PKB磷酸化下降约50％，同时明显降低IRS-1蛋白表达（约35％）和酪氨酸磷酸化（约40％）水平。IL-6的上述作用可被那巴霉素逆转。结论： IL-6导致的脂肪细胞胰岛素抵抗与IRS-1表达减少和酪氨酸磷酸化水平下降有关，那巴霉素可以逆转IL-6的作用，mTOR可能参与IL-6导致的胰岛素抵抗的发生。