反义TGF-β1抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的研究

目的应用反义技术抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)体外增殖,为应用基因治疗手段改善创伤愈合提供实验依据.方法应用脂质体将反义TGF-β1转染至KF,通过细胞计数绘制细胞生长动力学曲线,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况.结果①转染反义TGF-β1的KF体外增殖明显降低.②与未转染反义TGF-β1的KF相比,转染反义TGF-β1的KF凋亡发生率明显增高(差异有显著性意义,P＜0.05).结论反义TGF-β1可抑制体外培养的KF增殖,并促进KF的凋亡.     

内源性转化生长因子β1对膀胱癌细胞体外生长的影响

目的：研究内源性转化生长因子β1（TGFβ1）对膀胱癌细胞增殖的影响及机制。方法：构建携TGFβ1反义RNA的复制缺陷型逆转录病毒载体pRevTβ-AS，转染膀胱癌EJ细胞株，观察抑制内源性TGFβ1表达对EJ细胞体外增殖的影响；流式细胞仪分析转染后细胞周期时相分布的改变。结果：将TGFβ1反义RNA导入EJ细胞并有效表达；抑制TGFβ1表达可以降低靶细胞的生长速度和克隆形成率，使细胞增殖指数下降12％；反义RNA转染的EJ细胞G0和G1期细胞占65．7％，高于对照组细胞，S期细胞占20．5％，低于对照组细胞。结论：内源性TGFβ1通过诱导膀胱癌细胞G1→S期转换，促进肿瘤细胞体外增殖。     

转化生长因子β1反义RNA对肾小球系膜细胞基质合成及分泌的影响

目的：观察转化生长因子beta1(TGF-β1）反义RNA对系膜细胞基质合成的影响。方法：构建含TGF－β1反义RNA的重组腺病毒，将重组腺病毒转染系膜细胞，用Northern blot检测转染系膜细胞TGF－β1及ColIV mRNA的含量，用免疫组化半定量分析转染的系膜细胞中TGF－β1，纤连蛋白（FN）及胶原（Col)IV蛋白水平，并与无转染的系膜细胞对照组比较其表达的变化。结果：构建了含TGF－β1反义RNA的重组腺病，重组反义TGF－β1腺病毒转染系膜细胞后，与对照组相比，在第24hTGF-β1及Col IV的mRNA无明显抑制，在48hTGF－β1及Col IV mRNA抑制率分别为22．5％，18．2％，72h TGF-β1及Col IV mRNA抑制率分别为29．5％，27．3％，免疫组织化学半定时结果显示；与对照组相比，在48h始转系膜细胞TGF－β1，FN及ColIV蛋白含量开始下降，48h TGF-β1，FN及Col IV蛋白抑制率分别为16．5％，18．2％及14．6％，72h TGF－β1，FN及ColⅣ蛋白抑制率分别为23．5％，27．3％，26．8％。结论：重组反义TGF－β1可抑制系膜细胞合成细胞外基质，在肾小球肾炎及肾小球硬化的研究及治疗中有潜在的应用价值。     

TGF—β1对人前列腺上皮细胞增殖与凋亡的调节作用

目的 观察TGF－β对体外培养人前列腺上皮细胞增殖与凋亡的调节作用。方法 建立原代人前列腺上皮细胞株13例,角化蛋白PSA等免疫组织化学染色鉴定培养细胞,绘制细胞生长曲线,运用BrdU方法和细胞凋亡原位染色观察传后细胞生长状况及不同剂量TGF－β1对细胞增殖与凋亡的作用。结果 培养细胞角色蛋白、PSA染色阳性。TGF－β1抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡,作用与剂量成正比,EGF与TGF－β1相互减弱对方的作用。结论 TGF与TGF－β1对前列腺上皮细胞增殖与凋亡状态起重要的调节作用。     

雄激素和转化生长因子β1协同调节前列腺基质细胞增殖和分化

目的：探讨双氢睾酮（DHT）和转化生长因子β1（TGF－β1）对体外培养的前腺基质细胞增殖和分化的影响及前列腺基质增生的机制。方法：体外培养人前列腺基质细胞，加入DHT和TGF－β1，采用MTT法检测细胞增殖，免疫组化、RT－PCR方法检测平滑肌细胞特异性标记蛋白的表达。结果：对平顶期的前列腺基质细胞，单独应用DHT或TGF－β1无显著刺激增殖作用（P＞0．05）；DHT和TGF－β1联合应用时，可显著刺激基质细胞增殖（P＜0．01），TGF－β1可使前列腺基质细胞中平滑肌细胞特异性标记蛋白的表达增加（P＜0．05），与DHT联合应用时这种作用更强。结论：DHT和TGF－β1具有协同促进前列腺基质细胞增殖和分化的作用。TGF－β1和雄激素可能是前列腺基质增生和平滑肌细胞过度增殖的重要诱因。     

正常前列腺基质细胞抑制前列腺癌细胞系PC-3增殖的体外实验研究

目的 探讨前列腺癌发病的基质－上皮相互作用机制。方法 体外培养前列腺基质细胞和前列腺癌（Pca)细胞系PC－3。分别取已用于培养液作为另一种细胞的条件培养液,观察条件培养液对细胞增殖的影响。用双层软琼脂分析法混合培养前列腺基质细胞和PC－3细胞。用MTT法检测不同浓度TGFβ1对PC－3细胞增殖率的影响。用免疫组化SP法研究基质中平滑肌细胞的比例。用RT－PCR方法检测基质细胞TGFβ1的表达。结果 PC－3细胞的增殖在混合培养时受到抑制。混合培养3周PC－3细胞的增殖率对照组的41％（P＜0．01）。PC－3细胞的增殖在加入TGFβ1后受到抑制,随TGFβ浓度的增加,对PC－3细胞的抑制作用增强。随TGFβ1作用时间的延长,相同浓度的TGFβ1抑制效应更显著（P＜0．01）。前列腺基质细胞表达大量的TGFβ1。结论 前列腺基质细胞可以通过分泌TGFβ1抑制PC－3的增殖。前列腺癌的基质可能存在病变,使癌变的上皮逃脱基质的抑制作用。     

增殖细胞核抗原反义真核表达载体的构建及其在膀胱癌EJ细胞中的表达

目的：寻求肿瘤反义基因治疗的新途径。方法：应用分子克隆技术构建寻殖细胞核抗原（PCNA）基因反义真核表达载体,转染膀胱癌EJ细胞,通过免疫荧光,逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）,噻唑蓝（MTT）比色法,克隆形成实验动态检测转染1－7d后癌细胞PCNA基因表达和体外增殖活性。结果：所获反义表达载体pLAPSN转染可使癌细胞PCNA蛋白,mRNA表达水平分别抑制16．74％－84．21％（P＜0．05）,23．27％－86．15％（P＜0．05）,增殖活性抑制27．91％－62．07％（P＜0．01）,克隆形成能力降低50．81％（P＜0．01）。结论：应用反义RNA技术阻断PCNA基因的表达,能有效抑制癌细胞的体外增殖活性,是膀胱癌基因治疗的合理策略之一。     

反义核酸对大鼠肝纤维化转化性生长因子β受体表达的调节作用

目的探讨反义转化生长因子β（TGF－β）RNA对其受体表达的调节及其防治肝纤维化的机制。方法将反义TGF－β1基因导入CCl_4诱导的大鼠纤维化肝脏,用原位杂交方法观察TGF－β受体的表达。结果纤维化肝脏TGF－β1型受体主要分布于汇管区周围及纤维间隔内和散在分布于肝实质内,Ⅱ型受体则主要分布于肝脏小叶、纤维间隔及汇管区,且均较正常组增加。经转基因处理后大鼠纤维化肝脏Ⅰ、Ⅱ型受体的分布未发生改变,但阳性反应明显减弱,阳性细胞数量明显减少,纤维间隔明显减少。结论反义TGF-1基因能下调其Ⅰ、Ⅱ型受体的表达,以抑制贮脂细胞的活化和肝细胞的凋亡,从而减缓肝纤维化的发展。     

转染人高迁移率族蛋白1反义基因对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的　探讨反义高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因对人胰腺癌细胞的抑制作用。方法　应用分子克隆技术构建反义HMGB1基因真核表达载体pcDNA3 1/anti HMGB1,用脂质体法将其导入人胰腺癌细胞PANC 1中,经G4 18筛选获得可稳定表达反义HMGB1的人胰腺癌细胞克隆,通过逆转录聚合酶链反应、免疫印迹法和噻唑蓝比色法检测转染4 8h后胰腺癌细胞HMGB1基因表达和体外增殖活性的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期情况。结果　获得了pcDNA3 1/anti HMGB1真核表达质粒,pcDNA3 1/anti HMGB1转染可使PANC 1细胞HMGB1mRNA和蛋白表达水平显著降低(P <0 .0 1)、肿瘤细胞增殖能力明显受到抑制(P <0. 0 1) ,并出现细胞周期G1期阻滞、凋亡细胞百分数增加。结论　反义HMGB1基因的表达能有效抑制胰腺癌细胞的体外增殖并促进细胞凋亡。     

反义转化生长因子β1表达载体的构建及其对骨肉瘤细胞增殖活性的影响

目的:构建反义TGFβ1基因,探讨阻断肿瘤细胞TGFβ1自分泌环对细胞增殖活性的影响.方法:采用RT-PCR获取人TGFβ1 cDNA后,构建反义TGFβ1表达载体pcDNA3-TGFβ1(-).将pcDNA3-TGFβ1(-)转染骨肉瘤细胞MG-63,采用流式细胞仪检测阻断TGFβ1自分泌环对肿瘤细胞增殖活性的影响.结果:pcDNA3-TGFβ1(-)转染骨肉瘤细胞后,反义基因转染细胞MG-TGFβ1(-)的G0/G1期细胞从56.2%和60.1%增至71.6%,S期细胞从19.1%和17.8%降至12.9%,细胞增殖活性明显降低.结论:通过阻断TGFβ1自分泌环以降低骨肉瘤细胞表达的TGFβ1,可以明显抑制肿瘤细胞增殖活性.进一步的深入研究,必将为骨肉瘤疗效的提高开辟新的研究方向.     

P物质上调正常人真皮成纤维细胞TGF-β1的mRNA表达

目的 探讨神经肽P物质（SubstanceP,SP）与瘢痕形成间的调控关系。方法 体外分离培养正常人真皮成纤维细胞，分别加入SP及其受体特异性拮抗剂L－703，606乙酸盐，MTT法测定细胞生长增殖量；采用细胞爬片法培养细胞，加入SP对细胞作用后，应用TGF－β1mRNA特异性探针行细胞原位杂交，计算细胞的TGF－β1mRNA阳性表达率，并经图像分析测定阳怀细胞TGF－β1mRNA的表达强度，分析SP与真皮纤维细胞TGF－β1mRNA表达间的关系。结果 SP可促进体外培养的正常人真皮成纤维细胞的生长，其作用与SP浓度呈现依赖关系，当浓度达到25ng/ml时，刺激细胞生长的速度达最大值，可使细胞较对照组提前4d融合；正常人真皮纤维细胞受25ng/ml时时，刺激细胞生长的速率达最大值，可命名细胞较对照组提前4d后即可见细胞表达TGF－β1mRNA的阳性率及强度均显著增加；SP对正常人真皮纤维细胞的上述效应，均可被其受体拮抗剂L－703，606乙酸盐所抑制。结论 SP可促进正常人真皮纤维细胞的生长增殖，同时上调细胞的TGF－β1mRNA表达；提示SP可能为皮肤损伤后痕形成过程中启动成纤维细胞表型转化的重要调节因子。     

反义转化生长因子β1表达载体的构建及其对骨肉瘤细胞增殖活性的影响

目的：构建反义TGFβ1基因，探讨阻断肿瘤细胞TGFβ1自分泌环对细胞增殖活性的影响。方法：采用RT-PCR获取人TGFβ1cDNA后，构建反义TGFBl表达载体pcDNA3-TGFβ1(-)。将pcDNA3-TGFβ1(-)转染骨肉瘤细胞MG-63，采用流式细胞仪检测阻断TGFβ1自分泌环对肿瘤细胞增殖活性的影响。结果：pcDNA3-TGFβ1(-)转染骨肉瘤细胞后，反义基因转染细胞MG—TGFβ1(-)的G0／G1期细胞从56．2％和60．1％增至71．6％，S期细胞从19．1％和17．8％降至12．9%，细胞增殖活性明显降低。结论：通过阻断TGFβ1自分泌环以降低骨肉瘤细胞表达的TGFβ1，可以明显抑制肿瘤细胞增殖活性。进一步的深入研究，必将为骨肉瘤疗效的提高开辟新的研究方向。     

反义调控DNA甲基转移酶1基因对人胆管癌细胞生长的抑制效应

目的观察转染反义DNMT1基因真核表达载体对人胆管癌细胞QBC-939生长的影响,初步探讨DNMT1基因在胆管癌发生中的表遗传学机制。方法将构建好的反义DNMT1基因真核表达载体用脂质体介导法转入人胆管癌细胞QBC-939,Western blot检测转染前后DNMT1蛋白的表达变化,MTT法和软琼脂克隆形成试验观察各组细胞的生长增殖能力,流式细胞术观察细胞生长周期及凋亡率的变化。结果（1）Western blot检测证实转染反义基因能使DNMT1蛋白表达水平降低;（2）转染反义DNMT1基因能抑制QBC-939的生长曲线,并使其软琼脂克隆形成率从（38．020±4．120）％减少至（14．860±2．129）％,差异有显著性意义（P=0．000）;（3）转染反义DNMT1基因能影响QBC-939的细胞周期,使之阻滞于G1期,细胞凋亡率从（1．63±0．27）％增加到（6．19±0．78）％,差异亦有显著性意义（P=0．000）。结论通过转染反义DNMT1基因真核表达载体,可下调DNMT1在QBC-939细胞中的表达水平,并能抑制胆管癌细胞的生长和增殖,促进凋亡的发生,提示DNMT1可能通过甲基化途径与胆管癌的发生有关。     

转化生长因子-β1和胰岛素样生长因子-1对人髓核细胞体外增殖活性的影响

目的：研究转化生长因子-β1（TGF—β1）和胰岛素样生长因子-1（IGF—1）单独及联合应用对人髓核细胞体外增殖活性的影响，并观察其量效和时效关系。方法：体外分离培养人髓核细胞．将传2代细胞种于96孔板，采用噻唑蓝（MTT）比色法，观察TGF—β1和IGF—1在1％和10％血清浓度下对人髓核细胞体外增殖的调节作用及其剂量、时间与作用效果的关系。结果：在1％血清条件下，IGF—1的作用不显著，TGF—B1具有促增殖作用。在10％血清条件下，TGF—B1和IGF—1均能提高细胞的增殖活性，并且在有效浓度范围内呈剂量效应关系，TGF—B1的作用强于IGF—1。二者联合应用效果更显著。结论：TGF—B1和IGF—1均能不同程度地促进入髓核细胞的体外增殖，其效应在一定范围内与剂量和时间呈正相关．联合应用促进增殖作用更显著。     

反义转化生长因子βⅠ型受体表达质粒对大鼠肝星状细胞功能的影响

目的观察反义转化生长因子(TGF)βⅠ型受体(TβRⅠ)表达质粒对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖及细胞外基质分泌的影响.方法双酶灌注和梯度离心法分离大鼠HSC,将构建的反义TβRⅠ真核细胞表达质粒与pcDNA3空质粒经脂质体转染培养活化的HSC,通过RT-PCR、Western印迹检测外源导入质粒在HSC中的表达,采用MTT法、3H-TdR掺入法检测细胞增殖情况,ELISA法检测TGF-β1含量变化,并应用Western印迹检测HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达.结果反义TβRⅠ真核细胞表达质粒可抑制活化HSC中TβRⅠ mRNA及蛋白表达.与pcDNA3转染组相比,反义TβRⅠ质粒表达可抑制HSC增殖(P＜0.01),降低TGF-β1含量(P＜0.05),抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌(P＜0.05).结论重组反义TβRⅠ表达质粒可在HSC中获得较好表达,并可显著抑制HSC增殖及细胞外基质分泌.     

Survivin反义寡核苷酸转染对肝门部胆管癌细胞FRH-0201侵袭性的影响

目的：观察Survivin反义寡核苷酸转染对肝门部胆管癌细胞FRH-0201侵袭能力的影响。方法：针对Survivin基因序列设计合成反义寡核苷酸,阳离子脂质体包裹转染胆管癌细胞株FRH-0201。观察转染后癌细胞生长增殖情况,酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶抑制因子-2（TIMP-2）含量,侵袭小室检测细胞侵袭能力的改变。结果：反义转染组细胞生长及增殖减缓并趋向凋亡,细胞上清液中MMP-2因子较正义转染组及阴性对照组少,且差异有统计学意义（P〈0.05）,TIMP-2因子较另2组有所增加,且差异有统计学意义（P〈0.05）,Transwell实验中反义转染组穿过小室细胞数目较另2组减少（P〈0.05）。结论：Survivin反义寡核苷酸转染可有效抑制肝门部胆管癌细胞增殖,并降低癌细胞的侵袭能力。     

反义缺氧诱导因子-1α对胰腺癌生长转移的影响

目的观察反义缺氧诱导因子（HIF）-1α对胰腺癌生长、转移的影响及其与β1-integrin的关系。方法缺氧条件下（0.5％O2）体外培养4h，未转染反义HIF-1α质粒的BxPc-3细胞设为缺氧对照组；常氧条件下体外培养，未转染反义HIF-1α质粒的BxPc-3细胞设为常氧对照组；缺氧条件下（0．5％O2）体外培养4h，稳定转染反义HIF-1α质粒的BxPc-3细胞设为实验组。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot检测HIF-1α和β1-integrin的表达情况。Transwell侵袭室方法检测BxPc-3细胞侵袭能力。裸鼠皮下接种BxPc-3细胞8周后，观察各组肿瘤生长情况。结果实验组HIF-1α和β1-integrin的表达明显降低，迁移的细胞数远少于对照组（P〈0．05）；实验组肿瘤的体积、重量、生长速度远低于对照组（P〈0.05）。结论反义HIF-1α可能通过阻断β1-integrin的表达而抑制胰腺癌的生长和转移。因此，阻断HIF-1α的表达为胰腺癌基因治疗提供了新途径。     

腺病毒介导反义c-myc增强骨肉瘤细胞对顺铂化疗敏感性的实验研究

目的构建表达反义cmyc的重组腺病毒,探讨重组腺病毒介导反义cmyc转染的人骨肉瘤MG63细胞对顺铂化疗敏感性的影响。方法应用基因重组技术,将约720bp的人cmyccDNA反向克隆到腺病毒载体,经重组、扩增、病毒包装后构建表达反义cmyc的重组腺病毒(AdAscmyc),并在体外转染骨肉瘤MG63细胞,采用瑞士染色、吖啶橙染色、蛋白免疫印迹(WesternBlot)、细胞体外增殖抑制试验(MTT)、流式细胞仪(FCM)等观察细胞形态、检测cmyc蛋白表达、瘤细胞体外增殖抑制、凋亡及细胞周期,分析AdAscmyc体外转染的骨肉瘤MG63细胞对顺铂化疗敏感性。结果成功构建AdAscmyc,滴度可达2×109pfu/ml,体外转染MG63细胞48h后,可降低cmyc蛋白表达,并与浓度为2.0、5.0μg/ml的顺铂作用2h后,可抑制MG63细胞的体外增殖,抑制率分为33.4%、54.2%,与对照腺病毒(AdLacZ)转染组相比差异有统计学意义(P<0.05),FCM检测证实AdAscmyc的转染可诱导骨肉瘤细胞凋亡,且顺铂治疗后凋亡比例增加,细胞周期分析显示AdAscmyc转染的骨肉瘤细胞出现G2/M期阻滞。结论腺病毒介导反义cmyc能诱导骨肉瘤MG63细胞凋亡并增加MG63细胞对顺铂化疗敏感性。     

体外培养条件下rhBMP—2和TGF—β对兔MSC分化和增殖的影响

目的：观察rhBMP－2,TGF－β等因子诱导在基质细胞向成骨细胞分化及增殖的情况。方法：通过体外培养兔骨髓基质干细胞（Bone Marrow Stromal Cells,MSC）稳定传代后,采取分别单独加入rhBMP－2,TGF－β等诱导因子方法观察MSC的成长分化,采用MTT方法以及碱性磷酸酶染色的方法观察上诉因子对细胞生长分化和增殖的影响。结果：当rhBMP－2的浓度在400－800ng/ml时对兔MSC的增殖和分化有明显的促进作用,其主要作用为促进分化,TGF－β对MSC的增值和分化也有明显的促进作用,其主要作用为促进MSC的增殖。结论：rhBMP－2和TGF－β可以作为兔骨髓基质细胞较理想的诱导因子,促进MSC在体外的增殖和分化,为体外培养组织工程化骨提供较好的种子细胞。     

阻断转化生长因子-β受体信号转导降低瘢痕疙瘩细胞转化生长因子-β1自分泌的研究

目的 研究瘢痕疙瘩成纤维细胞转化生长因子－β1（TGF－β1）的自分泌现象和阻断TGF－β受体信号转导对TGF－β1自分泌的调控。方法 组织块法体外培养瘢痕疾疙瘩成纤维细胞，加入重组人源（rh）TGF－β1（5mg/L）或含缩短型TGF－βⅡ型体的重组腺病毒（50pfu/cell），并用Northern印迹观察它们对TGF－β1极其Ⅰ、Ⅱ型受体的基因调控。结果 rhTGF－β1能上调TGF－β1（30％－50％）和Ⅰ型受体（30％－90％）的基因表达，但不影响Ⅱ型受体的基因表达。短型TGF－βⅡ型受体在瘢痕疙瘩细胞的过度表达减少细胞TGF－β1（50％－65％）和Ⅰ型受体（21％－55％）的基因表达，但不影响Ⅱ型受体的基因表达。结论 瘢痕疙瘩细胞存在TGF－β1的自分泌现象，而缩短型TGF－βⅡ型受体的过度表达可以通过阻断TGF－β的信号转导来降低TGF－β1的自分泌。