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1.
背景:脂肪源性干细胞在体外易于培养,增殖快,具有多向分化潜能。目的:构建一种体外分离培养SD大鼠脂肪源性干细胞的方法,并对其部分生物学特性与表型进行分析。方法:切取SD大鼠腹股沟脂肪垫,应用胶原酶Ⅰ消化,分离大鼠脂肪源性干细胞,进行体外培养、传代,倒置显微镜观察细胞的生长增殖及形态变化,诱导成骨、成脂,分别行碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色及油红O染色,绘制生长曲线及用流式细胞仪检测细胞表面标记。结果与结论:体外培养的脂肪源性干细胞呈梭形,增殖活跃,传代后形态均一,多次传代后细胞仍保持较强增殖能力,生长曲线呈"S"型。成骨诱导实验组碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色阳性;成脂诱导实验组油红O染色阳性;对照组均为阴性。细胞CD29,CD44,CD105表达阳性,CD31,CD45表达阴性。提示SD大鼠腹股沟脂肪垫分离的脂肪源性干细胞在体外易于分离培养和传代扩增,特定条件下可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,并表达间充质干细胞相关的表型。  相似文献   

2.
背景: 人脐带间充质干细胞含量丰富,较为原始,分化能力强,免疫原性低,是细胞治疗的理想靶细胞.目的: 体外分离培养脐带间充质干细胞并将其定向诱导为成骨细胞.方法: 无菌条件下培养脐带间充质干细胞,分为诱导组和对照组,诱导组用成骨诱导液处理、对照组为干细胞培养液处理.倒置光显微镜观察细胞形态,MTT法测细胞增殖,荧光双染法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期与细胞表面标记.诱导后:检测碱性磷酸酶,Von Kossa染色分析钙盐沉积,RT-PCR检测骨桥蛋白基因、碱性磷酸酶、骨唾液蛋白mRNA的表达.结果与结论: 传代细胞形态稳定、活力好,高标达CD44.诱导后von Kossa染色表现为阳性.碱性磷酸酶活性诱导组比对照组高(P<0.05),不同时间点比较21 d最高(P<0.05).RT-PCR显示:诱导组21,28d碱性磷酸酶mRNA表达均较与对照组增强(P<0.05).诱导组有骨唾液蛋白和骨桥蛋白基因mRNA表达.提示,人脐带间充质干细胞能够定向分化为成骨细胞.  相似文献   

3.
脐血间充质干细胞的分离培养及生物学特性   总被引:2,自引:0,他引:2  
背景:脐血富含干细胞,刺激后进入细胞周期的速度以及自泌生长因子的能力均强于骨髓及外周血干细胞。目的:建立一种分离纯化、培养扩增脐血间充质干细胞的方法,并观察体外培养脐血间充质干细胞的生物学特性。方法:密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化脐血间充质干细胞。观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,应用流式细胞仪测定细胞周期,以免疫组织化学法(SP 法)测定 CD29,CD44,CD34。采用体积分数 20%马血清诱导脐血间充质干细胞分化为脂肪细胞,以油红 O 染色鉴定;0.1 μmol/L 地塞米松,10 mmol/L β-甘油磷酸钠和 50 μmol/L 抗坏血酸诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞,以碱性磷酸酶染色鉴定。结果与结论:分离获得了高纯度贴壁生长的间充质干细胞,间充质干细胞呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养 9 代,未发生形态学改变,无衰老征象。第 3 代间充质干细胞体外可以分化为脂肪细胞和成骨细胞。提示采用淋巴细胞分离液密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,可以获得纯度较高的脐血间充质干细胞,脐血间充质干细胞体外增殖和传代能力强。  相似文献   

4.
背景:脐血富含干细胞,刺激后进入细胞周期的速度以及自泌生长因子的能力均强于骨髓及外周血干细胞。目的:建立一种分离纯化、培养扩增脐血间充质干细胞的方法,并观察体外培养脐血间充质干细胞的生物学特性。方法:密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化脐血间充质干细胞。观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,应用流式细胞仪测定细胞周期,以免疫组织化学法(SP 法)测定 CD29,CD44,CD34。采用体积分数 20%马血清诱导脐血间充质干细胞分化为脂肪细胞,以油红 O 染色鉴定;0.1 μmol/L 地塞米松,10 mmol/L β-甘油磷酸钠和 50 μmol/L 抗坏血酸诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞,以碱性磷酸酶染色鉴定。结果与结论:分离获得了高纯度贴壁生长的间充质干细胞,间充质干细胞呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养 9 代,未发生形态学改变,无衰老征象。第 3 代间充质干细胞体外可以分化为脂肪细胞和成骨细胞。提示采用淋巴细胞分离液密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,可以获得纯度较高的脐血间充质干细胞,脐血间充质干细胞体外增殖和传代能力强。  相似文献   

5.
目的:探讨脐血和骨髓单个核细胞(monocytes,MNC)体外培养过程中的生长特性及诱导贴壁细胞向成骨细胞分化。方法:分离脐血和骨髓MNC,按培养基不同分成3组:分别为MesencultTM无血清培养基。CellGRO培养基+100mL/L胎牛血清。DMEM/F12培养基+100mL/LFBS。体外培养以获得贴壁细胞。观察不同培养条件下细胞扩增的效果。获得的贴壁细胞培养基中加入地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸,诱导细胞向成骨细胞分化。检测诱导后细胞成骨细胞标志物碱性磷酸酶、I型胶原和骨钙素的表达。结果:脐血和骨髓MNC在含有血清的培养基中可以获得更多的贴壁细胞。骨髓MNC贴壁细胞形态均一,呈典型的成纤维细胞样,而脐血贴壁细胞未获得典型的成纤维细胞样细胞,混有大量的圆形细胞。骨髓中获得的细胞可以持续传代10代以上仍保持良好的增殖状态;脐血贴壁细胞最多可以传代2次,细胞总数和纤维样细胞均逐代减少。诱导后的脐血和骨髓细胞均呈碱性磷酸酶阳性,免疫组化染色显示I型胶原和骨钙素表达阳性。结论:骨髓MNC体外培养可以获得典型的间充质干细胞且可以持续多代扩增,向成骨细胞诱导后,形态和标志物检测都呈典型的成骨细胞样。脐血MNC体外培养可获得贴壁细胞,但不呈间充质干细胞样,向成骨细胞诱导后,虽形态与成骨细胞不相似,但成骨细胞  相似文献   

6.
背景:骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大.体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要.目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测.方法:通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化.结果与结论:大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上.生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃.第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达.成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性.全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能.实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义.  相似文献   

7.
背景:脂肪源性干细胞在体外易于培养,增殖快,具有多向分化潜能。目的:构建一种体外分离培养SD大鼠脂肪源性干细胞的方法,并对其部分生物学特性与表型进行分析。方法:切取SD大鼠腹股沟脂肪垫,应用胶原酶Ⅰ消化,分离大鼠脂肪源性干细胞,进行体外培养、传代,倒置显微镜观察细胞的生长增殖及形态变化,诱导成骨、成脂,分别行碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色及油红O染色,绘制生长曲线及用流式细胞仪检测细胞表面标记。结果与结论:体外培养的脂肪源性干细胞呈梭形,增殖活跃,传代后形态均一,多次传代后细胞仍保持较强增殖能力,生长曲线呈"S"型。成骨诱导实验组碱性磷酸酶、茜素红、von Kossa染色阳性;成脂诱导实验组油红O染色阳性;对照组均为阴性。细胞CD29,CD44,CD105表达阳性,CD31,CD45表达阴性。提示SD大鼠腹股沟脂肪垫分离的脂肪源性干细胞在体外易于分离培养和传代扩增,特定条件下可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,并表达间充质干细胞相关的表型。  相似文献   

8.
背景:用免疫细胞阴性筛选法可以排除造血干细胞对于间充质干细胞生长的影响,较快的获得具有表达间充质干细胞的细胞群。目的:探讨人脐静脉血间充质干细胞向成骨样细胞分化的能力。方法:用免疫磁珠阳性筛选法分离脐血间充质干细胞后进行培养。取P2代细胞行成骨诱导分化。结果与结论:人脐血间充质干细胞贴壁生长,长梭形,3周长满瓶底,传代后细胞增殖迅速。细胞表型为高表达CD44+,CD29+和CD166+。在成骨诱导后碱性磷酸酶染色阳性,Von-Kossa染色提示钙化结节形成。提示脐血间充质干细胞能够在体外分化为成骨样细胞。  相似文献   

9.
背景:目前骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化演变中的基因表达模式尚不明确.目的:观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,验证骨髓间充质干细胞是否向成骨细胞成熟分化.方法:抽取2月龄新西兰大白兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞,用矿化诱导培养基(DMEM/F12、地塞米松1×10<'-8> mmol/L、β-磷酸甘油钠0.01 mol/L、维生素C 0.05 g/L)进行成骨诱导培养,用反转录一聚合酶链反应方法检测诱导培养后第一二代骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,并对该骨髓间充质干细胞表面抗原CD44进行鉴定.结果与结论:经矿化诱导培养基诱导培养后,第一二代骨髓间充质干细胞阶段性表达碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因;第1代骨髓间充质干细胞抗原CD44阳性率达44.4%.提示兔骨髓间充质干细胞在体外矿化诱导培养中逐渐向成骨细胞分化,分别于诱导后第一二代细胞中阶段性顺序表达成骨细胞特异性基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素,该细胞己具备成骨细胞特征,为揭示骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中基因表达机制提供了实验依据.  相似文献   

10.
郭若霖  温学红  程瑞芳  王学谦 《中国临床康复》2004,8(32):7122-7123,i002
目的:探讨脐血和骨髓单个核细胞(monocytes,MNC)体外培养过程中的生长特性及诱导贴壁细胞向成骨细胞分化。方法:分离脐血和骨髓MNC,按培养基不同分成3组:分别为Mesencult^TM无血清培养基。CellGRO培养基 100mL/L胎牛血清。DMEM/F12培养基 100mL/L FBS。体外培养以获得贴壁细胞。观察不同培养条件下细胞扩增的效果。获得的贴壁细胞培养基中加入地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸,诱导细胞向成骨细胞分化。检测诱导后细胞成骨细胞标志物碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙素的表达。结果:脐血和骨髓MNC在含有血清的培养基中可以获得更多的贴壁细胞。骨髓MNC贴壁细胞形态均一,呈典型的成纤维细胞样,而脐血贴壁细胞未获得典型的成纤维细胞样细胞,混有大量的圆形细胞。骨髓中获得的细胞可以持续传代10代以上仍保持良好的增殖状态;脐血贴壁细胞最多可以传代2次,细胞总数和纤维样细胞均逐代减少。诱导后的脐血和骨髓细胞均呈碱性磷酸酶阳性,免疫组化染色显示Ⅰ型胶原和骨钙素表达阳性。结论:骨髓MNC体外培养可以获得典型的间充质干细胞且可以持续多代扩增,向成骨细胞诱导后,形态和标志物检测都呈典型的成骨细胞样。脐血MNC体外培养可获得贴壁细胞,但不呈间充质干细胞样,向成骨细胞诱导后,虽形态与成骨细胞不相似,但成骨细胞的标志物表达均呈阳性。  相似文献   

11.
目的:研究体外培养的成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)在特定的条件下定向诱导分化为成骨细胞,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法:从骨髓血中提取hMSCs,在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养,以流式细胞仪检测hMSCs的表面抗原表达.传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基培养,相差显微镜观察并绘制生长曲线.免疫组化检测Ⅰ型胶原、骨钙素.NAP法碱性磷酸酶染色、vonKossa法钙结节染色.结果:hMSCs增殖活跃,CD105、CD44表达阳性, CD14、CD34和CD45阴性.诱导培养后碱性磷酸酶、钙结节、Ⅰ型胶原和骨钙素染色阳性.结论:hMSCs取材方便,易诱导分化为成骨细胞,是研究骨组织工程的理想种子细胞.[  相似文献   

12.
小鼠胚胎干细胞向成骨样时段性细胞分化的形态学特点   总被引:1,自引:0,他引:1  
背景:纳米羟基磷灰石具有良好的生物活性和相容性,在体外可与细胞短时间内形成紧密结合,是骨组织工程可植入性的材料。目的:观察小鼠胚胎干细胞分化为成骨样时段性细胞的形态学特点。方法:取C57小鼠胚胎干细胞进行培养,将P3胚胎干细胞制备拟胚体。通过碱性磷酸酶、免疫组织化学OCT-4、SOX2、NANOG对原代胚胎干细胞进行鉴定;通过茜素红S、Ⅰ型胶原、冯库萨染色对成骨诱导后的细胞(L-维生素C、β-磷酸甘油、地塞米松)进行检测;扫描电镜观察与纳米羟基磷灰石材料复合培养时细胞的形态及增殖情况。结果与结论:拟胚体贴壁后7d,各组碱性磷酸酶表达即发生变化,14d后碱性磷酸酶表达逐渐增加,光镜下可见轮廓清晰大小不等的绿色结节。茜素红S染色镜下可见橙红色、边界清晰和直径大小不等的结节。冯库萨染色14d可见细胞团内有黑色沉淀,21d后黑色沉淀面积增大。胚胎干细胞与纳米羟基磷灰石材料体外复合培养1,3,5,7,10d,细胞大部分呈细胞团样生长。提示在维生素C、β-磷酸甘油、地塞米松共同作用下,有效促进了胚胎干细胞成骨细胞的产生,胚胎干细胞与支架材料复合培养结合程度高,可用来构建组织工程骨。  相似文献   

13.
背景:获得足够量高纯度的成骨细胞比较困难,因此掌握简单而快速提取成骨细胞并进行培养鉴定势在必行。目的:应用组织块法对SD大鼠成骨细胞的体外培养与鉴定。方法:取新生(〈24h)SD大鼠颅骨,去除周围多余的组织,将剔净颅骨剪成1mm3大小的碎块,分别用常规方法和组织块法(改良)方法进行成骨细胞培养,从形态学、碱性磷酸酶和茜苏红染色等方法鉴定。结果与结论:利用改良方法培养的细胞具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶呈阳性染色,茜素红染色后有矿化结节的形成。组织块法培养的成骨细胞具有典型的成骨细胞成分单一、细胞培养时间短、数量、纯度、密度均一致,从而的得到稳定的成骨细胞系,为进行体外实验建立了良好的平台。  相似文献   

14.
背景:目前有关脐血间充质干细胞的生物学特性及分化能力的研究较少。目的:观察人脐血间充质干细胞的生物学特性,及其向成骨、成脂肪细胞分化的能力。方法:从不同胎龄脐血中分离间充质干细胞,对其进行原代和传代培养,并诱导其向成骨及成脂肪细胞分化。结果与结论:倒置相差显微镜下见分离培养的脐血间充质干细胞贴壁生长,呈成纤维细胞样外观,细胞呈螺旋状排列;透射电镜下可见脐血间充质干细胞胞核比例大,细胞器少,为低分化细胞;原代及传代培养的脐血间充质干细胞生长曲线均呈S型,第3,5代细胞增殖能力最强,低胎龄的脐血间充质干细胞集落形成能力最强。流式细胞仪检测结果显示,脐血间充质干细胞稳定表达间充质干细胞相关抗原CD29,CD44和CD90,不表达造血细胞标志CD34和CD45。成骨诱导后3周,碱性磷酸酶染色为强阳性,茜素红染色可见大量钙化基质的形成;成脂诱导3周,油红O染色可检测到胞质中脂滴的形成。提示脐血间充质干细胞具有间充质干细胞的形态特征、生长增殖特点及细胞表面标志物等生物学特性,可向成骨细胞及脂肪细胞分化。  相似文献   

15.
背景:研究表明26RFa在骨形成、痛觉、内分泌、心血管以及能量代谢等方面都有重要的调节作用。目的:观察26RFa在成骨培养体系中对人骨髓间充质干细胞增殖分化的影响。 方法:通过MTT实验,以此确定26RFa对人骨髓间充质干细胞是否有促增殖作用及其起作用的最大活性浓度;将人骨髓间充质干细胞接种于6孔培养板上,实验分为2组:实验组含有10-11mol/L的26RFa,对照组不含26RFa。取成骨诱导8,12,16 d细胞用碱性磷酸酶试剂盒测定细胞内碱性磷酸酶活性;成骨诱导21,28 d后行茜素红染色和Von Kossa染色,计算每张玻片钙化结节数,Western blot检测cbfa1的表达。 结果与结论:成骨诱导8,12,16 d后细胞内碱性磷酸酶活性实验组高于对照组(P〈0.05,P〈0.01,P〈0.05);21,28 d后茜素红染色和Von Kossa矿化结节数实验组均高于对照组;实验组细胞cbfa1表达明显高于对照组(P〈0.05)。说明在适宜的培养条件下,26RFa可促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。  相似文献   

16.
背景:组织工程支架材料表面的微观和亚微观结构对细胞的黏附与生长有很重要的影响。利用纳米技术和三维造孔技术制备的纳米晶羟基磷灰石,胶原骨模仿了天然骨的成分与微结构特征。目的:观察体外培养的人骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石,胶原骨的细胞相容性。设计、时间及地点:单一样本观察,于2005-09/2006—12在江苏大学医学技术学院完成。材料;纳米晶羟基磷灰石,胶原骨由清华大学材料科学与工程系研制。人骨髓间充质干细胞由健康成年志愿者自愿捐献,受试者对实验内容知情同意。方法:全骨髓法体外培养骨髓间充质干细胞,应用成骨诱导剂(地塞米松、维生素C、β-磷酸甘油、碱性成纤维细胞生长因子)诱导向成骨细胞表型转化。将第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石,胶原骨复合培养14d。主要观察指标:通过碱性磷酸酶组织化学染色、Von Kossa染色鉴定诱导培养的成骨细胞的细胞学特性。通过倒置显微镜、扫描电镜观察细胞生长及其在纳米晶羟基磷灰石,胶原骨上的生长情况。结果:原代培养的骨髓细胞增殖迅速,10~12d左右即可稳定传代,传代细胞7-9d即可传代。经诱导培养的细胞碱性磷酸酶组织化学染色阳性,Von Kossa染色阳性,可见钙化的基质沉积,呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。构建的骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石/胶原骨共培养模型中,细胞可在纳米晶羟基磷灰石,胶原骨表面良好贴壁。复合培养8d,分布于支架材料上的细胞大量增殖、分泌细胞外基质。复合培养14d,大量细胞在材料表面和孔隙中生长,细胞之间广泛存在突起连接。结论:纳米晶羟基磷灰石肢原骨适合种子细胞的贴附、生长和增殖,细胞相容性良好。  相似文献   

17.
目的 探讨兔骨髓基质细胞(BMSCs)的体外分离培养及定向诱导成骨的方法。方法 选择10周龄新西兰兔,抽取其股骨大转子部骨髓,体外分离纯化得到BMSCs,再利用条件培养液将其向成骨方向定向诱导培养。采用碱性磷酸酶(ALP)和冯库萨(Von Kossa)染色方法,鉴定其成骨性能。结果 BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖,经ALP和Yon Kossa染色证实其有成骨潜能。结论 兔BMSCs的体外培养增殖能力强,能诱导分化为成骨细胞,可以作为骨组织工程的种子细胞。  相似文献   

18.
背景:羊水细胞已广泛应用于与基因突变有关疾病的产前诊断,但目前关于羊水采源胎儿间充质干细胞的分离培养、细胞表面特征鉴定、细胞分化及其应用前景的文献并不多见.目的:体外诱导孕中期羊水来源的胎儿间质干细胞向成骨细胞方向分化.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-08/2006 05在新华医院实验中心完成.材料:10例羊水标本取自孕18-22周行产前诊断或流产的孕妇,取前均征得孕妇本人同意.方法:采用机械手段挑取孕中期羊水细胞培养体系中的胎儿间充质干细胞集落,体外培养扩增.取第3代胎儿间充质干细胞,以100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸和50 mg/L维生素C持续诱导14 d.主要观察指标:免疫组化染色检测碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原的表达,Western Blot蛋白印记法检测Ⅰ型胶原蛋白的表达,VonKossa染色法检测钙结节形成能力,激光共聚焦显微镜检测细胞骨架蛋白形成.结果:分离出的胎儿间充质干细胞为CD44和HLA-ABC阳性,CD34、CD45、HLA-DR阴性,符合间充质干细胞特点.成骨诱导14 d后,细胞碱性磷酸酶染色阳性率达91%,Ⅰ型胶原阳性率达87%;表达Ⅰ型胶原蛋白:随诱导时间的延长钙结节逐渐增多、增大;镜下可见细胞胞质中的微丝呈绿色荧光,细胞周围的微丝形成致密的周围束.结论:羊水来源的胎儿闻充质干细胞可以分化为成骨细胞,且与典型的成骨细胞具有相似的形态学和生物学特征.  相似文献   

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