小鼠及人源化鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体的表达与纯化

目的：表达并纯化小鼠及人源化鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体,并初步分析比较两者的体外生物活性。方法;经ＤＮＡ重组的构建重组表达质粒,经ＩＰＴＧ诱导,在大肠杆菌中高表达两种单链抗体,用８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解包涵体后经ＩＭＡＣ纯化表达产物,并用凝血酶切除Ｎ端融合的（Ｈｉｓ）６,纯化的表达产物经复性后ＥＬＩＳＡ检测其活性,结果：两种单链抗体在大肠杆菌中表达量占全菌蛋白的５０％以上,经变性,纯化后纯度可达９７％     

沙门菌属pad蛋白的原核表达及抗原性的鉴定

目的在大肠杆菌中表达沙门菌属pad蛋白,纯化后制备兔抗pad抗体。方法利用PCR方法从肠炎沙门茵中扩增出pad基因,构建pET一32a（＋）一pad重组表达质粒;将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,筛选阳性克隆,测序鉴定后,优化IPTG浓度、诱导温度和诱导时间以诱导重组蛋白的表达;以纯化的pad蛋白免疫家兔,制备抗pad多克隆抗体并进行鉴定。结果与结论成功扩增得到pad基因,经双酶切和测序证实重组表达质粒构建成功,经过诱导条件的优化,在大肠杆菌中表达出相对分子质量为41×10。的目的蛋白;纯化的重组蛋白免疫家兔后,能够有效地刺激家兔产生特异性抗体,经琼脂糖双向扩散测定抗血清效价达到1：32以上。为进一步研制沙门茵属体外快速检测试剂打下了基础。     

人甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)表达及抗体制备

目的 重组表达及纯化人甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(betaine-homocysteine methyltransferase, BHMT)蛋白,制备BHMT多克隆抗体并对其性质进行研究.方法 TRizol法提取人HepG2细胞总RNA,RT-PCR获得BHMT基因,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切,构建重组表达载体pET-28a-BHMT,经0.5 mmol/L IPTG诱导表达,表达产物通过Ni柱亲和纯化获得重组蛋白;以重组BHMT蛋白免疫兔,获得兔多克隆抗体,并对抗体进行纯化,应用Western印迹方法分析其识别人天然BHMT蛋白的能力.结果 经测序证明,RT-PCR得到的人BHMT基因与GenBank中人的BHMT基因完全一致;构建的BHMT原核表达载体可稳定地表达可溶性人BHMT蛋白;重组BHMT蛋白免疫兔后,兔血清抗体纯化获得高纯度BHMT抗体,此抗体可以特异性地识别人肝癌组织中的天然BHMT蛋白.结论 成功重组表达并纯化人BHMT蛋白,所获得的BHMT多克隆抗体可以应用于人BHMT蛋白的检测,为研究BHMT在高同型半胱氨酸血症中的作用机制奠定基础.     

乙酰肝素酶信号肽对其活性功能的影响研究

目的:乙酰肝素酶在肿瘤转移过程中起关键作用,其信号肽在该酶翻译后处理过程中起重要作用.本研究旨在探索乙酰肝素酶在哺乳动物细胞中的表达特性及其信号肽对此酶功能活性的影响.方法:从人胎盘cDNA文库中扩增乙酰肝素酶全长编码基因,克隆入pGEM-T载体中,测序鉴定序列完全正确后,将此基因的全长和不含信号肽基因序列分别克隆入真核表达载体pcDNA4.1/Myc-His中构建pcDNA4.1/Myc-His full HPA和pcDNA4.1/Myc-His part HPA,转化COS-7细胞进行瞬时表达,分析这两种乙酰肝素酶蛋白的表达特性及功能活性.结果:在转染了乙酰肝素酶全基因的COS-7细胞裂解液中检测到该酶的功能活性及大小约53×103(Mr)的目的蛋白免疫印迹表达带,为切割激活后乙酰肝素酶羧基端大亚基与标签蛋白的融合体.在转染了敲除信号肽的乙酰肝素酶基因的COS-7细胞裂解液中测到未被切割激活的大小约65×103(Mr)的目的蛋白免疫印迹表达带,未能检测到该酶的功能活性.结论:在COS-7细胞中表达的完整的乙酰肝素酶蛋白和不含信号肽的乙酰肝素酶蛋白均位于细胞内,没有或很少被分泌到细胞外,提示该酶在正常状态下主要分布在细胞内.含信号肽的酶蛋白在翻译后处理过程中被细胞内的蛋白酶切割成2个亚基而被激活,具有功能活性.而不含信号肽的酶蛋白没有被切割而成为有活性的酶,提示乙酰肝素酶的信号肽对其翻译后加工、激活过程有重要的影响.     

重组人乙酰肝素酶多肽片段的表达与纯化

乙酰肝素酶（heparanase，HPA）是一种内源性β-葡萄糖醛酸酯酶，为迄今发现的唯一作用于细胞外基质多聚糖硫酸乙酰肝素蛋白多糖的内切酶。它能够特异性地识别硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）结构，并能将其降解为含10—20个糖单位的寡糖链。近20余年，有关乙酰肝素酶的研究表明，乙酰肝素酶对机体的发育、炎症过程、血管生成、肿瘤转移均有重要的作用。目前，人们普遍关注的是恶性肿瘤的发生和发展均伴有乙酰肝素酶的高表达，这意味着：①基底膜的完整性遭到破坏，肿瘤细胞将突破局限转移至他处或穿透基底膜进入血管；②乙酰肝素酶促血管生成作用为侵袭、转移的肿瘤细胞提供了定居、生长所需营养。因此，乙酰肝素酶对肿瘤的发生、发展具有重要作用。     

肿瘤转移关键酶:人乙酰肝素酶氨基端亚基的表达纯化及鉴定

目的:乙酰肝素酶在肿瘤转移的过程中起重要作用,其氨基端小亚基蛋白(Mr为8×103)对其功能活性是不可缺少的。得到此蛋白将有助于深入研究乙酰肝素酶的功能活性。方法:我们从人胎盘cDNA文库中分离乙酰肝素酶蛋白全长编码基因,将乙酰肝素酶氨基端小亚基的基因克隆入pGE-X2TK,转化大肠杆菌进行融合表达。经发酵,纯化,复性得到乙酰肝素酶的氨基端亚基蛋白。结果:得到6.9g纯度>90%的氨基端小亚基融合蛋白。GSTpull-down实验表明,此融合蛋白可与乙酰肝素酶羧基端大亚基蛋白结合。复性后的融合蛋白可被激酶切割为GST蛋白和乙酰肝素酶氨基端亚基蛋白。结论:所得的乙酰肝素酶的氨基端小亚基蛋白为进一步研究该亚基蛋白在细胞内的免疫亚定位及功能奠定了基础。     

类鼻疽伯克霍尔德菌Omp38基因的克隆表达及表达产物抗原性鉴定

目的：克隆表达类鼻疽伯克霍尔德菌外膜蛋白Omp38,并对重组Omp38（rOmp38）蛋白的抗原性进行鉴定。方法：应用PCR技术对类鼻疽伯克霍尔德菌Omp38基因进行特异性扩增,将扩增产物克隆入表达载体pET-28a（＋）。重组表达载体经鉴定后,对重组蛋白进行诱导表达纯化,利用Western印迹对重组蛋白的抗原性进行鉴定。结果与结论：构建了pET-28a/Omp38重组表达载体,Omp38基因得到高效表达,Western印迹显示rOmp38蛋白具有较好的抗原性。     

乙酰肝素酶的表达与胰腺癌临床病理参数及肿瘤血管生成的关系

目的：检测胰腺癌标本中乙酰肝素酶及CD34表达，探讨乙酰肝素酶的表达与胰腺癌临床病理参数及与肿瘤血管生成之间的关系。方法：免疫组化SP法检测78例胰腺癌中乙酰肝素酶及CD34的表达，分析乙酰肝素酶表达与胰腺癌临床病理特征及与肿瘤微血管密度（MVD）的相关性。结果：乙酰肝素酶表达与胰腺癌转移相关，有淋巴结或远处转移者表达明显升高（P〈O．05）；同TNM分期相关，Ⅲ～Ⅳ期阳性率较Ⅱ期升高（P〈O．01）。胰腺癌中乙酰肝素酶表达阳性者MVD值明显高于乙酰肝素酶表达阴性者（P〈0．01）。结论：乙酰肝素酶在胰腺癌中高表达，同胰腺癌转移、分期及血管生成密切相关，乙酰肝素酶的表达促进了胰腺癌的转移及血管生成。     

抗A型肉毒毒素人源单链抗体的表达、纯化及结合活性分析

目的：实现特异性抗A型肉毒毒素人源单链抗体(ScFv)的表达与纯化，并进行结合活性分析．。方法：克隆单链抗体基因ScFv(VH-Linker-Vk)，利用pET22b表达载体构建重组表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG化学诱导，固相亲和层析纯化蛋白，ELISA测定其特异结合活性。结果：pET22b可稳定表达人源单链抗体基因，表达产物占全茵蛋白的25％，表达蛋白全部以包涵体形式存在于胞内。经IMAC纯化，蛋白纯度大于95％。竞争性ELISA测定结果表明，重组抗毒素在体外具有良好的活性，可竞争肉毒马血清与肉毒毒素结合。结论：采用原核表达系统可实现抗A型肉毒毒素人源单链抗体的高效表达，重组人源单链抗体具有抗原特异结合活性。     

牛蛙核糖核酸酶对体外培养的人肝癌细胞的杀伤作用

目的：利用大肠杆菌系统表达牛蛙核糖核酸酶（RC—RNase），观察其对人肝癌细胞的体外杀伤作用。方法：构建PE-q32-RC—RNase重组原核表达载体，转化人大肠杆菌BL21（DE3）plyS中并利用IPTG诱导表达。工程菌经超声碎菌、离心后，表达产物在变性条件下经Ni—NTA—agzrose亲合层析法纯化及复性，细胞毒试验检测其对体外培养的人肝癌细胞的杀伤活性。结果：经IPTG诱导后，大肠杆菌中表达的RC—RNase融合蛋白相对分子量（Mr）约为31KD。与预期大小基本相一致，主要以包涵体的形式存在。经纯化及复性后，获得纯度达到95％以上且对体外培养的人肝癌细胞具有明确杀伤活性的RC—RNase融合蛋白。结论：在大肠杆菌中表达的RC—RNase融合蛋白对体外培养的肝癌细胞具有一定的杀伤作用。     

人前列腺特异性抗原的原核表达及多克隆抗体制备

目的：建立人前列腺特异性抗原（prostate specific antigen,PSA）的可溶性大肠杆菌表达系统,获得高活性重组人PSA及多克隆抗体,为临床相关疾病的监测、诊断和治疗提供关键材料。方法：构建可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA质粒,采用化学法将pET-S1-S2-PSA质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞,IPTG诱导BL21（DE3）细胞表达rPSA,阳离子交换层析纯化rPSA,经Western印迹鉴定后免疫大耳白兔制备PSA抗体,ELISA法检测抗体效价。结果与结论：构建了可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA,获得了可溶性高表达rPSA的BL21（DE3）细胞株,并制备了可特异性结合天然PSA的抗体,其效价在1∶20000以上。     

H5N1型流感病毒M1蛋白的基因克隆与表达

目的：克隆、表达A型H5N1流感病毒基质蛋白M1,为研制新的流感快速检测方法奠定基础。方法：应用PCR方法扩增M1的全基因序列,克隆至PET32a载体上,经测序分析确认后,转化感受态大肠杆菌BL21（DE23）,经IPTG诱导表达M1蛋白后,对其表达产物进行SDS-Page和Western Bloting分析。结果：SDS-Page电泳显示M1蛋白在BL21（DE23）大肠杆菌中成功表达,Western Bloting分析显示表达产物可以与M1多克隆抗体发生特异性反应。结论：成功克隆和表达了流感病毒H5N1的基质蛋白M1,为进一步制备高滴度单克隆抗体、研制新的流感检测方法奠定了基础。     

抗A型肉毒毒素卵黄抗体的制备、纯化及活性检测

目的：制备特异性的抗A型肉毒毒素（ BoNT/A）的卵黄抗体（ IgY）并分析抗体的生物活性。方法人工合成密码子优化BoNT/A重链碳端蛋白（ AHc）基因片段,并构建含有该目的片段的重组表达质粒pTIG-Trx-AHc。诱导表达的AHc蛋白经纯化定量后免疫健康母鸡,4次免疫后通过水稀释和硫酸铵盐析法从鸡蛋中提取特异性IgY。在小鼠模型中测定纯化后IgY的中和能力。结果和结论 AHc蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,占菌体裂解液上清的20％。纯化后的IgY纯度较高,效价超过1∶100000。小鼠体内中和实验证实,IgY可完全中和20 LD50 A型天然肉毒毒素,在预防和治疗肉毒中毒表现出良好的应用前景。     

乙型脑炎病毒NS5蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的表达纯化乙型脑炎病毒非结构蛋白NS5,并制备其多克隆抗体。方法通过PCR法扩增编码NS5蛋白的全长基因,将其克隆到原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,并通过Ni柱亲和层析纯化重组蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c鼠制备多克隆抗体。采用间接免疫荧光法检测抗体效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果与结论成功获得了可溶性表达的NS5蛋白,制备了多克隆抗体,效价为1∶1000,能够特异性识别乙型脑炎病毒感染细胞中表达的NS5蛋白,为进一步研究NS5蛋白的生物学功能奠定了基础。     

HLA-B＊ 2705分子结构对其在原核细胞可溶性表达影响的研究

目的研究人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）-B＊ 2705分子结构对其在原核细胞可溶性表达的影响。方法采用RT-PCR法将HLA-B＊ 2705基因的全长、胞外区和α1、α2功能区分别进行克隆并连接到pET-32a（＋）表达载体。经IPTG诱导表达,并经超声破碎、层析和透析纯化蛋白,再经体外微量细胞淋巴毒反应检测蛋白质活性。结果成功构建3种pET-32a（＋）表达载体,经IPTG诱导后,HLA-B＊ 2705基因全长和胞外区主要以包涵体的形式表达,可溶性蛋白的量较低;而α1和α2功能区则以高效可溶性形式表达,通过体外微量细胞淋巴毒实验证实,HLA-B＊ 2705的α1和α2功能区可溶性蛋白可与HLA-B27抗体特异性结合,并成功阻断补体介导的细胞毒作用。结论α1和α2功能区能够在原核细胞中高效表达可溶性蛋白,并具有蛋白功能,而HLA-B＊ 2705基因全长和胞外区主要以包涵体的形式表达,表明蛋白质的大小和空间结构对于其可溶性表达具有重要影响。     

PIAS3在人膀胱癌及正常膀胱上皮中的表达及其意义

目的：探讨活化STAT3蛋白抑制蛋白（protein inhibitor of activated STAT3,PIAS3）在不同分级分期的人膀胱癌及正常膀胱上皮中的表达情况及其临床意义。方法：利用SP三步法免疫组织化学技术检测PIAS3在膀胱癌及正常膀胱上皮中的表达。结果：PIAS3在正常膀胱上皮的表达率和表达水平均显著低于膀胱癌组织（P=0.0000002;P=0.000003）;且表达水平随分化程度的降低而升高（P=0.00001）;在浸润性膀胱癌（T2~T4）中的表达水平显著高于其在表浅膀胱癌（Tis~T1）中的表达（P=0.02）。结论：试验结果提示,PIAS3蛋白异常表达可能与膀胱癌的发生发展关系密切;它可能成为具有潜在价值的膀胱癌标志物或者基因治疗新靶点。     

双基因重组腺病毒表达载体pAdxsi—GFP-HIF—KGF的构建及表达

目的：构建同时携带低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和角质细胞生长因子（KGF）的腺病毒载体（pAdxsi—GFP—HIF—KGF）,观察其在A549中的表达。方法：从低氧处理A549细胞中PCR扩增HIF—1αDNA,并连接到载体pShuttle—CMV—EGFP上得到重组质粒pShuttle—GFP—HIF,同时将从质粒pIRES2一EGFP—KGF扩增的KGF基因也克隆其上,获得穿梭重组质粒pShuttle—GFP—HIF—KGF。再将其重组到pAdxsi病毒骨架载体上,构建携带HIF-1仅和KGF双基因的重组腺病毒载体。观察重组腺病毒转染3_549细胞后表达情况。结果：证实携带HIF—1α和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi—GFP—HIF—KGF成功构建。其转染A549细胞后可有效表达HIF一1和KGF蛋白,48h时HIF-1蛋白表达水平为（56．36±4．53）ng／ml,KGF蛋白表达水平为（60．20±2．92）ng／ml。结论：成功构建了双基因腺病毒载体pAdxsi—GFP—HIF—KGF,其可有效转染表达,具有进一步在肺损伤防治应用的前景。     

人重组阿片受体样受体在CHO细胞稳定表达系统的建立

目的：在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞上稳定转染人重组阿片受体样受体（hORL1）,为体外高通量筛选hORL1受体作用药物及相关药物分子机制研究奠定基础。方法：用脂质体介导法将pcDNA3.1（＋）-hORL1重组质粒稳定转染到缺乏hORL1的CHO细胞中,然后用含G418的选择性培养液进行筛选,挑取耐药克隆;用放射性配体-受体结合实验进一步筛选阳性克隆,对阳性克隆受体亲和力和表达量进行分析,用[35S]GTPγS结合实验分析表达受体的功能。结果与结论：在稳定转染hORL1的克隆细胞中,[3H]伤害感受肽的Kd和Bmax值分别为（0.44±0.21）nmol/L和（0.35±0.06）pmol/mg蛋白。伤害感受肽刺激受体结合[35S]GTPγS的EC50值为3.45nmol/L。以上结果与文献报道的天然hORL1受体的特性相似,说明该细胞株表达的hORL1受体与天然的hORL1受体具有基本一致的生物学特性,证实成功建立了稳定表达人阿片受体样受体的细胞模型。     

阿托伐他汀通过激活PPARa信号通路抑制老年大鼠心肌IL-1β表达

目的：观察阻断老年大鼠心肌细胞过氧化物酶体增殖物激活型受体a（PPARα）信号通路对白细胞介素-1β（IL-1β）表达水平的影响。方法：将培养的老年大鼠心肌细胞分为空白对照组、溶剂对照组、阿托伐他汀组、PPAR拮抗剂GW6471＋阿托伐他汀组。分别加入细胞培养液、二甲基亚砜（DMSO）、阿托伐他汀、阿托伐他汀＋PPARa拮抗剂GW6471。用RT-PCR和western blot方法检测各组细胞IL-1βmRNA和IL-1β蛋白含量。结果：①与空白对照组相比,溶剂对照组大鼠心肌细胞IL-1βmRNA表达水平和蛋白含量均无显著差异（P〉0．05）;②与空白对照组相比,阿托伐他汀组IL-1βmRNA表达水平和蛋白含量均显著降低（P〈0．01）;③GW647l＋阿托伐他汀组IL-18mRNA表达水平及蛋白含量均显著高于阿托伐他汀组（P〈0．05）,但仍低于空白对照组（P〈0．05）。结论：阿托伐他汀抑制老年大鼠心肌细胞IL-1p表达的作用可能与其激活PPARα信号通路有关。     

基于HPV16的新型伪病毒对DNA特异性B细胞的杀伤研究

目的构建基于人乳头状病毒（humanpa pilloma virus,HPV）16型的新型伪病毒,并检测其对DNA特异性B细胞（R4A）的杀伤效应。方法利用昆虫杆状病毒表达系统表达病毒蛋白,在体外变性与复性过程中将病毒蛋白包装B细胞特异性启动子Igκ控制下的白喉毒素（Diphtheriatoxin,DT）A链（DT-A）基因表达型质粒DNA,形成伪病毒。转染R4A细胞,荧光显微镜和流式细胞仪检测其杀伤效应,酶联免疫法检测R4A细胞分泌抗ds-DNA抗体的滴度。结果转染R4A细胞48h后,荧光显微镜和流式细胞仪成功检测到新型伪病毒对R4A细胞的杀伤效应,R4A细胞分泌抗ds-DNA抗体的滴度明显降低。结论基于HPV16的新型伪病毒能有效特异杀伤R4A细胞,并降低抗ds-DNA抗体的滴度,为系统性红斑狼疮的治疗提供了理想的策略。