SP调制DRG分离细胞MDA-及GABA-激活电流

越来越多的资料表明；背根神经节(DRG)神经元膜存在有多种受体，而且这些受体彼此可以共存，如DRG细胞膜不仅有兴奋性氨基酸谷氨酸(Glu)受体亚型(NMDA，KA，QA／AMPA)，也有抑制性氨基酸GABAA和GABAB受体，而且还有肽类递质SP受体。这些受体既然可以共存，它们之间是否能相互作用?本文目的是研究SP对NMDA及GABA受体的调制。实验在大鼠新鲜分离的DRG神经元应用全细胞膜片钳技术进行记录，在预加SP后观察其对NMDA及GABA激活电流的影响。     

膜片钳技术结合免疫组织化学方法在同一细胞的应用

我室在以往的工作中曾提出背根神经节(DRG)神经元膜可能存在有谷氨酸(Glu)自身受体。为了确证这一推论．在技术上要求能在同一细胞证明膜受体的存在，并显示出胞内台有激活该受体的神经递质。最近我们创新了一种在同一分离的DRG细胞应用全细胞膜片钳技术证明膜NMDA受体的存在，并结合免疫组织化学方法显示胞内谷氨酸样免疫反应性(Glu-LI)，从而成功地确证了大鼠DRG神经元膜存在有NMDA自身受体．应用同一方法我们还证明了SP自身受体的存在。     

大鼠DRG神经元膜SP自身受体存在的证明

已知：P物质(SP)为初级感觉神经元小细胞(Aδ和C型细胞)所含肽类神经递质。然而有资料表明大鼠背根神经节(DRG)神经元膜存在有SP受体(Dray和Pinnock，1982)．我室最近的研究工作在大鼠DRG神经元应用细胞内(司军强和李之望，1995)及全细胞膜片钳(李之望等，1994)记录发现大多数(约90％)DRG细胞对SP敏感。因此我们推测DRG细胞膜可能存在有SP自身受体．最近我室应用电生理学方法在DRG分离细胞证明了膜NMDA受体后，结合免疫组织化学检测，在同一细胞显示胞内谷氨酸样免疫反应性(Glu-LI)，从而确证了NMDA自身受体的存在(李之望等，1994)。     

大鼠新鲜分离DRG同一神经元膜GABA、NMDA和P物质激活电流的比较

本文应用全细胞膜片钳实验技术观察到大鼠背根神经节(DRG)神经元膜上共存有GABA、NMDA和P物质受体(21/57,36.8%);在同一DRG神经元膜上就上述三种受体分别被激活后所引起的电流进行了幅值、去敏感等的比较分析;并就这三件受体被激活后可能存在的相互调制及生理意义进行了讨论.     

大鼠DRG分离细胞膜谷氨酸受体亚型及其分布

近年来陆续有报导：背根神经节(DRG)神经元膜存在有谷氨酸(Glu)受体(周小萍等，1991)及其亚型NMDA(Lovinger ＆ Weight，1988；李之望，1994；司军强和李之望，1994；Satoetal，1994；Liuetal，1994)，KA(Wong et al．1993，1994)及QA／AMPA(Huetmer et al，1990;Wong et al，1993，1994；Sato et al 1994)。本文的目的是研究DRG神经元膜Clu受体亚型的分布及其共存。实验在酶(Trypsin，Collagenase，DNase)和机械分离的大鼠DRG神经元应用全细胞膜片钳技术记录NMDA-，KA-和QA／AMPA-激活电流。     

福尔马林致痛上调大鼠DRG神经元SP与NMDA受体的表达

目的：观察DRG神经元膜SP受体与NMDA受体的表达,探讨二者在疼痛中的作用。方法：16只健康SD大鼠随机分为生理盐水（NS）组及福尔马林致痛（F）组,应用免疫荧光双标技术观察并比较两组大鼠DRG神经元膜SP受体与NMDA受体的表达的差异。结果：免疫荧光显示两组大鼠DRG神经元膜均有SP受体与NMDA受体共存。F组大鼠DRG神经元膜SP（NK1）的表达高于NS组,OD值分别为99.37±19.69（n=8）、60.10±21.65（n=8）,P〈0.05;F组大鼠DRG神经元膜NMDA（NR1）阳性产物的表达高于NS组,OD值分别为89.17±30.05（n=8）、56.31±13.75（n=8）,P〈0.05。结论：大鼠DRG神经元膜SP受体与NMDA受体有共存,福尔马林致痛大鼠DRG神经元SP受体与NMDA受体表达上调。     

L-ENK对DRG神经元膜GABR激活电流的调制

已有的资料证明：背根神经节(DRG)神经元膜存在有多种受体，其中包括GABA(GABAA及GABAB)受体和脑啡肽(ENK)受体，这两类受体均与初级传人末梢膜突触前抑制的产生有关。本文研究的目的是探索此两种受体能否在同一细胞共存?二者之间有无相互作用?实验应用全细胞膜片钳技术在大鼠新鲜分离DRG神经元上观察了预加Leu-ENK对GABA激活电流的调制作用。在受检的101个细胞中大多数对GABA敏感(99／101)，反应具有明显的浓度依赖性(10^-6～10^-3M),GABA激活电流去敏感现象非常明显，即GABA激活引起的内向流幅值急速增大，在达到峰值后尽管GABA持续存在且浓度不变但电流逐步地呈指数下降直至一稳定值为止，此激活电流可为muscimol，isoguvacine所模拟，并为bicuculline所阻断。     

Baclofen对DRG分离细胞ABA-激活电流的抑制作用

已经证明：背根神经节(DRG)神经元膜有GABAA及GABAB受体共存(Desarmenien et al，1984;林忠文和李之望，1993，美兵才等，1994)。这二种受体间是否有相互作用?最近我室用DRG神经元胞内记录研究证明GABAa受体特异性激动剂Baclofen对GABAe受体介导的膜去极化具有明显的抑制作用(司军强和李之望，1994)。本文应用全细胞膜片钳技术在大鼠新鲜分离细胞标本上确证了此一结果。实验共检测了31个细胞，其中大多数对GABA敏感。     

DA对分离DRG神经元膜ATP激活电流的增强作用

已有的资料表明：背根神经节(DRG)神经元膜存在有多巴胺(DA)受体和三磷酸腺苷(ATP)受体，二者是否可共存于同一细胞膜，它们披此间是否能相互作用?本文实验应用全细胞膜片钳技术在新鲜分离的大鼠DRG细胞证明了DA对ATP激活电流具有明显的增强作用。     

P物质增强大鼠急性分离DRG细胞膜ATP激活电流

已有的资料证明：背根神经节(DRG)神经元膜存在有SP受体(Dray和Pinnoek．1982；司军强和李之望，1995；李之望等，1995；胡宏镇等，1995)以及ATP受雄(Krishtal et al，1982；Bean et al，1990；Li et al。1993；胡宏镇和李之望，1995)。本文研究的目的是探索SP对ATP受体是否有调制作用。实验在用酶和机械分离的大鼠DRG神经元应用全细胞膜片钳技术记录ATP-激活内向电流，在所检测的85个细胞中绝大多数细胞均对ATP敏感(82／85，96．5％)。     

罗哌卡因对CCI模型鼠DRG神经元GABA 激活膜电流的影响

目的观察罗哌卡因对坐骨神经慢性压榨损伤(CCI)模型大鼠的背根神经节(DRG)神经元γ-氨基丁酸(GABA)激活膜电流的影响,探讨罗哌卡因可能存在的镇痛机制。方法运用全细胞膜片钳技术,分3组记录CCI模型大鼠手术侧、手术对侧及假手术组急性新鲜分离的DRG神经元在预灌流罗哌卡因30s后,GABA受体激活电流(IGABA)的变化。结果 (1)与手术对侧、假手术组及对照组比较,CCI模型大鼠手术侧组的热缩足潜伏期显著缩短(P<0.05);(2)CCI手术对侧组DRG神经元上不同浓度(0.1~1 000μmol/L)GABA激活电流幅值显著大于手术侧组和假手术组;(3)预灌流罗哌卡因(0.1~1 000μmol/L)后CCI模型大鼠手术侧组、手术对侧及假手术组DRG神经元对100μmol/L GABA激活电流均表现为不同程度的增强作用,并且CCI手术对侧组的增强幅度显著大于手术侧组和假手术;(4)预灌流100μmol/L的罗哌卡因后CCI模型大鼠手术侧组DRG神经元GABA(0.1~1 000μmol/L)激活电流的量效曲线左移,两EC50之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论罗哌卡因对CCI模型大鼠DRG神经元GABA激活电流具有增强作用,可能是罗哌卡因产生麻醉和镇痛作用的原因之一。     

神经病理性痛大鼠突触前抑制作用的改变及其第二信使系统变化的研究

目的观察坐骨神经慢性压榨损伤(CCI)致神经病理性痛后,大鼠背根神经节(DR G)神经元γ-氨基丁酸A受体(GABAA受体)激活电流的改变及其细胞内第二信使系统的变化。方法将SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组和CCI模型组。用穿孔膜片钳全细胞记录模式观察该3组大鼠DRG神经元GABAA受体特异性激动剂蝇蕈醇(muscimol)的激活电流,比较各组激活电流的特点;用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测该3组大鼠DR G神经元内IP3、cAMP和cGMP的浓度变化。结果正常对照组、假手术组和CCI模型组大鼠DR G神经元在不同浓度muscimol时激活电流均为内向电流且幅值均呈浓度依赖性,各组的EC50值差异无统计学意义。CCI模型组在不同浓度muscimol时激活电流幅值与正常对照组、假手术组相比均显著减小,正常对照组和假手术组在不同浓度muscimol时激活电流幅值差异无统计学意义。CCI模型组DRG神经元中cAMP和cGMP的浓度与正常对照组和假手术组相比均显著升高,假手术组和正常对照组之间差异无统计学意义。正常对照组、假手术组和CCI模型组大鼠DRG神经元中IP3的浓度差异无统计学意义。结论在坐骨神经慢性压榨损伤的过程中,受损伤侧DRG神经元GABAA受体激活电流显著减小,受损伤侧DRG神经元内cAMP和cGMP的浓度显著升高。GABAA受体功能的减弱导致的突触前抑制作用减弱可能是神经病理性疼痛产生的重要原因之一,并且这种功能的减弱是细胞内cAMP和cGMP浓度的改变共同参与调节的结果。     

帕金森病模型大鼠内侧前额叶皮层锥体神经元NMDA受体敏感性下降

目的研究6-羟多巴胺(6-OHDA)损毁大鼠黑质致密部(SNc)后内侧前额叶皮层(mPFC)中锥体神经元NMDA受体敏感性的变化。方法应用在体细胞外电生理学记录的方法观察6-OHDA损毁大鼠SNc后,全身应用NMDA受体阻滞剂MK-801后锥体神经元放电频率的变化。结果全身应用NMDA受体阻滞剂MK-801后,PD组大鼠锥体神经元放电频率无明显变化(P>0.05)。结论帕金森病模型大鼠内侧前额叶皮层锥体神经元的NMDA受体敏感性下调。     

巴氯芬对大鼠新鲜分离DRG细胞异四氢烟酸及蝇蕈醇激活电流的抑制作用

应用全细胞膜片钳技术,研究巴氯芬（baclofen）对新鲜分离的大鼠DRG神经元的作用。结果发现：GABAB受体选择性激动剂baclofen（10－5和10－4mol／L）对蝇蕈醇（muscimol）（10－5mol／L）和异四氢烟酸（isoguvacine）（5×10－5mol／L）-激活电流有抑制作用,并呈浓度依赖性。并对baclofen抑制GABAA选择性受体激动剂muscimol-和isoguvacine-激活电流反应可能的胞内转导机制进行了讨论。     

谷氨酸影响培养的海马神经元内钙变化机制

目的:研究谷氨酸对培养的大鼠海马神经元内钙信号的影响及作用机制。方法:用显微荧光测量技术监测神经元内钙信号的动态变化和谷氨酸对其的影响;阻断NMDA、AMPA受体后,观察谷氨酸对神经元内钙信号影响的变化。结果:谷氨酸使神经元内游离钙浓度明显升高,NMDA和AMPA受体拮抗剂、胞外钙离子浓度的降低均可不同程度地降低胞内游离钙离子升高幅度。结论:谷氨酸通过多种途径影响大鼠海马神经元内钙信号,激活NMDA和AMPA受体是其中的重要机制之一。     

N-甲基-D-天冬氨酸受体对清醒大鼠海马谷氨酸释放的调节作用

目的　应用清醒大鼠脑微透析技术 ,通过观察N -甲基 -D -天冬氨酸 (NMDA)受体激动剂和阻断剂对大鼠海马兴奋性氨基酸释放的影响 ,探讨NMDA受体对大鼠海马兴奋性氨基酸释放的自身调节作用。方法　Sprague-Dawley雄性大鼠 ,横跨海马背部植入一自制的透析探头 ,待大鼠清醒后 2 4h用人造脑脊液灌流 ,灌流速度为 5 μl·min-1,每 2 0min收集一次透析液 ,采用邻苯二甲醛 - β -巯基乙醇衍生化反相梯度洗脱荧光检测透析液中谷氨酸的含量。结果　海马内局部灌流NMDA 5 0 0 μmol·L-1可明显增加细胞外基础状态下谷氨酸水平。非竞争性NMDA受体拮抗剂MK - 80 1(10 0 μmol·L-1)可拮抗NMDA引起的谷氨酸释放增加作用。单独应用MK - 80 1(10 0 μmol·L-1)对基础状态下谷氨酸的水平没有影响。局部灌流NMDA受体协同激动剂甘氨酸5 0 0 μmol·L-1也可明显增加细胞外基础状态下谷氨酸的水平。局部灌流NMDA受体上甘氨酸部位的选择性阻断剂 7-氯犬尿烯酸 2 0 0 μmol·L-1可以拮抗甘氨酸引起的谷氨酸释放增加作用。结论　本研究发现兴奋性氨基酸受体NMDA受体的激活可增加海马内兴奋性神经递质的释放 ,这种NMDA受体可能存在于突触前膜 (兴奋性神经末梢膜上 ) ,即自身调节受体正反馈调节兴奋性氨基酸的释放。     

氯胺酮对大鼠脑缺血再灌注诱导海马中P53蛋白磷酸化激活的作用

目的　研究NMDA受体拮抗剂对脑缺血再灌注诱导海马中P5 3蛋白的磷酸化激活的作用。方法　采用四动脉结扎 (4 -VO)全脑缺血模型 ,利用免疫印迹法研究缺血再灌注不同时间实验大鼠海马中P5 3磷酸化激活变化 ,以及NMDA受体拮抗剂氯胺酮对P5 3磷酸化激活的作用。结果　P5 3蛋白在缺血再灌注后丝氨酸磷酸化激活增加 ,再灌注 1天后开始上升 ,3天达到高峰 ,是假手术组的 4倍。氯胺酮剂量为 5 0mg kg和 2 5mg kg时 ,能显著抑制P5 3蛋白磷酸化激活 (P <0 .0 1)。结论　NMDA受体参与介导脑缺血再灌注诱导大鼠海马P5 3蛋白的丝氨酸磷酸化激活 ,提示NMDA受体→P5 3丝氨酸磷酸化激活信号通路可能参与脑缺血再灌注神经元损伤。     

银杏叶提取物抗N-甲基-D-天冬氨酸受体介导兴奋毒性作用及机制研究

目的 观察银杏叶提取物(GBE)对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体过度激活导致海马神经元和脑损伤作用的影响并探讨其可能机制.方法 用锥虫蓝染色和乳酸脱氢酶(LDH)测定等方法评估GBE对海马神经元兴奋毒性损伤的影响,并运用全细胞膜片钳记录观察GBE对大鼠海马急性分离神经元NMDA受体激活电流的调制作用;以Longa评分、红四氮唑、神经元核蛋白和微管相关蛋白-2免疫组化染色等方法评估GBE对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用.以上GBE干预作用均与NMDA受体特异性拮抗剂MK-801作比较.结果 150μg/ml GBE预处理可有效地保护暴露于NMDA+甘氨酸的海马神经元,使细胞生存率提高到85.2%±5.2%,LDH漏出减少到87 U/L±8U/L,但此效应弱于MK-801(P＜0.05);预加0.1 mg/ml GBE可明显抑制由NMDA和甘氨酸共同作用能引起的内向电流(INMDA),抑制率为40%±17%,50 μmol/L MK-801的抑制率为78%±18%,两组差异有统计学意义(P＜0.01);用标准细胞外液进行冲洗后,GBE组INMDA可恢复至91%±8%,而MK-801组不能(P＜0.05).GBE预处理可有效缓解大鼠局灶性脑缺血损伤,其保护作用弱于MK-801(P＜0.05),但没有MK-801所引起大鼠严重的行为学毒性反应.结论 GBE预处理能对抗NMDA受体过度激活所致海马神经元毒性损伤和大鼠局灶性脑缺血损伤,可能与通过拮抗NMDA受体有关,此保护作用及其与NMDA受体结合力均弱于MK-801,无行为学毒性反应,使抗兴奋毒性临床干预成为可能.     

康脑灵胶囊对VD大鼠神经元NMDA受体表达及钙超载的影响

目的:研究康脑灵胶囊对痴呆大鼠NMDA作用机制的影响。方法:用免疫组化、原位杂交方法观察康脑灵胶囊对海马区神经元N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体及其mRNA表达的影响,以流式细胞技术检测神经元细胞内钙的含量。结果:康脑灵胶囊能抑制VD大鼠神经元NMDA受体及mRNA表达,降低钙含量。结论:康脑灵胶囊能对抗兴奋性毒性对神经元的损伤。     

音乐对大鼠学习和记忆及海马NMDA受体表达的作用

目的研究音乐对大鼠空间学习和记忆的影响及对大鼠海马内NMDA受体的表达的影响。方法用Morris水迷宫中，位置非匹配任务行为检测方法，检测音乐刺激后，大鼠学习和记忆行为能力的变化，并用免疫组织化学、PCR技术，检测大鼠海马NMDA受体及编码NMDA受体的mRNA表达的变化。结果音乐刺激后，大鼠空间记忆能力改善，信息游泳逃和选择游泳逃避潜伏期缩短，选择游泳选择正确率提高；海马神经元NMDA受体及其mRNA表达增加。这些变化以持续音乐刺激组变化最明显，生后音乐组次之，对照组变化最小。结论音乐刺激能提高大鼠空间记忆能力，能增强大鼠海马神经元NMDA受体表达，增强海马组织编码NMDA受体的mRNA表达。