Wnt3a、SFRP1、NLRP3及IL-1β联合检测对慢性牙周炎感染的诊断价值分析

目的探讨信号通路Wnt3a、分泌型卷曲相关蛋白1(SFRPl)、NLRP3及IL-1β在慢性牙周炎(CP)感染患者及健康者中的表达情况,研究Wnt3a、SFRP1、NLRP3及IL-1β联合检测对慢性牙周炎感染的诊断价值。方法选取我院口腔科2016年10月至2017年10月收治的90例CP感染患者作为研究组,按其附着丧失(cAL)程度将患者分为轻中重3个等级,同时选取该时段来我院体检的90例健康者作为对照组。采用RT-PCR和Western-Blot检测Wnt3a水平并通过酶联免疫吸附法检测SFRPl和IL-1β的含量,采用蛋白印迹法检测NLRPS的表达。结果与对照组相比,研究组Wnt3a的m RNA表达显著下调(0.41±0.02),差异有统计学意义(P0.05)。研究组Wnt3a蛋白表达显著下调(0.39±0.28),差异有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,除轻度牙周炎患者外,中、重度患者龈沟液的SFRPl浓度均明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,研究组牙周膜细胞中NLRP3和IL-1β表达上调,差异有统计学意义(P0.05)。结论慢性牙周炎患者感染可引起牙周组织中Wnt3a蛋白表达下调,龈沟液中的SFRPl含量升高,牙周膜细胞中NLRP3及IL-1β表达上调,说明Wnt3a、SFRP1、NLRP3及IL-1β联合检测在诊断慢性牙周炎感染中有重要的临床意义。     

抑制和激活Wnt信号通路对甾醇类新药NSC67657诱导HL-60细胞单核系分化的影响

目的:探讨抑制和激活Wnt信号通路在甾醇类新药NSC67657诱导HL-60细胞单核系分化中的作用和可能机制。方法:用5、10和20μmol/L的Wnt信号通路抑制剂XAV-939作用于HL-60细胞3 d,用10、20和30mmol/L的Wnt信号通路激活剂Li Cl作用于HL-60细胞1 d,应用RT-RCR和Western blot检测Wnt信号通路的下游靶点基因和蛋白表达水平,流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD14的表达和细胞早期凋亡,筛选最佳抑制浓度和激活浓度。然后用10μmol/L NSC67657分别对已经抑制及激活了的Wnt通路的HL-60细胞作用3 d。分析比较空白对照组、NSC67657单独处理组和激活/抑制剂作用后NSC67657处理组的细胞表面抗原CD14和Wnt下游靶点蛋白的表达水平。结果:20μmol/L XAV-939和20 mmol/L Li Cl能分别有效抑制和激活HL-60细胞Wnt信号通路,分别显著下调和上调cyclin D1,TCF1,c-Jun基因(P0.05)和蛋白(P0.05)的表达,且在该条件下CD14~+HL-60细胞不超过1%,没有早期凋亡发生;NSC67657单独作用HL-60细胞能下调Wnt通路下游靶点cyclin D1、TCF1和c-Jun的蛋白表达(P0.05),CD14~+细胞占(62.13±9.44)%;NSC67657作用于经XAV-939预处理的细胞,可使CD14~+细胞达到(84.17±5.39)%,cyclin D1,TCF1和c-Jun蛋白表达比单独NSC67657处理组降低更显著(P0.01);而NSC67657作用经Li Cl预处理的细胞,可使CD14~+细胞减少至(33.99±8.37)%,cyclin D1,TCF1和c-Jun蛋白表达较非处理组下降明显较低(P0.05),但高于单独使用NSC67657处理组(P0.05)。结论:20μmol/L XAV-939和20 mmol/L Li Cl作为HL-60细胞Wnt信号通路的有效抑制剂和激活剂能够分别显著下调和上调Wnt下游通路靶点基因和蛋白表达,其干预后对NSC67657诱导细胞分化的影响提示Wnt信号通路可能在NSC67657诱导HL-60细胞单核系分化中起到关键作用。     

DDK1阻断Wnt/β-catenin信号通路抑制百草枯诱导的肺成纤维细胞转分化北大核心CSCD

目的探讨抑制Wnt/β-catenin信号通路对百草枯(paraquat,PQ)诱导的人胚肺成纤维细胞(MRC-5)转分化的影响及相关分子机制。方法将MRC-5细胞分为三组,对照组(Control组):不加药物处理;PQ组:以50μmol/L的PQ刺激MRC-5细胞72 h诱导建立转分化模型;PQ+DKK1组:以50μmol/L的PQ和10 ng/mL的DKK1同时处理细胞72 h。收集细胞,采用细胞免疫荧光和Western Blot分别检测三组细胞转分化标记物α-SMA、Vimentin和Collagen I的表达水平;同时,应用Western Blot、细胞免疫荧光和实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测转分化过程中Wnt通路相关信号分子β-catenin、Cyclin D1和WISP1的表达变化情况;进一步采用Wnt/β-catenin通路抑制剂Dickkopf-1(DKK1)阻断该信号途径,Western Blot检测β-catenin、Cyclin D1和WISP1表达变化情况,以验证干预效果并分析干扰Wnt/β-catenin信号传递对转分化标记分子α-SMA、Vimentin和Collagen I表达的影响。结果处理72 h后,与对照组细胞相比,PQ组MRC-5细胞α-SMA、Vimentin和Collagen I的表达水平均显著增加(P<0.05);同时,在PQ诱导MRC-5转分化过程中β-catenin、Cyclin D1和WISP1表达水平显著上调(P<0.05);采用DKK1干扰Wnt/β-catenin信号通路能够抑制PQ诱导MRC-5细胞转分化过程中α-SMA、Vimentin和Collagen I的高表达(P<0.05)。结论DKK1能够通过干扰Wnt/β-catenin信号的激活抑制PQ诱导的成纤维细胞转分化,有望进一步抑制PQ中毒引起的肺纤维化的发生。     

持续 Wnt 信号通路激活促进胚胎干细胞源造血干细胞的增殖简

背景：如何提高胚胎干细胞诱导效率、促进胚胎干细胞源造血干细胞体外增殖成为目前急需解决的课题。目的：以外源性Wnt3a作为诱导剂,激活培养中的小鼠胚胎干细胞Wnt/β-catenin信号通路,观察该通路的激活是否促进胚胎干细胞向造血祖细胞的定向分化。方法：用外源性wnt3a（100μg/L）持续作用ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞21 d,通过细胞免疫荧光及蛋白免疫印迹检测细胞内β-catenin蛋白含量,QRT-PCR检测Wnt下游靶标基因的表达量来确定经典Wnt/β-catenin信号通路是否被激活,然后采用单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化,流式细胞仪检测造血发育相关表面标志CD34＋/Sca-1＋,同时以QRT-PCR法检测造血相关基因的表达情况。结果与结论：ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞经wnt3a（100μg/L）连续培养21 d后发现β-catenin蛋白在细胞内积累;Wnt信号通路的下游靶标基因Pitx2、Frizzled、Sox17、Oct4的表达量均出现不同程度的增加,可见经典 Wnt/β-catenin 信号通路有被激活;单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化的过程中检测到CD34＋/Sca-1＋细胞含量在14 d时占总细胞量高达20.2%,而对照组的仅占11.9%。造血相关基因骨形态发生蛋白4、FLK2及CD34的表达量均增加,而Smad5的表达则明显受到抑制。说明Wnt3a持续作用可激活Wnt/β-catenin信号通路,并促进ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的定向分化。     

Wnt/β-catenin信号通路在TNF-α诱导的心肌细胞损伤和凋亡中的作用研究

目的 建立心肌细胞炎症损伤模型,探讨Wnt/β-catenin信号通路在心肌细胞损伤和凋亡中的作用。方法 体外培养大鼠心肌细胞H9c2,用含肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的细胞培养基诱导心肌细胞,建立炎症心肌细胞损伤模型。实验包括对照组、炎症组、DDK1不同浓度阻断组共5组。各组检测细胞活力和凋亡率,检测相关基因和蛋白表达;检测细胞培养液中LDH和AST及细胞中SOD浓度。结果 TNF-α诱导H9c2心肌细胞β-catenin、TCF7L2和CyclinD1基因和蛋白表达显著上调,细胞增殖受到抑制、细胞损伤和凋亡增加(P<0.05)。而在DDK1阻断Wnt通路后,相对于炎症组,β-catenin、TCF7L2和CyclinD1基因和蛋白表达显著下调,细胞活力上升、细胞损伤减轻、凋亡率降低(P<0.05)。相关性分析显示,β-catenin基因表达与细胞活力呈负相关,与LDH、AST活性呈正相关(P<0.05)。结论 在TNF-α刺激下,心肌细胞Wnt通路被显著激活,抑制Wnt通路基因表达可减轻细胞损伤和凋亡。     

miR-544a对非小细胞肺癌细胞系Wnt信号通路抑制因子GSK3β表达的调控作用

摘要：目的：探讨微小RNA-544a(miR-544a)对肺癌干细胞的自我更新能力影响及其可能的机制。 方法：通过生物信息学预测miR-544a的靶向基因,用荧光素酶报告系统及western blot验证其靶向关系;构建稳定表达miR-544a的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系95C和95D,并用荧光定量PCR验证;用肿瘤球悬浮培养实验检测miR-544a在形成肿瘤球中的作用。 结果：生物信息学预测发现,miR-544a可以靶向调节Wnt信号通路的抑制子GSK3β,并通过荧光素酶报告系统得到了验证（F=201.37,P＜0.01）;western blot结果显示,miR-544a可以下调GSK3β的表达,而β-catenin、CD133蛋白表达水平明显上调（F分别为7.73,3.37,9.43,P均＜0.01）;荧光定量PCR结果显示,95C、95D细胞在转染miR-544a后,miR-544a表达水平增高,分别为20.51±0.97、15.16±1.38 (F=418.05,P＜0.01)。肿瘤球悬浮培养实验发现,稳定表达miR-544a的细胞能够反复形成具有肿瘤干细胞特性的肿瘤球。 结论：miR-544a可以通过直接下调GSK3β的表达来激活Wnt信号通路,以维持肺癌干细胞自我更新能力。     

骨髓间充质干细胞成脂和成骨分化过程中Wnt信号通路的调控效应

背景:骨髓间充质干细胞的成脂肪分化与成骨分化比例的失衡与许多骨疾病密切相关,而近些年发现Wnt信号通路在调控骨髓间充质干细胞的分化方向中起重要作用.目的:通过Wnt信号通路PCR基因芯片观察大鼠骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞和成骨细胞后相关基因表达的变化,寻找Wnt信号通路中调控骨髓间充质干细胞分化的靶基因.方法:采用大鼠第3代骨髓间充质干细胞分别进行成骨诱导和成脂诱导,7 d后用Trizol萃取培养瓶中的细胞总RNA,倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态特征及成骨诱导后和成脂诱导后细胞形态特征.采用Wnt信号通路PCR芯片(大鼠)进行摹因芯片检测,以未诱导组为对照,计算成脂肪诱导,成骨诱导后相关基因上调/下调的比值.结果与结论:①倒置显微镜下观察,传3代后可获得均一性较高的骨髓间充质干细胞,骨髓间充质干细胞经成骨诱导后向成骨细胞方向分化,经成脂诱导后向脂肪细胞方向分化.②与未诱导组相比,骨髓间充质干细胞成脂诱导后Wnt信号通路表达上调的基因(Dkk-1,kremen,FZD1,FZD7)等15个(ratio＞2),下调的基因(sFrp 5,β-catenin,Dvl3,Tcf7)等16个(ratio＜0.5).成骨诱导后,Wnt信号通路表达上调的基因(Dkk1,kmmen,β-catenin,Wnt11)6个,表达下调的基因(sFrp5,sFRP4,Fzd1)等15个.提示WnI信号通路在骨髓间克质干细胞成脂细胞分化和成骨细胞分化中发挥重要作用.     

DDK1阻断Wnt/β-catenin信号通路抑制百草枯诱导的肺成纤维细胞转分化

目的探讨抑制Wnt/β-catenin信号通路对百草枯(paraquat, PQ)诱导的人胚肺成纤维细胞(MRC-5)转分化的影响及相关分子机制。方法将MRC-5细胞分为三组, 对照组(Control组):不加药物处理;PQ组:以50 μmol/L的PQ刺激MRC-5细胞72 h诱导建立转分化模型;PQ+DKK1组:以50 μmol/L的PQ和10 ng/mL的DKK1同时处理细胞72 h。收集细胞, 采用细胞免疫荧光和Western Blot分别检测三组细胞转分化标记物α-SMA、Vimentin和Collagen I的表达水平;同时, 应用Western Blot、细胞免疫荧光和实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测转分化过程中Wnt通路相关信号分子β-catenin、Cyclin D1和WISP1的表达变化情况;进一步采用Wnt/β-catenin通路抑制剂Dickkopf-1(DKK1)阻断该信号途径, Western Blot检测β-catenin、Cyclin D1和WISP1表达变化情况, 以验证干预效果并分析干扰Wnt/β-catenin信号传递对转分化标记分子α-...     

经典的Wnt信号通路在大鼠肝脏卵圆细胞增殖和分化中的作用

目的探讨激活经典的Wnt信号转导通路在大鼠肝脏卵圆细胞增殖、分化中的作用。方法不同浓度的重组Wnt3a纯化蛋白(20,40,80,160,200ng/ml)在无血清培养条件下作用WB-F344细胞24h,Brdu掺入法检测细胞增殖情况。160ng/ml重组Wnt3a纯化蛋白在无血清条件下作用WB-F344细胞,作用24h后通过免疫荧光观察β-catenin亚细胞定位的变化,Western-blot观察β-catenin蛋白表达的变化;半定量RT-PCR观察下游靶基因CyclinD1mRNA表达的变化。作用72h后通过RT-PCR观察CK-19,AFP,ALB,HNF-6,HNF-4αmRNA表达的变化,Western-blot观察CK-19,AFP蛋白表达的变化。以同期未做处理的WB-F344细胞作为空白对照。结果不同浓度的重组Wnt3a纯化蛋白作用后,处理组WB-F344细胞以剂量依赖方式增殖,Wnt3a处理组明显高于空白对照组(P<0.05),160ng/ml作用时,增殖达到最高峰。Wnt3a(160ng/ml)作用24h后,通过免疫荧光共聚焦观察β-catenin的亚细胞定位发现,处理组β-catenin在WB-F344主要在细胞核中表达;而未处理组主要在核周表达;Western-blot发现处理组β-catenin蛋白表达轻度增加;半定量RT-PCR发现下游靶基因CyclinD1mRNA的表达显著增加(P<0.01)。72h后,RT-PCR发现两组中均有AFP,CK-19,HNF-6,HNF-4α基因表达,而ALB在两组中均不表达;同时通过Western-blot发现AFP,CK-19蛋白在两组中均有表达。结论激活经典的Wnt信号转导通路促进大鼠肝脏卵圆细胞系WB-F344的增殖和自我更新。     

Sox1过表达对口腔鳞癌细胞增殖、侵袭及Wnt通路的影响

目的研究性别决定区域Y盒1(Sox1)过表达对口腔鳞癌细胞增殖、迁移以及Wnt通路的影响。方法荧光实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测人正常口腔组织细胞系及口腔鳞癌细胞系HN4中Sox1 mRNA表达。采用Lipofectamin 2000试剂进行转染,分为三组:空白组、Sox1 NC组、Sox1 mimics组,每孔别按照不添加、0. 7μl 20μmol/L的p CMV6空载体、0. 7μl 20μmol/L的p CMV6-Sox1的水平加入相应试剂。检测Sox1 mRNA和蛋白水平,通过MTT试剂盒检测细胞增殖,Transwell法检测细胞侵袭能力,免疫印迹(Western blot)法检测Wnt通路相关蛋白表达水平。结果与正常细胞相比,口腔鳞癌细胞中Sox1 mRNA、Sox1蛋白表达水平显著降低(P 0. 05);空白组与Sox1 NC组Sox1 mRNA、蛋白表达差异无统计学意义(P 0. 05),与空白组、Sox1 NC组相比,Sox1 mimic组Sox1 mRNA、蛋白表达显著升高(P 0. 05); MTT试验显示,Sox1 NC组与空白组相比,0 h、24 h、48 h、72 h、96 h,OD值差异无统计学意义(P0. 05),与Sox1 NC组和空白组相比,Sox1 mimic组转染后72 h后OD值显著降低(P 0. 05); Western blot检测结果显示,空白组与Sox1 NC组相比Wnt、GSK-3β、β-Catenin、cyclin D1蛋白表达无显著差异(P 0. 05),与空白组、Sox1 NC相比,Sox1 mimic组Wnt、β-Catenin、cyclin D1蛋白表达明显下降(P 0. 05),GSK-3β表达量上升(P 0. 05)。结论口腔鳞癌组织中Sox1低表达,Sox1过表达通过Wnt通路降低口腔鳞癌细胞增殖、侵袭能力。     

Wnt1和DKK1在宫颈鳞癌中的表达及意义

目的研究Wnt基因家族中Wnt1和Wnt信号通路抑制因子DKK1在宫颈鳞癌中的表达及意义。方法应用免疫组织化学法检测宫颈鳞癌及正常宫颈组织中Wnt1和DKK1蛋白的表达。结果宫颈鳞癌中Wnt1的阳性表达率为71.67%,显著高于正常宫颈组织中的40.00%(P<0.05)。DKK1在宫颈鳞癌中的阳性表达率为43.33%,显著低于正常宫颈组织中的66.67%(P<0.05)。在宫颈鳞癌组织中,Wnt1和DKK1与FIGO分期、组织分化程度、有无淋巴转移及浸润深度有关(P均<0.05)。Wnt1与DKK1在宫颈鳞癌中的表达呈负相关(P<0.01)。结论在宫颈鳞癌中,Wnt1作为Wnt信号通路的始动因子发挥作用,而DKK1作为Wnt信号通路的抑制因子发挥作用。二者有望成为宫颈鳞癌判断预后及指导临床治疗的监测指标。     

胶质瘤中Axin和β-catenin表达及临床意义的研究

目的探讨不同级别胶质瘤组织中轴蛋白（Axn）及β-连环素（β-catenin）的表达及其临床意义。方法制作82倒不同级剐胶质瘤的组织芯片,采用免疫组化sP法,检测芯片中Aria及β-eatenin在不同级剐胶质瘤中的表达。结果免疫组化检测显示Axin在低级别胶质瘤中表达（64．52％）较高级别胶质瘤（23．53％）高,差异有统计学意义（x2=10．48,P〈0．01）,而β-catenin在低级别胶质瘤中表达（45．16％）较高级别胶质瘤低（80．30％）,差异有统计学意义（x。=13．61,P〈0．01）,Axin表达与β-eatenin呈负相关（r=-0．035,P〈0．05）。结论Axin、β-catenin可反映胶质瘤的恶性程度和病理分级,Axin在wnt信号转导途径中起负调节作用。     

急性髓系白血病初诊患者β-连环蛋白和周期蛋白D1mRNA的表达及其意义

本研究旨在检测急性髓系白血病（AML）患者β-连环蛋白（beta—catenin）及周期蛋白D1（cyclinD1）mRNA的表达变化,分析其相关性,为探讨Wnt／β联蛋白（Wnt／beta—catenin）通路在AML发病机制中的作用提供理论依据。采用实时荧光定量RT—PCR的方法检测beta—catenin及cyclin D1 mRNA的相对表达水平,分析两者在AML不同亚型及良性血液病患者中的表达变化及相关性。结果表明,AML骨髓单个核细胞（BMMNC）中beta-cateninmRNA的表达水平明显高于良性血液病患者（P〈0．05）,但在AML各亚型之间其表达量无统计学差异（P〉0．05,在AML中存在cyclinD1 mRNA的过度表达,其表达水平明显高于良性血液病组（P〈0．05）,在各亚型间其表达量无统计学差异（P〉0．05）。Beta-catenin与cyclinD1的表达水平在AML-M1、M2、M4中存在显著正相关性（r值分别为0．822,0．627,0．712,P值分别为0．001,0．020,0．002）。结论：在AML患者中存在beta—catenin及cyclin D1的过度表达,且在部分亚型中存在显著相关性;Wnt／beta-catenin通路在AML中被异常激活,很可能是通过该通路下游靶基因cyclinD1的激活,参与白血病细胞的周期紊乱和异常增殖的调节。     

半乳糖凝集素3及基质金属蛋白酶2在人脑胶质瘤中的表达及意义

目的：探讨半乳糖凝集素3（Galectin-3）、基质金属蛋白酶（MMP）-2在人脑胶质瘤细胞中的表达及二者在胶质瘤发生及恶性进展中的作用。方法采用免疫组化法检测5例正常脑组织及40例不同级别胶质瘤标本中 Galectin-3、MMP-2蛋白的表达情况,显微镜下根据瘤细胞中 Galectin-3、MMP-2阳性细胞数判断其表达,阳性细胞计数以阳性细胞所占总细胞数百分比的阳性指数（ LI）来表示。结果正常脑组织中 Galectin-3、MMP-2蛋白的表达均为阴性。在脑胶质瘤标本中 Galectin-3主要表达于肿瘤细胞的胞质及胞膜,Galectin-3在Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤标本中阳性表达率为39.13％（9/23）,LI 值为（5.65±3.47）％;在Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤标本中阳性表达率为76.47％（13/17）,LI 值为（27.88±22.13）％,Ⅰ、Ⅱ级与Ⅲ、Ⅳ级间阳性表达率和 LI 值比较差异有统计学意义（χ^2=4.101、t =4.105,P 均＜0.05）。在脑胶质瘤中 MMP-2蛋白主要表达于瘤细胞及血管基底膜内皮细胞的胞质,MMP-2在Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤标本中阳性表达率为39.13％（9/23）,LI 值为（5.91±4.78）％,在Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤标本中阳性表达率为88.24％（15/17）,LI 值为（30.06±22.94）％,Ⅰ、Ⅱ级与Ⅲ、Ⅳ级间阳性表达率和 LI 值比较差异有统计学意义（χ^2=7.882、t =4.271,P 均＜0.05）。经直线相关分析,Galectin-3与 MMP-2的阳性细胞表达率呈正相关（r =0.800,P ＜0.05）。结论 Galectin-3、MMP-2蛋白的表达在Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤组明显低于Ⅲ、Ⅳ级组,与胶质瘤的恶性程度及进展呈正相关,更有利于对人脑胶质瘤的恶性生物学行为进行评价和判断。     

细胞信号负调细胞信号负调控因子3调控Wnt/β-Catenin信号通路对肿瘤干细胞的影响及其在脑胶质母细胞瘤中的应用

背景:有研究表明,细胞信号负调控因子3、Wnt/β-Catenin信号通路与脑胶质母细胞瘤的发生密切相关。目的:探讨细胞信号负调控因子3与Wnt/β-Catenin信号通路对肿瘤干细胞的影响及在治疗脑胶质母细胞瘤中的作用机制。方法:从手术切除的脑胶质母细胞瘤标本中,分离、培养及鉴定脑肿瘤干细胞。反转录PCR扩增细胞信号负调控因子3基因,转染至脑胶质母细胞瘤干细胞。反转录PCR、Western blot检测细胞信号负调控因子3转染前后,脑胶质母细胞瘤干细胞中细胞信号负调控因子3、信号转导与转录活化因子3、β-Catenin及抑癌因子人第10号染色体缺失磷酸酶及张力蛋白同源基因mRNA及蛋白的表达。结果与结论:高表达细胞信号负调控因子3可能通过抑制信号转导与转录活化因子3的表达,从而抑制Wnt/β-Catenin通路的传导,以增强人第10号染色体缺失磷酸酶及张力蛋白同源基因活性,降低胶质瘤细胞增殖及侵袭能力同时诱导细胞凋亡,为脑胶质母细胞瘤的靶向治疗提供新的途径。     

Wnt3a转染小鼠胸腺激酶缺陷细胞及对β-连环素蛋白亚细胞分布的影响

背景:Wnt信号通路是动物胚胎发育过程中重要的调控通路,建立Wnt信号通路细胞模型对于研究该通路有重要意义.目的:以Wnt3a真核表达质粒转染小鼠胸腺激酶缺陷细胞,构建能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型,观察经典Wnt信号通路对β-1连环素蛋白亚细胞分布的影响.方法:将扩增真核表达质粒pgk-Wnt3a-pcDNA3.0进行酶切鉴定.应用脂质体转染技术将真核表达质粒pgk-Wnt3a-pcDNA3.0和对照质粒pgk-neo-pcDNA3.0转染入胸腺激酶缺陷细胞,经过G418筛选后挑出细胞克隆,扩大培养.应用RT-PCR技术检测表达产物,应用间接免疫荧光技术检测Wnt3a对鼠胸腺激酶缺陷细胞β-catenin亚细胞分布的影响.结果与结论:Wnt3a质粒经过酶切鉴定证明所扩增的质粒为目的质粒.经过G418筛选3周后,挑选10个稳定转染的细胞克隆,进行RT-PCR检测,可见在L-Wnt3a细胞的cDNA产生1条长度为320 bp亮带,表明扩增产物为所需要的目的片段,Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞后有Wnt3a在mRNA转录水平表达.转染对照质粒的胸腺激酶缺陷细胞cDNA未扩增出目的条带.免疫荧光检测可见Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞后细胞浆中有Wnt3a蛋白表达,转染对照质粒组无表达.Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞核中可见明亮的红色荧光,提示β-连环素蛋白在胸腺激酶缺陷细胞-Wnt3a细胞聚集并进入细胞核中.转染对照质粒的胸腺激酶缺陷细胞浆未见有明显β-连环素蛋白着色,细胞核中无β-连环素蛋白的聚集.构建了能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型,真核表达Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞能够获得稳定表达,促进胸腺激酶缺陷细胞浆中β-连环素蛋白向细胞核转移.     

葛根素干预激素诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的Wnt信号途径

背景：国内外学者研究证明,激素性股骨头缺血性坏死的发病机制与体内脂质代谢紊乱,尤其是大剂量激素诱导下骨髓间充质干细胞的成脂分化有关。目前葛根素抑制激素诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的Wnt信号转导途径还未经证实。〈br〉 目的：观察葛根素干预激素诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化过程中 Wnt 信号途径相关基因及关键蛋白β-catenin表达的变化。〈br〉 方法：第3代SD大鼠骨髓间充质干细胞随机分为空白组、激素组、葛根素低、中、高剂量组,5组干预6 d后RT-PCR法检测Wnt/β-catenin信号通路主要成员Wnt10b mRNA、GSK3β mRNA、β-catenin mRNA的表达,Western blot法对β-catenin蛋白的表达进行检测分析。〈br〉 结果与结论：与激素组比较,葛根素各干预组Wnt10b mRNA、β-catenin mRNA及β-catenin蛋白的表达水平均显著升高;GSK3βmRNA的表达水平显著降低。提示葛根素对激素诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的抑制作用可能是通过调节信号通路的Wnt10b mRNA、GSK3βmRNA、β-catenin mRNA及β-catenin蛋白的表达来实现的。葛根素防治激素性股骨头缺血坏死的机制不仅是改善股骨头局部的微循环,同时还与其抑制激素诱导下骨髓间充质干细胞的成脂分化有关。     

信号通路对胃癌干细胞及胃癌发生的影响

背景：Hedgehog与Wnt／β-catenin信号通路对胃癌干细胞的影响及在胃癌发生发展中的作用机制少见报道。目的：探讨Hedgehog与Wnt/β-catenin信号通路在胃癌发生发展中的作用机制。方法：采用肿瘤球悬浮分选法从胃癌组织标本中分选胃癌干细胞。采用免疫组化SP法检测Hedgehog及Wnt／β-catnin信号通路主要分子SHH、GLI1、Wnt2及β-catenin在胃癌干细胞中的表达。Spearman相关分析各细胞因子间的相关性分析。结果与结论：SHH、GLI1、Wnt2及β-catenin在胃癌干细胞中的阳性表达率分别为74．7％,78．3％,85．5％和83．3％,均显著高于癌旁组织的阳性表达率（P〈0．05）。各细胞因子间在胃癌干细胞中的表达均呈正相关（P〈0．05）。说明在胃癌干细胞中Hedgehog及Wnt/β-catenin信号通路均被激活,二者互相作用可能参与了胃癌的发生发展,为胃癌的干细胞治疗提供了新的研究方向。     

慢病毒介导RNAi干扰β-catenin对小鼠骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

本研究通过构建β-连环蛋白（β-catenin）特异的RNAi慢病毒表达载体,探讨阻断Wnt／β-catenin信号通路对骨髓间充质干细胞（MSC）生物学行为的影响。设计3对针对β-cateninmRNA不同位点的shRNA编码序列,分别连接到慢病毒载体质粒PLB中,构建PLB-β-catenin／shRNAl,PLB-β-catenin／shRNA2和PLB-β-catenin／shR-NA3;将重组质粒与慢病毒包装质粒及包膜蛋白质粒共转染293FT细胞,收获病毒颗粒,浓缩后测定病毒滴度,感染Msc细胞,并应用流式细胞术分选GFP阳性细胞,Westernblot和RT-PCR验证其对细胞内β-catenin基因表达的抑制效果,筛选干扰效率最高质粒;CCK-8法检测细胞增殖,Annexin-V／7-AAD法检测干扰后细胞凋亡情况,细胞划痕实验及Transwell实验检测MSC迁移能力。结果表明：构建的特异性慢病毒siRNA干扰组（PLB-β-catenin／shRNA2）能有效抑制β-catenin的mRNA和蛋白表达,并抑制细胞的增殖;而空载体对照组（PLBgroup）和正常对照组（controlgroup）细胞增殖无明显变化,两组之间无显著的统计学差异（P〉0．05）;流式细胞术检测结果显示,采用血清饥饿法处理后,干扰组细胞的凋亡率明显增加,但两对照组之间无统计学差异（P〉0．05）;细胞划痕和Tran-swell实验显示,干扰组MSC的迁移能力明显降低,对照组细胞迁移能力无明显变化。结论：构建的特异RNAi慢病毒能够有效抑制β-catenin基因的表达,减少细胞内目的基因mRNA和蛋白的水平,从而对MSC细胞的增殖、凋亡和迁移能力产生重要影响。     

Wnt-5a、Wnt-11、CaMKⅡ在良性转归葡萄胎和恶性变葡萄胎中的表达及意义

目的探讨无翅型MMTV整合位点家族成员5a(Wnt-5a)、无翅型MMTV整合位点家族成员(Wnt-11)及Ca~(2+)/钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在良性转归及恶性变葡萄胎组织中的表达其临床意义。方法收集2009年3月至2020年3月本院72例葡萄胎患者首次清宫石蜡标本,其中28例为随访发生恶变的葡萄胎(恶变葡萄胎组),44例为随访未发生恶变的葡萄胎(良性转归葡萄胎组),采用免疫组织化学法(IHC)检测上述组织标本中Wnt-5a、Wnt-11及CaMKⅡ蛋白表达情况;采用ROC曲线分析Wnt-5a、Wnt-11及CaMKⅡ蛋白表达对葡萄胎恶变的预测效能。结果恶变葡萄胎组和良性转归葡萄胎组的Wnt-5a(75.00%vs 29.55%)、Wnt-11(82.14%vs 22.13%)及CaMKⅡ(89.29%vs 63.64%)蛋白阳性表达率比较,恶变葡萄胎组均显著高于良性转归葡萄胎组,差异有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归结果提示宫腔病变径线≥6 cm(OR=2.328,95%CI:1.518~3.569)、Wnt-5a阳性(OR=3.347,95%CI:1.586~7.062)、Wnt-11阳性(OR=3.873,95%CI:1.664~9.014)及CaMKⅡ阳性(OR=1.355,95%CI:1.057~1.738)是葡萄胎恶变的独立危险因素(P<0.05)。Wnt-11预测葡萄胎恶变的的AUC分别大于宫腔病变径线、CaMKⅡ预测的AUC(P<0.05),与Wnt-5a预测的AUC比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论恶变葡萄胎首次清宫组织中Wnt-5a、Wnt-11及CaMKⅡ蛋白表达较良性转归葡萄胎异常升高,三者对葡萄胎恶变具有较好的预测价值。