骨髓间充质干细胞促进骨-肌腱结合部位早期愈合的动物生物力学实验研究

[目的]通过生物力学研究,观察骨髓间充质干细胞对骨-肌腱结合部愈合的影响.[方法]采用骨髓穿刺、全骨髓培养法获取兔骨髓间充质干细胞.24只18周龄新西兰大白兔随机分为2组,实验组将骨髓间充质干细胞与Pluronic F-127载体材料结合后,植入兔髌骨部分切除模型,对照组只进行手术,不植入细胞.在术后6、12、18周处死动物取标本(n=4)进行生物力学检测评估骨-肌腱结合部位的愈合恢复情况.[结果]生物力学结果显示相同时间点实验组拉断负荷及极限拉应力均大于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),提示实验组恢复较对照组迅速.[结论]相同时间点实验组拉断负荷、极限拉应力均大于对照组.实验组的力学特性明显高于对照组.骨髓间充质干细胞可以促进骨-肌腱结合部细胞早期愈合,提高其力学特性.     

骨髓间充质干细胞及其复合物对肌腱早期愈合影响的实验研究

[目的]探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)与纤维蛋白胶复合体对兔肌腱早期愈合的影响,为临床应用提供依据.[方法]家兔骨髓间充质干细胞离体培养、纯化、扩增后与纤维蛋白胶混合.36只家兔分为实验组和对照组,兔跟腱横断制作肌腱断裂模型.实验组应用自体BMSCs复合纤维蛋白胶移植于肌腱损伤区,对照组仅以纤维蛋白胶置于肌腱损伤区.分别于术后1周,3周,6周及12周对移植部位进行大体标本观察,细胞示踪、组织学检查、免疫组织化学检查、形态测定分析及生物力学测定.[结果]实验组相比对照组肌腱大体观察粘连差,肌腱活动性好.3周后纤维蛋白载体即降解,细胞示踪结果显示标记的骨髓间充质干细胞至少6周内仍可保持活性并存在于肌腱组织中,但之后逐渐扩散.3周时,实验组与对照组相比胶原纤维排列更为有序,且胞核形态结构更规则,但在6周及12周时,实验组与对照组胞核参数测定无统计学意义.3周时实验组比对照组具有更强的的生物力学特性,但之后则差别不明显.[结论]肌腱损伤后即给以腱内BMSCs复合纤维蛋白胶治疗可促进肌腱愈合早期组织形态学及生物力学修复.     

骨-肌腱结合部损伤愈合研究进展

骨-肌腱结合部愈合过程中重建正常的纤维软骨移行带是恢复肌肉-肌腱-骨关节间动力传导功能的关键.纤维软骨带结构复杂,再生能力较差,致使骨-肌腱结合部的再生十分困难而缓慢.研究骨-肌腱结合部愈合过程中特征性结构纤维软骨移行带的修复机制,对指导临床治疗及术后康复锻炼具有深远意义.影响骨-肌腱结合部愈合过程的因素很多,手术重接技术、局部固定方法、局部生物力学环境、术后康复锻炼方案等,均对骨-肌腱结合部愈合及纤维软骨移行带重建产生重要影响.该文就近年骨-肌腱结合部愈合相关研究进展作一综述.     

骨髓间充质干细胞对肌腱移植物在骨隧道内愈合效果及示踪的实验研究

[目的]观察骨髓间充质干细胞对肌腱移植物在骨隧道内愈合的影响,并为干细胞的标记示踪提供实验依据.[方法]采用贴壁分离筛选法获取大鼠的骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),用超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)和DiI(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)对其标记.39只8周龄雄性SD大鼠随机分为两组,实验组21只,对照组18只.实验组在骨隧道内腱-骨结合面注入含双标的BMSCs和Pluronic F-127载体,对照组只注入载体,术后2、4、8周进行生物力学评估愈合效果,实验组2、4、8周组织冰冻切片荧光显微镜和手术后即刻、3、7 d行7.0 T MR示踪移植的BMSCs.[结果]SPIO、DiI能有效标记干细胞.实验组2、4、8周荧光显微镜观察在腱骨界面有DiI标记的阳性细胞存在.7.0 T MR未能在实验组腱骨界面观察到明显信号改变.生物力学最大拔出载荷实验组和对照组在术后2周无统计学差异,在4、8周实验组显著高于对照组(P<0.05).[结论]移植的骨髓间充质干细胞可以促进骨隧道内腱骨结合部的早期愈合,DiI能有效标记示踪干细胞,SHO能有效标记干细胞,但在该实验模型中7.0T MR可能不能活体示踪磁粒子标记的干细胞.     

骨髓间充质干细胞促进“创面”愈合的实验研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）促进创面愈合的作用和用于创面修复的可行性。方法：密度梯度离心法分离培养正常人骨髓间充质干细胞（hMSCs），流式细胞仪检测培养第二代细胞CD14、CD29、CD34、CD44、CD45和CD106抗原表达以鉴定MSCs。实验分3组：直接共培养组（n=8）为hMSCs（1×10^5/ml）与人表皮角质形成细胞（HEKa）直接接触共培养；间接共培养组（n=7）为在transwell透明聚碳酸酯膜上层加入hMSCs细胞悬液[（2-3）×10^5个细胞）]，下层接种HEKa，间接共培养；单纯HEKa培养组（n=7）单纯培养HEKa。在倒置显微镜下刮擦生长融合成片的HEKa细胞以制备宽度为100μm的“表皮创面”模型。模型制备后24、48、72h，倒置相差显微镜下计数每高倍视野越过创缘迁移到创面的HEKa数，并用SigmaScan Pro5软件计算创面愈合率，检测HEKa细胞吸收脱氧胸腺嘧啶核苷的放射活性，判定HEKa细胞的分裂增殖活性。结果：流式细胞仪检测第二代hMSCs CD29、CD44和CD106抗原阳性（分别为94.81%、95.38%、97.40%），CD14、CD34、CD45抗原阴性（分别为1.23%、3.05%、2.64%）；直接培养组、间接培养组和单纯HEKa培养组越过创缘进入创面的细胞伤后24h分别有（10.00±0.25）、（5.50±0.20）和（5.20±0.35）个/高倍视野；48h分别有（55.30±0.22）、（27.00±0.34）和（26.50±0.25）个/高倍视野；72h分别有（110.50±0.45）、（42.50±0.50）、（40.20±0.38）个/高倍视野。3组伤后72h创面愈合率分别为（60.00±0.04）%，（35.00±0.01）%、（33.00±0.05）%。脱氧胸腺嘧啶苷掺入培养基法表明hMSCs对体外共培养HEKa细胞的增殖作用分别为（1650±270）cpm/10^5 cell、（1240±210）cpm/10^5 cell、（1180±220）cpm/10^5 cell。上述各指标直接共培养组与单纯HEKa培养组比较，差异有显著性（P〈0.01），而间接培养组与单纯HEKa培养组间差异无显著性（P〉0.05）。     

低强度超声促进兔骨-肌腱结合部早期恢复的初步观察

目的：观察低强度超声对骨一肌腱结合部位恢复的影响。方法：建立兔髌骨部分切除模型，16只成年雌性新西兰白兔随机分为2组，超声组每日接受低强度超声刺激，对照组给予假刺激。术后6、12周处死动物取标本(n=4)做大体和病理组织学观察。结果：大体见超声组腱-骨结合部愈合较早；组织学观察显示超声组6周可以看到骨-肌腱结合部纤维母细胞、成骨细胞增生活跃，12周出现软骨带，部分胶原纤维长入新生的骨质中，恢复较对照组迅速。结论：低强度超声可以促进骨肌腱结合部位的早期恢复。     

不同传代次数大鼠骨髓间充质干细胞移植促进糖尿病大鼠创面愈合的研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）在体外培养扩增过程中引起的老化对其修复糖尿病慢性创面功能的影响。方法：从大鼠股骨骨髓中分离培养BMSCs,流式细胞分析仪鉴定细胞表型,成骨、成脂诱导鉴定其分化能力。取第5、15、25、35和45代（P5、P15、P25、P35和P45）BMSCs,0.25%的胰酶消化后制备1×10^6/m1单细胞悬液。腹腔注射65 mg/kg链脲佐菌素建立糖尿病SD大鼠模型,8周后,在SD大鼠背部左右两侧用打孔器制备直径1.2 cm的圆形创面。将70只糖尿病慢性创面模型大鼠随机分为7组,分别经尾静脉注射1 ml的P5、P15、P25、P35和P45 BMSCs单细胞悬液（1×10^6/m1）,1 ml成纤维细胞（Fb）悬液（1×10^6/m1）和1 ml生理盐水。分别于伤后3、7、14、21 d计算创面愈合率,并取创面组织制备切片,苏木精-伊红（HE）染色,光学显微镜下观察组织病理学变化及血管生成情况。结果：糖尿病SD大鼠创面较正常大鼠创面愈合延迟（P〈0.05）。伤后14 d,各BMSCs移植组与Fb组和生理盐水组比较,创面收缩与再上皮化明显,镜下可见成纤维细胞生长活跃、数量多,各BMSCs移植组间无明显差异。伤后14 d,各BMSCs移植组创面愈合率较Fb组和生理盐水组增加,以P5 BMSCs移植组变化最显著（P〈0.05）。伤后7 d,各BMSCs移植组微血管密度均显著高于Fb组和生理盐水组（P〈0.01）,以P5 BMSCs移植组效果最为显著。结论：全身注射异体BMSCs可促进糖尿病创面愈合。BMSCs在体外长期扩增传代可减少其创面修复能力,其对糖尿病创面的修复作用以P5以内干细胞较好。     

骨髓间充质干细胞研究进展

近年来 ,骨髓间充质干细胞 (MSC)受到学者的广泛关注 ,该细胞易于分离扩增 ,在适宜的条件刺激下 ,可向多方向分化 ,被称为组织工程的“种子细胞” ,又由于该细胞在体内外表达各种治疗性外源目的基因 ,被公认为是一种基因治疗的靶细胞 ,本文试就其生理功能、表面标记研究进展作一综述。一、骨髓间充质干细胞的生理功能1.支持造血 :在网状组织 ,巨噬细胞和微血管等构成的造血微环境中 ,通过成纤维细胞集落形成单位 (CFU F)鉴定MSC ,约占骨髓内单核细胞总数的 10 4至 10 5分之一 ,但是MSC发挥了重要作用。MSC可以同其他间充质祖细胞一起…     

静脉移植5-BrdU标记骨髓间充质干细胞参与创面愈合的作用研究

目的：探讨经尾静脉移植入体内的骨髓间充质干细胞（BMSCs）参与皮肤创面愈合的情况。方法：以SD大鼠为研究对象，分离、培养并鉴定大鼠BMSCs。制作大鼠全层皮肤缺损动物模型；经尾静脉注入经5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞，于不同时间点（3、7、14、21、28天）观察移植细胞参与创面愈合的情况。结果：经流式细胞仪鉴定细胞表达CD29、CD90表达阳性；CD45表达呈阴性：经体外标记的5-溴脱氧尿嘧啶标记率〉90％；标记后的干细胞进行移植4周后，实验组大鼠创面局部及边缘可见BrdU标记的阳性细胞聚集，对照组中未发现明显的聚集现象。结论：5-BrdU完全能够满足移植细胞的标记需要。经尾静脉注射移植入体内的BMSCs可能参与皮肤创面愈合。     

成人间充质干细胞体外成骨的初步研究

目的 建立一种分离和培养成人骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）的方法,观察成人MSCs体外成骨潜能。方法 用Percoll分离液分离出骨髓中的单个核细胞,并在含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液中培养。通过传代培养扩增MSCs。为促进成人MSCs体外成骨性分化,第5传代培养时加入成骨性添加剂,培养第4、12天分别用流式细胞仪分析成人MSCs表面分子的表达,并用碱性磷酸酶组化染色和Von Kossa染色。结果 成人MSCs是骨髓黏附细胞中有相应细胞表面蛋白表达和形态均的一细胞群。成骨性添加剂可作用于传代培养的成人MSCs,表现为培养皿表面有相互连接的结节状聚合体、碱酶染色阳性细胞数量增多、Von Kossa染色可见钙化的基质沉积。结论 所建立的成人MSCs的分离和培养条件可分选出骨髓黏附细胞中一组独特的细胞群,成人MSCs具有体外成骨潜能。     

骨膜促进骨-肌腱结点愈合的研究

[目的]探讨骨膜对骨-肌腱结合部位愈合的影响,通过实验证明骨膜促进骨-肌腱结合部位细胞增生,进而促进该部位愈合.[方法]48只18周龄新西兰大白兔随机分为2组,实验组将骨膜游离并植入兔髌骨部分切除模型中骨-肌腱结点中,对照组只进行手术,不植入骨膜.在术后4、8、12周处死动物取标本进行大体和组织学观察.[结果]大体观察可见实验组骨-肌腱结合部位愈合较早.组织学检查显示实验组术后4、8周骨-肌腱结合部组织愈合明显,以从松质骨再生和骨-肌腱愈合接点纤维软骨带的再生为特征,较对照组迅速,提示早期实验组恢复较对照组迅速.[结论]骨膜可以促进骨-肌腱结合部位细胞增生,增加细胞基质合成,促进新生骨和纤维软骨移行带形成,促进其愈合.     

经骨向诱导的骨髓间充质干细胞在脱钙骨上生长行为的实验研究

目的:建立成骨细胞-脱钙骨支架复合物,观察其诱导成骨能力,从而探寻组织工程化骨的体外构建方法.方法:运用细胞沉淀法将大鼠BMSCs诱导形成的成骨细胞接种于脱钙骨支架,通过扫描电镜(SEM)、免疫荧光观察脱钙骨表面细胞生长情况,通过上清液碱性磷酸酶(ALP)活性及Ⅰ型前胶原羧端肽(PICP)、骨钙素检测观察成骨细胞活性.结果:扫描电镜示成骨细胞在脱钙骨表面生长良好,上清液ALP、PICP及骨钙素表达均明显高于对照组(P＜0.05),并随时间的增长而显著增加(P＜0.05).结论:采用细胞沉淀法成功将成骨细胞接种于脱钙骨支架,成骨细胞在支架材料中增殖旺盛,细胞活性状态良好,具有良好的骨形成能力,脱钙骨支架可作为骨组织工程中载体支架的较优选择.     

低浓度过氧化氢预处理骨髓间充质干细胞对创面愈合的促进作用

目的:观察低浓度过氧化氢(H2O2)预处理骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植到大鼠组织缺损创面后BMSCs在创面的存活情况及其对创面的促愈合作用.方法:75只SD大鼠,于背部中线靠颈侧制备直径1 cm的圆形全层皮肤缺损.按随机数字表法分为3组(每组25只):生理盐水组、单纯BMSCs组和H2O2预处理BMSCs组.在伤后即刻,分别经尾静脉注射等体积(0.5 ml)的生理盐水、CM-Dil标记的BMSCs悬液或50 u mol/L H2O2预处理12 h并经CM-Dil标记的BMSCs.伤后0～15d创面拍照,用Image Proplus 5.0图像分析软件分析图像,计算创面愈合率;伤后1、2、5d荧光显微镜下观察两BMSCs组创面BMSCs的数量;CD31免疫组化染色观察创面微血管密度的变化.结果:①创面干细胞数量:移植H2O2预处理的BMSCs后,创面干细胞数量明显多于单纯BMSCs移植组(P＜0.05和P＜0.01).与伤后第1天比较,单纯BMSCs组伤后第2天和第5天创面干细胞数量显著减少(P＜0.05);而预处理组创面干细胞数量虽然也呈进行性减少,但3个时相点创面的干细胞数量差异没有显著性(P＞0.05).②创面愈合率:创伤后5～15d,单纯BMSCs组和H2O2预处理BMSCs组创面愈合率均明显高于生理盐水组(P＜0.05或P＜0.01);创伤后5～10d,H2O2预处理组创面愈合率明显高于单纯BMSCs组(P＜0.05).⑧创面微血管数量:CD31免疫组化结果显示,伤后3d,两BMSCs治疗组之间血管数量差异无显著性;伤后5、7、10 d,H2O2预处理组创面微血管数量显著多于单纯BMSCs组(P＜0.05).结论:BMSCs经低浓度H2O2预处理再移植到创面,可以延长移植干细胞在创面的存活时间,并具有更好的促进创面愈合和血管生成的修复潜能.     

Denatured acellular dermal matrix seeded with bone marrow mesenchymal stem cells for wound healing in mice

It is the basic task of burn therapy to cover the wound with self-healthy skin timely and effectively. However, for patients with extensive burns, autologous skin is usually insufficient, and allogenic or heterogeneous skin leads to strong immune response. It is vital to choose an appropriate treatment for deep extensive burns. Nowadays, the dermal substitute combined with bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) is a prospective strategy for burn wound healing. Denatured acellular dermal matrix (DADM), as one of dermal substitutes, which prepared by burn skin discarded in escharotomy, not only maintains a certain degree of 3D structure of collagen, but also has good biocompatibility. In this study, the preparation method of DADM was improved and DADM was seeded with BM-MSCs. Then BM-MSCs-seeded DADM (DADM/MSCs) was implanted into mice cutaneous wound, and the effect of DADM/MSCs dermal substitute was assessed on skin regeneration. As a result, BM-MSCs survived well and DADM/MSCs scaffolds significantly promoted wound healing in terms of angiogenesis, re-epithelialization and skin appendage regeneration. DADM/MSCs scaffold may represent an alternative promising therapy for wound healing in deep extensive burns.     

Gene and protein expressions of bone marrow mesenchymal stem cells in a bone tunnel for tendon-bone healing

Purpose

Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) injected around tendon grafts can enhance tendon-bone healing and promote fibrocartilage formation. To understand gene and protein expressions of cells during tendon-bone healing, auto-BMSCs were implanted into a bone tunnel in anterior cruciate ligament reconstruction in a rabbit model.

Methods

BMSCs were harvested from New Zealand white rabbits. By an anterior cruciate ligament reconstruction model, 1 × 10⁶ BMSCs in 0.35 mL of fibrin glue was injected into bone tunnel as Fibrin-BMSC group. Only fibrin glue (Fibrin group) was injected as control. Three chondrogenesis genes and proteins, including Sox 9, collagen Type II (COII), aggrecan, and three osteogenesis genes and proteins, including Runx2, collagen type I (COI), and osteocalcin, between Fibrin-BMSC and Fibrin group were compared by real-time polymerase chain reaction assay and immunohistochemical assay postoperation.

Results

In real-time polymerase chain reaction assay, Sox9, COII, aggrecan, COI, and osteocalcin expressions upregulated and Runx2 downregulated were determined in Fibrin-BMSC group at 1 week. COII, aggrecan upregulated, and Runx2 and osteocalcin downregulated were determined at 4 weeks. In immunohistochemical assay, only Sox9, COII, and aggrecan proteins in only Fibrin-BMSC group were observed at 4 weeks. The protein expression as same as gene expression was obtained in a bone tunnel.

Conclusion

Auto-BMSCs promoted COII and aggrecan expression and reduced Runx2 and osteocalcin expression in a bone tunnel. It demonstrated that these cells could enhance fibrocartilage formation because of higher chondrogenesis expression during tendon-bone healing.     

VEGF with AMD3100 endogenously mobilizes mesenchymal stem cells and improves fracture healing

A significant number of fractures develop non‐union. Mesenchymal stem cell (MSC) therapy may be beneficial, however, this requires cell acquisition, culture and delivery. Endogenous mobilization of stem cells offers a non‐invasive alternative. The hypothesis was administration of VEGF and the CXCR4 antagonist AMD3100 would increase the circulating pool of available MSCs and improve fracture healing. Ex‐breeder female wistar rats received VEGF followed by AMD3100, or sham PBS. Blood prepared for culture and colonies were counted. P3 cells were analyzed by flow cytometry, bi‐differentiation. The effect of mobilization on fracture healing was evaluated with 1.5 mm femoral osteotomy stabilized with an external fixator in 12–14 week old female Wistars. The mobilized group had significantly greater number of cfus/ml compared to controls, p = 0.029. The isolated cells expressed 1.8% CD34, 35% CD45, 61% CD29, 78% CD90, and differentiated into osteoblasts but not into adipocytes. The fracture gap in animals treated with VEGF and AMD3100 showed increased bone volume; 5.22 ± 1.7 µm³ and trabecular thickness 0.05 ± 0.01 µm compared with control animals (4.3 ± 3.1 µm³, 0.04 ± 0.01 µm, respectively). Radiographic scores quantifying fracture healing (RUST) showed that the animals in the mobilization group had a higher healing score compared to controls (9.6 vs. 7.7). Histologically, mobilization resulted in significantly lower group variability in bone formation (p = 0.032) and greater amounts of bone and less fibrous tissue than the control group. Clinical significance: This pre‐clinical study demonstrates a beneficial effect of endogenous MSC mobilization on fracture healing, which may have translation potential to prevent or treat clinical fractures at risk of delayed or non‐union fractures. © 2018 The Authors. Journal of Orthopaedic Research® Published by Wiley Periodicals, Inc. on behalf of Orthopaedic Research Society. J Orthop Res 37:1294–1302, 2019.     

高糖对骨髓间充质干细胞作用机制的研究进展

骨髓间充质干细胞的功能改变与功能障碍是糖尿病性骨质疏松病态骨代谢模式的根本原因。在长期高糖环境下,骨髓间充质干细胞生物活性及功能特性发生紊乱。具体表现为：高糖会促进骨髓间充质干细胞的凋亡、自噬、铁死亡及成脂向分化,抑制其旁分泌及成血管向分化,但在细胞增殖、定向迁移及成骨向分化方面仍存在一定争议。因此,深入研究高糖对骨髓间充质干细胞的作用机制,有利于突破糖尿病性骨质疏松症干细胞疗法的局限性,挖掘潜能优势。