淫羊藿总黄酮对成骨细胞中OPG和RANKL mRNA基因表达影响的实验研究

目的:探讨淫羊藿总黄酮对大鼠成骨细胞中骨保护素(OPG)和核因子κB受体激活因子配体(RANKL) mRNA基因表达的影响.方法:体外培养成骨细胞,分别加入含0.1、1、10、100 ng/ml淫羊藿总黄酮(HEF)的培养液,48 h及96 h后分别提取细胞总mRNA,用RT-PCR方法分析OPG/RANKL的mRNA的表达,进行半定量分析.结果:培养48 h后,与对照组比较,HEF增强了OPG mRNA的表达,有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01),VOPG/VRANKL比值增大;96 h后,HEF明显增强了OPG mRNA的表达,各浓度组与对照组相比,均有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01),各浓度组VOPG/VRANKL比值增大,有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01).结论:淫羊藿总黄酮可能通过增加成骨细胞OPG的表达来抑制破骨细胞的分化和成熟,从而抑制骨吸收,达到治疗骨质疏松症的目的.     

两种杜仲黄酮类化合物对成骨细胞OPG/RANKL及成骨相关转录因子的影响

目的:研究杜仲黄酮类化合物紫云英苷和黄芩素对成骨细胞特异性转录因子Osterix及破骨细胞抑制因子与核因子κB受体活化因子配体比值(OPG/RANKL)的影响。方法:采用MC3T3-E1 Subclone 14成骨细胞,不同浓度紫云英苷和黄芩素和维生素D3组加入质量浓度为30 mg·L-1作用细胞24 h后,用MTT法检测细胞增殖情况,成骨细胞接种于24孔板后,空白组加入培养基,给药组分别加入质量浓度为80 mg·L-1(高浓度),40 mg·L-1(中浓度),7.5 mg·L-1(低浓度)的含紫云英苷或黄芩素,作用24 h后,ELISA法检测钙离子活性,蛋白免疫印迹法检测Osterix,OPG以及RANKL的蛋白表达水平。结果:与空白组相比,紫云英苷和黄芩素可后明显促进MC3T3-E1 Subclone 14成骨细胞的增殖(P<0.05);明显上调OPG和Osterix的表达(P<0.05),同时能降低RANKL的表达(P<0.05)。结论:杜仲黄酮类化合物紫云英苷和黄芩素能促进MC3T3-E1Subclone 14成骨细胞增殖,并上调Osterix和OPG/RANKL。     

刺老苞根皮黄酮类化合物对破骨细胞分化的影响

目的：研究刺老苞根皮黄酮类化合物对体外破骨细胞分化的影响。方法：建立由骨保护素配体（RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）共同细胞因子的小鼠破骨细胞骨髓诱导体系,将不同浓度的刺老苞根皮黄酮类化合物作用于破骨细胞。受试细胞分为对照组、刺老苞根皮黄酮类化合物低剂量组（10-8mol·L^-1）、刺老苞根皮黄酮类化合物中剂量组（10^-7mol·L^-1）和刺老苞根皮黄酮类化合物高剂量组（10^-6mol·L^-1）,并设立空白对照组。7天后取细胞玻片进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色,观察破骨细胞并计数;测量抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性以及破骨细胞表面NF—kB活化受体（RAVK）mRNA表达量。结果：诱导培养的破骨细胞形态特征明显;刺老苞根皮黄酮类化合物中、高剂量组在细胞数量、TRAP活性上与对照组相比有明显统计学差异（P〈0．05）;刺老苞根皮黄酮类化合物各剂量组在（RANK）mRNA表达量上与对照组相比有明显统计学差异（P〈0．05）,且呈量效关系。结论：刺老苞根皮黄酮类化合物可以抑制体外培养的破骨细胞分化。     

新疆马鹿角提取物对MC3T3-E1成骨细胞RANKL/OPGmRNA表达的影响

目的 研究新疆马鹿角提取物对MC3T3-E1成骨细胞核因子-kβ受体活化因子配体(RANKL)/护骨素(OPG)mRNA表达的影响.方法 体外培养MC3T3-E1成骨细胞,分别加入含不同剂量新疆马鹿角提取物的培养液,72 h后分别提取细胞总RNA,用RT-PCR方法检测RANKL/OPG mRNA表达.结果 培养72 h后RANKL/OPG mRNA表达的灰度值(0.312±0.0710),与对照组(2.017±0.1320)比较,新疆马鹿角提取物呈浓度依赖性降低RANKL mRNA的表达,增加OPG mRNA的表达,各剂量组RANKL/OPG mRNA吸光度比值降低.结论 新疆马鹿角提取物可能通过调节成骨细胞RANKL/OPG的基因表达,而抑制破骨细胞介导的骨吸收.     

刺老苞根皮黄酮类化合物对抗大鼠泼尼松性骨质疏松的作用研究

目的 研究刺老苞根皮黄酮类化合物对泼尼松致大鼠骨质疏松的对抗作用.方法 将50只大鼠随机分成正常对照组、泼尼松模型组和刺老苞根皮黄酮类化合物高、中、低(10,20,30 mg/kg)剂量组,每组10只.分别灌胃相应药物,1次/d,连续8周后取血清检测生化指标,对骨进行组织切片检查,长度、宽度以及骨质的测量.结果 泼尼松模型组大鼠股骨重量、尺骨骨羟脯氨酸和骨钙含量比正常对照组明显降低,胫骨骨髓腔中脂肪组织增多(P<0.01),血浆胆固醇(TG)含量上升、碱性磷酸酶(ALP)和高密度脂蛋白(HDL)含量下降(P<0.01).刺老苞根皮黄酮类化合物组能有效提高骨的重量和骨质的含量(P<0.01),减少骨髓腔中脂肪的含量,升高碱性磷酸酶和高密度脂蛋白含量(P<0.01).结论 泼尼松可抑制大鼠的骨生长及引起骨丢失,而刺老苞根皮黄酮类化合物可有良好的对抗作用.     

薯蓣皂苷元对大鼠成骨细胞增殖、分化及OPG/RANKL mRNA表达的影响

目的:研究薯蓣皂苷元对体外培养的大鼠成骨细胞增殖、分化及护骨素/核因子κB受体活化因子配基(OPG/RANKL) mRNA的影响,探讨薯蓣皂苷元预防与治疗骨质疏松的作用机制。方法:在体外培养的大鼠成骨细胞培养基中分别加入不同浓度的薯蓣皂苷元作用不同时间,用MTT法检测药物对成骨细胞增殖的影响,检测成骨细胞内ALP活性分析药物对成骨细胞分化的影响,用半定量RT-PCR检测成骨细胞内OPG/RANKL mRNA的表达量,分析药物对破骨细胞重要信号传导通路OPG/RANKL/RANK系统的影响。结果:3.64×10-8-3.64×10-7mol/L的薯蓣皂苷元作用于大鼠成骨细胞3d,可促进成骨细胞的增殖(P<0.01),上调成骨细胞内OPG/RANKL mRNA的比值(P<0.01);作用7d,可提高成骨细胞内ALP活性(P<0.05或P<0.01)。结论:适量浓度薯蓣皂苷元可促进成骨细胞的增殖、分化及抑制破骨细胞的形成。     

刺老苞根皮黄酮类化合物对维甲酸致大鼠骨质疏松的影响

目的研究刺老苞根皮黄酮类化合物对维甲酸致大鼠骨质疏松的影响。方法将60只大鼠随机分成对照组,模型组,刺老苞根皮黄酮类化合物高、中、低剂量(10、20、30 mg/kg)组和仙灵骨葆胶囊(20 mg/kg)阳性对照组,每组10只。各组以ig维甲酸70 mg/kg造模后,各给药组分别ig给予相应药物,每日1次,连续8周。取血清检测相关生化指标,进行骨组织切片检查和骨生化指标检测,测定股骨长度、宽度及质量。结果与对照组比较,模型组大鼠股骨质量、尺骨羟脯氨酸(Hyp)和骨钙的量明显降低,胫骨骨髓腔中脂肪组织增多(P<0.01),血浆胆固醇(TC)水平升高、碱性磷酸酶(ALP)和高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)水平降低(P<0.01)。与模型组比较,刺老苞根皮黄酮类化合物各剂量组能有效增加骨质量和提高骨质的量(P<0.01),减少骨髓腔中脂肪的量,升高ALP和HDL-C的量(P<0.01)。结论刺老苞根皮黄酮类化合物可有效对抗维甲酸引起的大鼠骨生长抑制及骨丢失。     

刺老苞根皮含药血清对原代成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响

该文研究了不同浓度刺老苞根皮含药血清对原代成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin,Wnt-1,Frizzed-2,TCF和Axin表达的影响。经SPF级健康雌性SD大鼠(80只)给予蒸馏水、刺老苞根皮水煎剂高、中、低3种剂量,连续灌胃7d,制备刺老苞根皮含药血清。体外培养原代成骨细胞(OB)并鉴定,取第3代成骨细胞,培养48 h后用各组含药血清干预培养10 d,采用茜素红染色钙化结节并计数;干预培养48 h后收集细胞,分别采用Real-time PCR(RT-PCR)和Western blot法测定β-catenin,Wnt-1,Frizzed-2,TCF和Axin的表达情况。结果显示,经鉴定体外培养细胞为原代成骨细胞;在干预培养后,与模型组相比,各剂量组可促进原代成骨细胞的矿化能力,且上调β-catenin,Wnt-1,Frizzed-2,TCF mRNA和蛋白的表达,下调Axin mRNA和蛋白的表达。结果发现刺老苞根皮含药血清可通过调节原代成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin,Wnt-1,Frizzed-2,TCF和Axin表达,增强成骨细胞的分化和增殖。     

柚皮苷对小鼠成骨细胞MC3T3 E1增殖、分化和矿化的影响

目的:检测骨碎补有效成分柚皮苷对成骨细胞株MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的影响.方法:以成骨细胞株MC3T3-E1细胞为体外药效的试验模型(药物组和对照组),通过CCK-8法观察10,1,0.1,0.01,0.001,0.000 1μmol·L~(-1)的柚皮苷溶液对MC3T3-E1细胞增殖能力的影响;通过乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验观察以上浓度的柚皮苷溶液对细胞毒性能力的影响.通过骨形成蛋白-2(BMP-2),碱性磷酸酶(ALP)活性测定和骨钙素(OC)含量测定观察柚皮苷对MC3T3-E1细胞分化能力的影响;通过Von kossa钙化染色法观察柚皮苷对MC3T3-E1细胞钙化能力的影响.结果:高浓度的柚皮苷溶液在12 h和24 h时能促进MC3T3-E1细胞的增殖作用.而低浓度的柚皮苷溶液则无此作用.所测的各个组别细胞毒性百分比都较小,且随着时间的推移(12,24,48 h)变化较小.光镜下观察各个时间点细胞的密度和形态也未发生明显的变化.BMP-2细胞免疫化学结果表明,24,48 h时柚皮苷浓度10,1,0.1μmol·L~(-1)包浆内棕色着色比对照组明显.ALP检测结果表明48 h时,1,0.1μmol·L~(-1)的柚皮苷溶液可提高MC3T3细胞的ALP活性(P<0.05).72 h时,0.1 μmol·L~(-1)的柚皮苷溶液可提高MC3T3细胞的ALP活性(P<0.05).OC检测结果表明12 d时,10,1μmol·L~(-1)柚皮苷溶液作用组与对照组相比OC活性明显提高(P<0.05).Vonkossa染色钙化面积百分比结果表明3组柚皮苷溶液作用组与对照组相比无明显区别.结论:柚皮苷溶液可以提高成骨细胞株MC3T3-E1增殖能力和分化能力.     

补肾强督方含药血清对强直性脊柱炎OPG/RANKL通路的作用

目的探讨补肾强督方对强直性脊椎炎(ankylosing spondylitis,AS)骨保护素和核转录因子-κB受体活化因子配基(osteoprotegerin receptor activator for nuclear factorκB ligand,OPG/RANKL)通路的作用机制。方法选取2009年1-5月卫生部中日友好医院中医风湿病科门诊和住院活动期AS患者30例,予补肾强督方,每天1剂,早晚分两次口服,连续3个月;另选取健康志愿者30名。采集治疗前后患者血清及健康人血清。将成骨细胞hFOB1.19分为患者治疗前组、治疗后组及健康人组(对照组)。各组细胞分别于含相应血清的基础培养基中进行培养。取成骨细胞培养上清液,采用ELISA法检测成骨细胞OPG/RANKL含量及mRNA表达,采用RT-PCR检测OPG/RANKL蛋白表达。结果与对照组比较,治疗前组成骨细胞OPG含量、OPG mRNA及蛋白表达、OPG/RANKL mRNA及蛋白表达均降低,RANKL mRNA表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与治疗前组比较,治疗后组OPG含量、OPGmRNA及蛋白表达、OPG/RANKL mRNA及蛋白表达升高,RANKL mRNA表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论 AS患者血清能直接抑制成骨细胞OPG表达、促进RANKL表达、下调OPG与RANKL比率,补肾强督方治疗后的血清能直接促进成骨细胞表达OPG,抑制表达RANKL,上调OPG与RANKL比率,补肾强督方可能是通过直接上调成骨细胞OPG/RANKL而抑制破骨细胞分化和功能,达到促进骨生成,抑制骨吸收。     

刺老苞根皮黄酮对骨折模型大鼠骨质代谢的影响研究

目的研究刺老苞根皮黄酮对胫骨骨折模型大鼠骨质代谢变化的影响。方法将50只6周龄SD（雌雄各半）大鼠随机分成5组,即对照组（A组）、模型组（B组）、刺老苞根皮黄酮低剂量组（C组）、刺老苞根皮黄酮中剂量组（D组）、刺老苞根皮黄酮高剂量组（E组）,每组10只。其中刺老苞根皮黄酮低、中、高剂量组给予刺老苞根皮黄酮相应剂量灌胃（分别为10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg）,对照组和模型组以等量的0.9%NaCl溶液灌胃。观察各组灌胃第4天、7天、14天、21天、28天不同时间点其他骨代谢相关参数（碱性磷酸转移酶、骨钙素、羟脯氨酸以及骨盐）变化情况。结果与对照组比较,模型组不同时间点的骨碱性磷酸转移酶（ALP）、骨钙素、羟脯氨酸、骨钙、骨磷含量均降低,差异有统计学意义（P〈0.01）。与模型组比较,刺老苞根皮黄酮各剂量组除骨折第4天外其他时间点的ALP、羟脯氨酸、骨钙、骨磷含量均升高,差异有统计学意义（P〈0.05或P〈0.01）;而刺老苞根皮黄酮各剂量组骨钙素的含量在骨折第14天、第21天及第28天升高,差异有统计学意义（P〈0.05或P〈0.01）。与低剂量组比较,中、高剂量组除骨折第4天外其他时间点的骨碱性磷酸转移酶（ALP）、骨钙素、羟脯氨酸、骨钙、骨磷含量均升高,差异有统计学意义（P〈0.05或P〈0.01）。与中剂量组比较,高剂量组除骨折第4天外其他时间点的骨碱性磷酸转移酶（ALP）、骨钙素、羟脯氨酸、骨钙、骨磷含量均升高,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论刺老苞根皮黄酮可以改善胫骨骨折大鼠骨代谢状况,有利骨折愈合修复。     

基于分子对接的方法探讨桑根酮C对MC3T3-E1细胞的作用

目的:观察桑根酮C(SanC)对地塞米松(DEX)作用下小鼠MC3T3-E1成骨细胞增殖与分化的影响,并探讨其作用机制。方法:将SanC与同源建模所得的Runt-相关转录因子2(Runx2)蛋白结构进行分子对接。不同浓度SanC(8,16,32μmol·L^-1)和1μmol·L^-1DEX共同作用MC3T3-E1细胞,而后采用细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)法检测SanC对MC3T3-E1成骨细胞增殖影响。试剂盒测定MC3T3-E1成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性和茜素红染色检测骨矿化结节的形成。采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测Runt-相关转录因子2(Runx2),ALP,和锌指结构转录因子(Osterix)mRNA的表达水平。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Runx2蛋白表达。结果:SanC与Runx2对接打分为-9.78。与正常组比较,DEX组显著降低细胞存活率(P<0.01),其中7 d存活率差异达到最大;与DEX组比较,SanC能显著促进MC3T3-E1的细胞增值(P<0.01),其中32μmol·L^-1SanC作用细胞7 d增殖率差异达到最大。与正常组比较,DEX组Runx2,ALP和Osterix mRNA的表达均有一定程度升高(P<0.05);与DEX组比较,不同浓度SanC组依赖性上调Runx2,ALP和Osterix mRNA的表达(P<0.01)。与正常组比较,DEX组Runx2蛋白表达明显下降(P<0.05);与DEX组比较,SanC干预下细胞Runx2蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论:桑根酮C能促进MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化和矿化,其机制可能与上调Runx2表达有关。     

刺老苞根皮黄酮类化合物抗去势雌性大鼠骨质疏松症实验研究

目的探讨刺老苞根皮黄酮类化合物对去卵巢骨质疏松模型大鼠的影响。方法将72只15周龄SD大鼠随机分为空白组、模型组、尼尔雌醇组及刺老苞根皮黄酮类化合物高、中、低剂量组,每组12只。空白组行假手术,其余5组行卵巢切除术,术后用药12周后处死,测定右侧股骨骨密度、骨矿含量、血清雌二醇、碱性磷酸酶含量及子宫湿重。结果与模型组比较,刺老苞根皮黄酮类化合物高、中、低剂量组、尼尔雌醇组能对抗骨密度、骨矿含量、血清雌二醇的下降、血清碱性磷酸酶的升高（P〈0.05）,对抗子宫指数的减轻（P〈0.05）。结论刺老苞根皮黄酮类化合物可以改善骨质量,抑制大鼠去卵巢骨质疏松的发生,具有类雌激素的效应。     

薯蓣皂苷片对类风湿性关节炎大鼠血清OPG/RANKL水平表达的干预作用

目的观察薯蓣皂苷片对类风湿性关节炎模型大鼠血清骨保护素(OPG)、核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)表达水平的影响。方法 SD大鼠,随机分为6组,每组10只,其中选取10只作为正常组,其余大鼠采用弗氏完全佐剂复制类风湿性关节炎动物模型,并将造模成功的类风湿性关节炎大鼠随机分为模型组、阳性组(甲氨蝶呤组,3.8mg·kg~(-1))、薯蓣皂苷片高、中、低剂量组(10 mg·mL~(-1)、20 mg·mL~(-1)、30mg·mL~(-1)),连续灌胃给药治疗24 d后处死,采用ELISA法检测血清OPG、RANKL水平。结果薯蓣皂苷片各剂量组大鼠血清OPG、RANKL水平分别为(95.27±4.24)、(76.44±4.09)、(69.26±5.63)pmol·L~(-1)和(96.07±4.94)、(85.41±3.75)、(67.53±2.23)pmol·L~(-1),与模型组((53.92±2.83)pmol·L~(-1)和(116.18±3.02)pmol·L~(-1))相比均有显著性差异(P0.05);OPG/RANKL比值显著高于模型组。结论薯蓣皂苷片可能通过调整OPG/RANKL动态平衡而对破骨细胞功能产生影响,从而防止骨破坏。     

小鼠去卵巢骨质疏松模型的建立及OPG／RANKL的表达

目的：建立小鼠去卵巢骨质疏松模型，并检测骨基因调控因子的表达水平。方法：取小鼠行切除卵巢手术和假手术后3周，测定子宫重量系数，进行石蜡切片病理学检查，并采用RT—PCR测定护骨素（OPG）和细胞核因子-κB受体激活物配基（RANKL）的相对表达水平。结果：小鼠去卵巢后3周，与假手术组相比，去卵巢组的子宫重量系数、骨小梁分布密度和骨皮质厚度降低，骨组织中的OPG和RANKL mRNA相对表达水平分别显著性降低和升高，其比例极其显著性降低。结论：成功建立了小鼠去卵巢骨质疏松模型，并展开骨基因调控因子的检测，为实验室研究药物对骨质疏松的影响提供方法学基础。