第4代大鼠脂肪间充质干细胞的免疫表型鉴定

背景:有文献证实以酶消化法可获得在脂肪组织间充质干细胞,传至第10代时细胞生长仍良好,但表面标志物表达下降. 目的:分离培养大鼠脂肪组织间充质干细胞,传代至第4代,检测免疫表型. 方法:从6只SD大鼠腹股沟脂肪垫中分离培养脂肪组织间充质干细胞,以贴壁细胞扩增传代至第4代.相差显微镜下观察脂肪组织间充质干细胞的形态,并用流式细胞术鉴定脂肪组织间充质干细胞的表面标志物CD11b,CD29,CD45,CD49d,CD90 和 CD106的表达率.结果与结论:大鼠脂肪组织间充质干细胞呈现类似成纤维细胞样形态学特征,免疫表型分析显示CD29和CD90 呈阳性,而CD11b、CD45、CD49d和CD106呈阴性反应.结果提示通过这种酶消化法获得的SD大鼠的脂肪组织间充质干细胞,免疫表型分析显示符合间充质干细胞的特征.     

兔脂肪间充质干细胞分离培养及其向神经细胞分化的特征

目的:分离培养兔脂肪间充质干细胞,探讨兔脂肪间充质干细胞在体外向神经细胞分化的能力。方法:实验于2002-09/2005-09在陕西省干细胞工程技术研究中心完成。选取清洁级新西兰大白兔5只,采用Ⅰ型胶原酶消化兔腹股沟皮下脂肪组织,分离培养脂肪间充质干细胞。取生长状况良好的第2,5,10代细胞,绘制生长曲线,计算细胞群体倍增时间。采用免疫组化方法对脂肪间充质干细胞表面分子标志[CD14,CD29,CD34,CD44,CD45,CD105及人白细胞抗原DR亚类(群)]进行鉴定,并采用1,2.5,5,10mmol/L不同浓度的β-巯基乙醇检测脂肪间充质干细胞向神经细胞分化的能力。结果:①脂肪间充质干细胞生长曲线分析:第2,5,10代细胞体外传代培养的潜伏期约为24～48h,传代培养细胞的对数增殖期为6d,接种后第9天进入平台期。在细胞生长的对数期,脂肪间充质干细胞的倍增时间为64.12h。②脂肪间充质干细胞分子特征的鉴定结果:第2～5代细胞90%以上CD29,CD44,CD105呈阳性表达,而不表达CD14,CD34,CD45及人白细胞抗原DR亚类(群)等表面分子标记。③脂肪间充质干细胞向神经细胞分化情况:体外能够分化为神经细胞。结论:兔脂肪组织可分离培养出脂肪间充质干细胞,并能够向神经细胞分化,有望成为组织工程的种子细胞来源。     

人脂肪来源间充质干细胞成骨及成软骨的潜能

背景:人脂肪来源间充质干细胞是种具有较强的体外增殖和多系分化能力的成体干细胞,可以从美容吸脂手术中获得,取材方便,原料来源丰富,在生物治疗应用方面蕴藏着巨大的价值。目的:体外分离、培养人脂肪来源间充质干细胞,探讨其基本生物学特性及成骨成软骨的潜能。方法:取美容吸脂获得的脂肪组织,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养;观察细胞形态、测定细胞周期、流式细胞仪鉴定细胞表面标志;取第3代细胞,分别加入成骨诱导培养基及成软骨诱导培养基行体外成骨及成软骨诱导。结果与结论:体外培养人脂肪来源间充质干细胞呈纤维样形态,原代细胞24h内贴壁,培养5~7d后开始形成细胞集落;经细胞周期检测显示G0/G1,S和G2/M所占比例分别为(88±2)%,(12±2)%和0.03%。经流式细胞仪检测CD29和CD105呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达。RT-PCR检测显示,人脂肪间充质干细胞经成骨诱导分化后细胞中骨桥蛋白mRNA呈阳性表达,经软骨诱导分化后细胞中Ⅱ型胶原mRNA呈阳性表达。结果证实,实验成功体外分离、培养人脂肪来源间充质干细胞,其具有向成骨细胞和软骨细胞分化的潜能。     

人脂肪间充质干细胞的分离培养及其鉴定

背景:人脂肪间充质干细胞在不同的条件下被成功诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、肝脏细胞等中胚层细胞,同时也可以向其他胚层分化,证明脂肪间充质干细胞是多分化潜能干细胞. 目的:探讨人脂肪间充质干细胞的分离、鉴定方法.方法:整形外科吸脂术获得腹部皮下脂肪,0.075%Ⅰ型胶原酶消化,贴壁培养获得人脂肪间充质干细胞,绘制细胞增殖曲线,进行流式细胞、细胞周期、免疫荧光等检测,并验证其是否具有多功能分化潜能.结果与结论:获得形态较均一的长梭形的人脂肪间充质干细胞,细胞增殖良好,有明显的指数生长期,体外能长期培养存活,并保持不分化状态;流式检测细胞高表达CD105、CD90,低表达CD34、CD45;多数细胞周期检测G0/G1期占80%以上.能向成脂、成骨诱导分化.结果表明,实验分离获得的细胞是具有脂肪间充质干细胞特性的细胞,为深入研究人脂肪间充质干细胞打下基础.     

体外培养成人脂肪间充质干细胞生物学特性及向心肌样细胞的诱导分化

目的:体外分离培养成人脂肪组织来源的间充质干细胞,探索其基本生物学特性及向心肌细胞诱导分化的潜能,为心肌再生提供理想的自体干细胞来源。方法:实验于2005-01/12在解放军兰州军区兰州总医院医学实验中心完成。取本院微创外科中心一急性单纯性阑尾炎患者大网膜脂肪组织(取得家属同意并告知仅用作实验室研究)。体外分离成人脂肪组织来源的间充质干细胞并传代扩增培养。采用相差显微镜及透射电镜观察细胞形态学特点,四氮唑蓝比色法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期及CD44、CD34的表达,第4代细胞用5-氮胞苷诱导使其向心肌细胞分化,免疫细胞化学鉴定心肌样细胞。结果:①分离培养的脂肪间充质干细胞经传代纯化后细胞形态呈均一梭形生长,电镜显示细胞较为幼稚,核大,核仁明显,常染色质多,异染色质少,细胞器结构及种类简单,以粗面内质网和线粒体为主。②细胞生长曲线呈“S”形,第1和2天为细胞生长潜伏期,第3天开始进入对数生长期,第7天达顶点,群体细胞倍增时间为18～20h。③流式细胞仪检测91.83%细胞CD44表达阳性、CD34阴性。④细胞周期分析显示76.2%细胞处于G0/G1期,S期细胞占8.7%,G2/M细胞占15.1%。⑤5-氮胞苷诱导后4周免疫细胞化学显示部分细胞缝隙连接蛋白-43表达阳性,表达率约为(29.0±1.2)%。结论:成人脂肪组织存在细胞活力旺盛的间充质干细胞且易于体外分离扩增,并在体外一定条件下具有向心肌细胞分化的潜能,可望成为心肌再生医学理想的自体干细胞种子来源。     

兔脂肪间充质干细胞分离培养及其向神经细胞分化的特征

目的：分离培养兔脂肪间充质干细胞，探讨兔脂肪间充质干细胞在体外向神经细胞分化的能力。 方法：实验于2002-09／2005—09在陕西省干细胞工程技术研究中心完成。选取清洁级新西兰大白兔5只，采用1型胶原酶消化兔腹股沟皮下脂肪组织，分离培养脂肪间充质干细胞。取生长状况良好的第2，5，10代细胞，绘制生长曲线，计算细胞群体倍增时间。采用免疫组化方法对脂肪间充质干细胞表面分子标志[CD14，CD29，CD34，CD44．CD45，CD105及人白细胞抗原DR亚类（群）]进行鉴定，并采用1，2、5，5，10mmol／L不同浓度的β-巯基乙醇检测脂肪间充质干细胞向神经细胞分化的能力。 结果：①脂肪间充质干细胞生长曲线分析：第2，5．10代细胞体外传代培养的潜伏期约为24-48h，传代培养细胞的对数增殖期为6d，接种后第9天进入平台期。在细胞生长的对数期．脂肪间充质干细胞的倍增时间为64．12h。②脂肪间充质干细胞分子特征的鉴定结果：第2～5代细胞90％以上CD29，CD44，CD105呈阳性表达，而不表达CD14，CD34．CD45及人白细胞抗原DR亚类（群）等表面分子标记。③脂肪间充质干细胞向神经细胞分化情况：体外能够分化为神经细胞。 结论：兔脂肪组织可分离培养出脂肪间充质干细胞，并能够向神经细胞分化，有望成为组织工程的种子细胞来源。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及BrdU标记鉴定

背景:骨髓间充质干细胞具有多向分化能力,是目前极具潜力的细胞及基因治疗的靶细胞.目的:拟在体外建立一种分离纯化、培养扩增、标记骨髓间充质干细胞的方法.设计、时间和地点:开放性实验,于2008-03/05在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成.材料:人骨髓间充质干细胞取自临床骨髓穿刺检查正常的住院患者,无血液系统疾病和家族遗传病史,由南昌大学第一附属医院提供.方法:密度梯度离心和贴壁培养相结合,分离纯化骨髓间充质干细胞,并用BrdU标记.主要观察指标:相差显微镜下观察人骨髓间充质干细胞的形态变化;流式细胞仪检测入骨髓间充质干细胞的表面标记以及细胞周期:绘制人骨髓间充质干细胞生长曲线;透射电镜观察人骨髓间充质干细胞的超微结构.结果:密度梯度离心结合贴壁法能分离培养出纯度较高的人骨髓间充质干细胞.流式细胞仪检测入骨髓间充质干细胞CD90,CD29,CD44,CD34,CD45阳性细胞表达分别为98.48%,98.74%,97.41%.0.36%,0.64%.人骨髓间充质干细胞的生长曲线呈S形.透射电镜可见人骨髓间充质干细胞胞质丰富,粗面内质网发达,大量蛋白分泌物.免疫组织化学检测BrdU标记48 h后人骨髓间充质干细胞标记率80%.结论:采用淋巴细胞分离液密度梯度离心和贴壁培养相结合,以获得纯度较高和活性骨髓间充质干细胞,是简便可行的方法:BrdU是一种简单、有效的标记骨髓间充质干细胞的方法.     

高度同源性人脂肪间充质干细胞体外分离培养条件的优化

背景:目前关于人脂肪间充质干细胞有效分离培养及扩增的方法尚未统一.目的:拟在体外建立人脂肪间充质干细胞的有效分离方法.设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-06/12在吉林大学病理生物学教育部重点实验室完成.材料:手术切除的人腹部脂肪由吉林大学附属医院提供,提供者对实验均知情同意.方法:取腹部脂肪,去除结缔组织和血管,用0.1%Ⅰ型胶原酶37℃振荡消化60 min,过滤后离心,将位于最下层的片状沉淀用含体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM条件培养基重悬,调整细胞密度至1×10~9L~(-1)接种于6孔板中,于37℃、体积分数为5%的CO_2孵箱内培养,待细胞接近80%～90%融合时消化传代.取P3代细胞,分别进行成骨及成脂肪诱导.主要观察指标:应用激光扫描共聚焦显微镜观察人脂肪间充质干细胞形态学特点;采用流式细胞仪和免疫荧光法检测其免疫学表型、细胞周期、生长曲线;观察其多向分化潜能.结果:分离培养的人脂肪间充质干细胞为成纤维细胞样,呈漩涡状排列.P3代人脂肪间充质干细胞呈CD73,CD105,CD166,CD44及CD29阳性,而CD31,CD34,CD45及HLA-DR阴性;具有典型的干细胞增殖特点,83.81%细胞处于G_0/G_1期,仅16.19%细胞处于S+G2/M期;细胞在接种后前2 d处于生长潜伏期.第3～6天处于对数生长期,第6天达峰值,以后细胞生长速度减慢,进入生长平台期,平均五六天传代1次.成骨诱导2周后,细胞碱性磷酸酶染色呈阳性;成脂诱导3 d后,细胞内有小脂滴出现,油红O染色呈阳性.结论:分离脂肪组织的过程中去除大体可见的血管与结缔组织可减少细胞污染;胶原酶浓度为0.1%和振荡消化时间为60 min时,可使基质细胞和脂肪基质纤维成分有效分离,以及使胶原酶与组织得到充分接触,从而获得高度同源性的人脂肪间充质干细胞.     

兔脂肪干细胞的多向诱导分化

背景:研究表明脂肪干细胞体外特定诱导条件下实现了向骨、软骨、脂肪、肌肉、心肌细胞、神经细胞、上皮细胞以及肝细胞方向分化。目的:进一步验证脂肪干细胞的分离培养方法及其基本生物学特性,并对细胞表型进行鉴定。方法:从成年日本大耳白兔的颈背部分离脂肪组织,通过Ⅰ型胶原酶消化法获取原代脂肪干细胞并培养,待细胞生长至约80%融合时传代,用倒置显微镜逐日观察细胞生长情况和形态特征,描绘其生长曲线;流式细胞技术检测细胞表面标记物;将脂肪干细胞行成骨和成脂诱导,分别通过碱性磷酸酶、茜素红、VonKossa(钙结节)染色和油红O染色检测脂肪干细胞成骨分化潜能和成脂分化潜能,以未诱导细胞作为对照组。结果与结论:体外培养的脂肪干细胞呈梭形纤维样细胞形态,增殖活跃,多次传代后细胞仍保持较强增殖能力,生长曲线呈"S"型。流式细胞仪检测第3,6代脂肪干细胞均高表达CD29、CD44,阳性率超过90%;低表达CD34、CD45阳性率不超过5%,且CD29、CD44随着传代表达逐渐增高,CD34、CD45随细胞培养时间延长表达逐渐降低。成骨诱导实验组碱性磷酸酶、茜素红、vonKossa染色阳性,成脂诱导实验组油红O染色阳性,对照组均为阴性。结果证实,兔脂肪干细胞在体外易于分离培养,保持稳定增殖,并表达间充质干细胞相关的表型,特定条件下可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。     

人脐带血间充质干细胞体外分离培养研究

目的:探讨人脐带血来源间充质干细胞体外分离及培养方法.方法:采用Ficoll-paque(1.077 g/ml)分离液密度梯度离心法结合直接贴壁分离人脐带血单个核细胞中间充质干细胞(MSCs),20?S/DMEM培养,培养至48 h换液并将其上清加入另一培养皿继续培养.观察2个时期细胞贴壁情况;应用流式细胞仪检测各时期细胞.结果:密度梯度法分离来脐血单个核细胞进行培养,可观察12 h即可见少量细胞贴壁生长,绝大部分MSCs在96 h内完成贴壁,经传代纯化第1、2个48 h贴壁细胞均可培养出形态呈较均一长梭形细胞.流式细胞仪检测:单个核细胞中CD44 细胞比例占7.1%、CD34 占28.9%,而在第1个48 h贴壁细胞CD44 、CD34 比例分别占47.2%、6.7%;而第2个48 h贴壁细胞CD44 、CD34 分别占53.3%、4.6%.结论:人脐血间充质干细胞能在体外分离培养,贴壁细胞稳定表达MSCs相关抗原.