含NURR1基因腺病毒对神经干细胞分化的影响

目的含NURR1基因的重组腺病毒对神经干细胞分化的影响.方法免疫组化观察转染腺病毒后C17.2神经干细胞后分化效率.结果含NURR1基因的重组腺病毒可使C17.2神经干细胞分化后近76%细胞表现为神经元显型.结论含NURR1基因的腺病毒能明显的提高神经干细胞的分化效率.     

AADC和NURR1基因联合c17.2神经干细胞移植治疗帕金森病的实验研究

目的研究芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)基因和NURR1基因联合c17．2神经干细胞脑内移植后对帕金森病模型大鼠的治疗效果。方法人类神经元性AADC基因和NURR1基因真核表达载体分别转染至c17．2神经干细胞内。将帕金森病(PD)模型大鼠随机分为4组,分别予以脑内毁损侧纹状区移植含空质粒的c17．2神经干细胞(A组),pCDNA3-AADC转染后的c17．2神经干细胞(B组),pCDNA3-NURR1转染后的c17．2神经干细胞(C组)以及含有pCDNA3-AADC和pCDNA3-NURR1转染后的c17．2 神经干细胞(D组)。观察其病理性旋转行为的改善,采用酪氨酸羟化酶(TH)的免疫组化方法研究脑内多巴胺含量的变化,并用荧光示踪方法观察c17．2细胞在PD模型脑内的移行。结果各组动物脑内移植后动物旋转行为较前均有改善(P<0．05),尤以D组改善最为明显,其行为学最大改善达73．7％,且同A、B、C组间差异具有显著性(P<0．05)。免疫组化可见各组移植TH阳性细胞明显增多,TH染色的神经元树突或轴突密集,体内TH阳性区域明显较PD模型组扩大,其中尤以D组病理学改善最为明显。荧光示踪观察c17．2神经干细胞有突触形成,并与临近的细胞建立突触联系。结论 AADC基因联合NURR1基因共转染c17．2神经干细胞脑内移植后改善了动物的旋转行为,增加了脑内多巴胺的表达,且植入的神经干细胞可同宿主神经元形成突触联接,为研究多基因联合神经干细胞移植治疗帕金森病提供了新方法。     

TrkA基因修饰、诱导神经干细胞分化为胆碱能神经元

目的研究外源性TrkaA基因修饰C17．2神经干细胞，对神经干细胞定向分化的影响。方法采用脂质体法将携带有TrkA基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）/TrkA转染C17．2神经干细胞，Western blot观察转染后基因表达情况；将正常生长的C17．2神经干细胞随机分成两组（A组和C组），将重组质粒转染阳性的C17．2神经干细胞随机分成两组（B组和D组），并用100ng／mg神经生长因子（NCF）分别作用于C组及D组，应用间接免疫荧光染色方法，观察各组细胞胆碱乙酰转移酶（CHAT）的表达。结果Western blot结果显示转染组TrkA蛋白表达明显高于非转染组，说明外源性TrkA基因导入靶细胞，并实现蛋白表达；间接免疫荧光染色显示，经NGF孵育的转染组细胞（D组）约有26％呈ChAT阳性，而非转染组（C组）约为9％，未经NGF孵育的A、B组未观察到CHAT阳性细胞。结论应用外源性TrkA基因修饰神经干细胞，造成TrkA基因过度表达，在NGF作用下，可以诱导更多的神经干细胞向胆碱能神经元分化。     

转录因子X盒结合蛋白1转染对神经干细胞在缺氧环境下grp78、EDEM表达及抗凋亡能力的影响

目的将X盒结合蛋白1基因以重组腺病毒为载体转染胚鼠海马神经干细胞,观察其在缺氧环境下是否可以使移植后干细胞内grp78、EDEM表达增加以及对干细胞抗凋亡能力的影响。方法取孕16d SD大鼠胚鼠的海马组织进行神经干细胞的分离、克隆、nestin免疫荧光检测,以及传代和扩增。将重组腺病毒Ad-XBP1-EGFP质粒转染胚鼠海马神经干细胞,得到基因修饰后的胚鼠海马神经干细胞。选取未转染的神经干细胞标记为对照组、未转染组;选取转染后的神经干细胞标记为转染组。未转染组和转染组用CoCl2诱导缺氧,24h后WesternBlot检测3组神经干细胞中xbp-1,grp78,EDEM,bcl-2及bax表达,流式细胞术检测NSCs和XBP1-NSCs的凋亡情况。结果在缺氧条件下,与未转染组相比,转染组的grp78表达增加,EDEM表达水平上升,bcl-2水平上升,而bax水平下降(P0.05);转染组神经干细胞凋亡程度较未转染组减轻(P0.05)。结论可以利用重组腺病毒作为载体成功将X盒结合蛋白1基因导入胚鼠海马神经干细胞中;转染后的神经干细胞在缺血缺氧条件下grp78、EDEM水平上升,抗凋亡能力较普通神经干细胞明显增加。     

人LIM矿化蛋白1基因腺病毒重组表达载体构建及在犬骨髓间充质干细胞中的表达*◆

背景：研究表明LIM矿化蛋白1在体内和体外都可促使骨发生。 目的：应用Adeasy-1腺病毒系统构建含人LIM矿化蛋白1基因的腺病毒重组体,并感染犬骨髓间充质干细胞,检测其体外表达及诱导成骨作用。 方法：构建重组腺病毒质粒pAd-LMP-1,经人胚胎肾293细胞包装、扩增后得到复制缺陷重组腺病毒Ad-LMP-1,以最佳感染复数值体外感染犬骨髓间充质干细胞,行RT-PCR及 Western Blot检测LIM矿化蛋白1、骨形态发生蛋白7基因的表达。重组Ad-LMP-1和(或)外源性重组人骨形态发生蛋白7处理犬骨髓间充质干细胞,21 d后行矿化(钙)结节茜素红染色分析LIM矿化蛋白1基因的诱导成骨作用。 结果与结论：①将Ad-LMP-1以感染复数值100感染犬骨髓间充质干细胞可获得最佳感染效率,感染后骨髓间充质干细胞能在基因和蛋白水平表达LIM矿化蛋白1,未引起骨形态发生蛋白7基因的表达。②Ad-LMP-1或重组人骨形态发生蛋白7均不能单独促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,两者联合可促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化。③实验成功构建重组腺病毒载体Ad-LMP-1,并实现其在犬骨髓间充质干细胞中表达,证实了LIM矿化蛋白1在诱导成骨作用中表现为与外源性重组人骨形态发生蛋白7的协同效应。     

重组腺病毒Ad-LMP-1感染大鼠骨髓间充质干细胞

背景：LIM矿化蛋白1 (LIM Mineralization protein, LMP-1)是一种细胞内非分泌蛋白，可以通过招募众多的成骨因子共同参与成骨细胞的分化。LMP-1在成骨上游水平发挥的强大作用提示了其在骨骼重建方面具有巨大的应用潜力。 目的：观察重组腺病毒Ad-LMP-1感染骨髓间充质干细胞的效果，及对其分化的影响。 方法：大鼠骨髓间充质干细胞分离培养，传代后，检测特异性标记物CD44的表达情况，矿化液诱导细胞成骨分化后用茜素红染色鉴定。感染重组腺病毒Ad-LMP-1后通过观察绿色荧光蛋白表达情况计算转染效率，RT-PCR及Western blot验证感染效果，观察感染Ad-LMP-1 2，7，14 d后骨髓间充质干细胞的形态变化和对细胞增殖活力的影响。 结果与结论：传代细胞形态一致，排列紧密。矿化液诱导后，细胞形态明显改变。茜素红染色结果表明，诱导后出现钙化结节。观察绿色荧光蛋白信号表明重组病毒Ad-LMP-1感染骨髓间充质干细胞效率在85%左右。感染重组腺病毒Ad-LMP-1后第7天出现了细胞形态改变，14 d出现类钙化结节，但不伴有细胞增殖活力改变。结果提示重组腺病毒Ad-LMP-1可以有效地感染原代培养的骨髓间充质干细胞，并诱导其向成骨细胞分化。     

腺病毒载体Ad-BDNF-EGFP构建及其在神经干细胞中的表达

摘要 目的 研究腺病毒载体Ad-BDNF -EGFP的构建及在神经干细胞（NSCs）中的表达。方法 通过RT-PCR从在大鼠的海马中获得BDNF基因,通过基因克隆以及HEK293包装,获得了含增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组腺病毒表达载体pAd-BDNF-EGFP,将其感染原代培养的神经干细胞,观察EGFP及BDNF两种基因的表达,镜下测定转染率,并检测RT-PCR产物,证实BDNF的存在。转染后的神经干细胞经G418筛选,抗性细胞传代扩增后获得成功转染BDNF基因的NSCs克隆。结果 荧光显微镜下可见感染后的NSCs表达EGFP而发出绿色荧光;通过RT-PCR证明感染后的NSCs具有表达BDNF的能力;用ELISA鉴定细胞上清中分泌的BDNF, 72h的含量达到最高值,为12.78ng/ml;证明通过构建病毒的感染可以使神经干细胞获得分泌BDNF的能力,且EGFP基因可作为神经干细胞移植研究中良好的示踪剂。结论 腺病毒病毒介导EGFP基因及BDNF基因在大鼠胚胎神经干细胞中成功表达,为应用以神经干细胞直接作为基因靶细胞,介导基因治疗中枢神经系统疾病莫定了基础。     

腺病毒介导转录因子X盒结合蛋白1转染海马神经干细胞：影响神经干细胞增殖及在缺氧环境下的凋亡

背景:随着胚胎和成体神经干细胞的成功分离、培养、及体外定向诱导分化等技术的成熟,移植神经干细胞用于治疗各种缺血性脑血管病、帕金森病、脊髓损伤、阿尔茨海默病成为可能。但移植后干细胞的存活与缺血缺氧区细胞凋亡密切相关。xbp-1是在内质网应激的未折叠蛋白反应阶段表达的一种重要的效应转录因子,被证实对细胞生存、分化及抗凋亡有重要的作用。 目的:将基因XBP-1通过重组腺病毒转染胚鼠海马神经干细胞,并观察其是否可以促进干细胞增殖以及在缺氧环境下是否具有抗凋亡作用。 设计、时间及地点: 随机、对照设计,在吉林大学第一医院神经内科实验室,2008年9月到2009年11月完成。 材料:E16SD孕鼠（孕15天）由吉林大学动物实验中心提供,重组腺病毒包装xbp-1基因及增强绿色荧光蛋白（EGFP）由广州易超医学试剂科技公司代为完成。β-actine、grp78、xbp-1、bcl-2、bax、EDEM抗体购自santa cruz公司,二抗、BSA购自武汉意德公司,DMEM/F12高糖培养基、胎牛血清购自长春博德生物技术有限责任公司,凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司,CoCl2购自sigma公司,lipo2000其他试剂为国产分析纯化。 方法: 取El6 SD大鼠胚鼠的海马组织进行神经干细胞的分离、克隆、nestin免疫荧光检测,以及传代和扩增。将重组腺病毒Ad-XBP1-EGFP质粒转染胚鼠海马神经干细胞,得到基因修饰后的胚鼠海马神经干细胞,通过细胞计数和MTT比色法检测细胞增殖情况。再用CoCl2诱导胚鼠海马神经干细胞缺氧模型,收取蛋白,通过western blot检测内质网应激和凋亡相关蛋白的表达变化,流式细胞仪检测干细胞凋亡情况。 主要结果检测: MTT技术检测细胞增殖,western blot检测蛋白质表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡。 结果: XBP-1基因修饰后的胚鼠海马神经干细胞与对照组细胞相比,细胞增殖速度明显增加。在缺氧条件下内质网应激标志物如grp78表达增加,xbp-1靶基因EDEM表达水平上升,促凋亡分子bax水平下降,抗凋亡分子bcl-2水平上升。通过流式细胞术检测提示细胞凋亡减轻。 结论: 重组腺病毒可以成功将XBP-1基因导入胚鼠神经干细胞中,转染后的NSCs增殖速度加快。缺血缺氧下,XBP-1基因在NSCs中过表达,可以引起grp78和EDEM表达增加、bax水平下降、bcl-2水平上升,细胞凋亡率下降,抗凋亡作用较为明显,为干细胞移植治疗神经系统损伤提供了实验理论基础。     

人pre—mir181a腺病毒载体的构建与鉴定

目的探讨构建携带人pre—mir181a基因的重组腺病毒载体,为基因治疗研究提供一种新的方法,并观察其在神经胶质瘤细胞U251细胞中的表达。方法以从Genesil公司购买的含有mir181a的质粒为模板扩增pre—mir181a基因,将回收的PCR产物片段克隆入pGenesil载体,获得重组质粒pGenesil—pre—mir181a。从pGenesil—pre—mir181a上通过LR体外同源重组将mir181a microRNA表达框转移至pGSadeno腺病毒表达载体上。在体外用不同感染复数（M·O·I）值rAd5-mir181ab分别转染神经胶质瘤细胞U251细胞。采用流式细胞仪、RT—PCR方法检测目的基因的转染效率和表达。结果PCR、酶切鉴定以及序列测定与比对分析表明,重组腺病毒rAd5-mir181a构建正确。神经胶质瘤细胞U251细胞转染rAd5-mir181a的最高效率可达99％,转染后的神经胶质瘤细胞U251细胞表达相应的mir181a。结论本实验成功构建了含mir181a基因的重组腺病毒rAd5-mir181a载体,在体外能高效转染神经胶质瘤细胞U251细胞。     

神经干细胞分化过程中c-myc内含子结合蛋白1与c-myc基因表达研究

目的研究神经干细胞分化为胶质细胞过程中c-myc内含子结合蛋白1(MIBP1)基因与c-myc基因的表达变化。方法从孕16d胚胎鼠脑组织中分离神经干细胞,以专用培养基IMDM(含有B27添加剂,重组人上皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子-2、L-谷氨酸和黄体酮)进行培养。应用胶原及含10%胎牛血清、抗生素的分化培养基,诱导细胞向胶质细胞及神经元方向分化,第1天细胞贴壁启动分化,第7天明显分化,第14天进入终末分化。经过振荡处理,进一步得到纯化星形胶质细胞,采用胶质纤维酸性蛋白免疫组化方法鉴定细胞分化。分别提取分化前及分化后第1、7和14天神经干细胞的RNA,应用逆转录-多聚酶链反应方法检测神经干细胞中MIBP1与c-myc基因的表达,以β-actin作为内参照物,应用图像分析仪对电泳条带进行定量分析,观察两基因在神经干细胞分化中的作用。结果在神经干细胞分化过程中,MIBP1基因表达逐渐增强,其中未分化神经干细胞为(63.53±11.97)%,培养第1、7和14天表达率分别为(70.04±16.10)%、(79.09±15.40)%和(99.65±0.54)%。而c-myc基因表达呈逐渐降低,未分化神经干细胞为(99.76±7.62)%;培养第1、7和14天表达率分别为(75.20±12.33)%、(45.65±10.11)%和(33.31±4.34)%。两基因分别与相应未分化组比较,差异具有极显著性意义(均P<0.001)。星形胶质细胞纯化前后MIBP1基因表达量无明显变化。结论在神经干细胞分化为胶质细胞的过程中MIBP1基因表达逐渐增强,同时c-myc基因表达受到抑制。提示MIBP1基因与胶质细胞的分化过程相关,可能通过抑制c-myc基因的表达而实现调控作用。     

Treatment of Parkinson disease with C17.2 neural stem cells overexpressing NURR1 with a recombined republic-deficit adenovirus containing the NURR1 gene

To study the potential benefit of the NURR1 gene in Parkinson's disease (PD), we constructed a recombinant republic-deficit adenovirus containing the NURR1 gene (Ad-NURR1) and expressed it in transplanted neural stem cells (NSC). Ad-NURR1 was constructed, and NURR1 mRNA and protein expression were identified by in situ hybridization and western blot analysis, respectively. The identified NURR1 protein could directly or indirectly induce NSC differentiation into neurons. To identify a potential therapeutic use for the transfected NSCs, cells were transplanted into 6-hydroxydopamine lesioned rats. Histopathological and behavioral alterations were evaluated via immunohistochemistry and the ration test, respectively, in rats transplanted with NSCs with or without the Ad-NURR1 adenovirus. The Ad-NURR1 construct effectively expressed the NURR1 protein, which could directly or indirectly induce NSC differentiation into neurons. Both histopathological and behavioral alterations were seen in rats treated with NSCs with or without the Ad-NURR1 construct, although in the case of the latter, the benefits were more robust. These results suggest a potential therapeutic benefit for Ad-NURR1-expressing cells in the treatment of PD. The Ad-NURR1 modification induced NSC differentiation and therefore represents a potential therapy for PD.     

Knockdown of Stat3 in C17.2 neural stem cells facilitates the generation of neurons: a possibility of transplantation with a low level of oncogene

This study investigates the role of a low level of Stat3 in the C17.2 neural stem cells, which are popular stem cell candidates for transplantation research. The results reveal that C17.2 neural stem cells will undergo increased differentiation into neurons without generating glia after knockdown of Stat3 expression via an interfering RNA expression plasmid. As constitutively activated Stat3 is considered to be an oncogene, this study raises the possibility of stem cell transplantation with a low level of Stat3 to reduce the oncogenesis and facilitate the generation of neurons.     

Neurturin基因的克隆及其在C17.2神经干细胞中表达的研究

目的 探讨Neurturin(NTN)基因转染的C17．2神经干细胞移植后对帕金森病(PD)大鼠模型的保护作用，为其提供基因修饰的神经干细胞。方法 用RT—PCR方法获取Prepro-NTN cDNA，并克隆至pBlueskipt Ⅱ载体中，再将Prepro-NTN基因克隆至pcDNA3．1—hygro真核表达载体中，经量Lipofectamine 2000转染C17．2神经干细胞，挑选稳定表达的克隆，用RT—PCR及Western Blot印迹分析鉴定。结果 pcDNA3．1—hygro-NTN质粒转染C17.2神经干细胞后有5个稳定表达的克隆生长，克隆1有NTN蛋白的高表达。结论 获得了稳定表达NTN蛋白的C17．2神经干细胞克隆，为移植治疗PD打下了坚实的实验基础。     

Immortalized neural stem cells differ from nonimmortalized cortical neurospheres and cerebellar granule cell progenitors

Pluripotent neural stem cells (NSCs) have been used as replacement cells in a variety of neurological disease models. Among the many different NSCs that have been used to date, most robust results have been obtained with the immortalized neural stem cell line (C17.2) isolated from postnatal cerebellum. However, it is unclear if other NSCs isolated from different brain regions are similar in their potency as replacement therapies. To assess the properties of NSC-like C17.2 cells, we compared the properties of these cells with those reported for other NSC populations identified by a variety of different investigators using biological assays, microarray analysis, RT-PCR, and immunocytochemistry. We show that C17.2 cells differ significantly from other NSCs and cerebellar granule cell precursors, from which they were derived. In particular, they secrete additional growth factors and cytokines, express markers that distinguish them from other progenitor populations, and do not maintain karyotypic stability. Our results provide a caution on extrapolating results from C17.2 to other nonimmortalized stem cell populations and provide an explanation for some of the dramatic effects that are seen with C17.2 transplants but not with other cells. We suggest that, while C17.2 cells can illustrate many fundamental aspects of neural biology and are useful in their own right, their unique properties cannot be generalized.     

Trophism of neural progenitor cells to embryonic stem cells: neural induction and transplantation in a mouse ischemic stroke model

Embryonic stem cell (ESC)-derived products have emerged as a promising cell source for neuroregeneration. C17.2 neural precursor cells were noted to express genes of neurotrophins and neuroprotective factors and to be enable to enhance proliferation, neuritogenesis, and differentiation of SH-SY5Y and SK-N-AS neuroblasts, suggesting their neurotrophic potential. We used C17.2 cells as neurotrophic chaperones to induce ESCs, D3, and E14TG2a into neural lineage cells. Significantly greater numbers of Sox-2(+), Musashi-1(+), and nestin(+) neurospheres developed in noncontact cocultures than in cultures of ESCs without C17.2 support or with 50% conditioned medium after 8 days. Immunoreactivity of the neuronal, astrocytic and oligodendrocytic markers was evident in cultures further differentiated for 10 days. Expression of Pax-6, Otx-1, and Nurr-1 genes suggested neuroectodermal precursors in products encompassing neural stem cells, dopaminergic neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Alpha-fetoprotein, GATA-4, Brachyury, Nkx-2.5, and Myf-5 genes were not detected, indicating any mesodermal and endodermal cells. However, weak expression of Oct-4 was noted. Behavioral assessment of ischemic mice 2 weeks after transplantation revealed significant improvement in cognitive function compared with that in ischemic sham-operated mice. Tracking bromodeoxyuridine-labeled products demonstrated that mostly implanted cells were localized along the needle track of the injection in the brain parenchyma, whereas some migrated to the striatum, cortex, nerve fiber bundle of the corpus callosum, and hippocampus in the ipsilateral hemisphere. One episode (of 22) of teratoma development was noted. Data from this study suggest a paradigm of trophism of neural progenitor cells for induction of ESCs into neural lineage cells.     

外源性bFGF抑制辐射诱导的C17.2神经干细胞凋亡的实验研究

目的 观察外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对辐射诱导的C17.2神经干细胞(NSCs)凋亡的影响,探讨细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)在bFGF对辐射诱导的C17.2 NSCs凋亡的抑制效应中的作用. 方法 以直线加速器照射C17.2NSCs建立离体放射性损伤模型.MTT法检测细胞活性,流式细胞仪检测不同浓度的外源性bFGF和U0126对细胞凋亡的影响. 结果 外源性bFGF浓度为0～100ng/mL时,细胞凋亡率可由(12.78±1.04)%降低至(4.83±0.31)%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05);加入U0126后细胞凋亡率为(8.42±0.71)%.DMSO对照组为(4.71±0.42)%,差异有统计学意义(P<0.05). 结论 外源性bFGF对辐射引起的C17.2 NSCs凋亡具有抑制作用,ERK1/2参与该效应.     

小胶质细胞对体外培养神经干细胞向胆碱能神经元分化的影响

背景：神经干细胞的定向分化与小胶质细胞的浓度有关，浓度倍数过小可能达不到应有效应，太大则会产生细胞毒性。 目的：观察不同比例的小胶质细胞对体外培养的神经干细胞向胆碱能神经元方向分化的影响。 方法：取新生24，48 h内Wistar大鼠用于神经干细胞与小胶质细胞的原代培养，免疫组化进行鉴定。神经干细胞与小胶质细胞共同接种于6孔板，接种密度分别为10∶1，4∶1，1∶1，1∶4，1∶10，每种密度设6孔，以单纯神经干细胞作为对照，共培养3，7，14 d，观察细胞的生长情况。 结果与结论：原代培养的神经干细胞聚集成球状，悬浮生长，Nestin染色阳性，胞核不着色。小胶质细胞贴壁生长，折光性强，大部分细胞有短的突起呈分支状，小胶质细胞特异性标记抗体CD11b/c染色结果显示细胞纯度在80%以上。与单纯神经干细胞对照组相比，神经干细胞与小胶质细胞以10∶1，4∶1，1∶1，1∶4，1∶10接种密度共培养组ChAT阳性细胞数均明显升高。共培养组神经干细胞与小胶质细胞比例为4∶1时升高幅度显著高于其他接种密度 (P < 0.05)，且在培养第7天时生长达到高峰。结果提示小胶质细胞可以促进神经干细胞向胆碱能神经元方向分化，神经干细胞与小胶质细胞4∶1比例共培养第7天时效果最佳。     

Constitutive EGFR signaling confers a motile phenotype to neural stem cells

The epidermal growth factor receptor (EGFR) has been shown to play an important role in brain development, including stem and precursor cell survival, proliferation, differentiation, and migration. To further examine the temporal and spatial requirements of erbB signals in uncommitted neural stem cells (NSCs), we expressed the ligand-independent EGF receptor, EGFRvIII, in C17.2 NSCs. These NSCs are known to migrate and to evince a tropic response to neurodegenerative environments in vivo but for which an underlying mechanism remains unclear. We show that enhanced erbB signaling via constitutive kinase activity of EGFRvIII in NSCs sustains an immature phenotype and enhances NSC migration.