细胞分裂调控基因MAD2与GFP融合的真核表达质粒的构建及表达

目的：构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中表达.方法：通过RT-PCR扩增,获得MAD2基因的完整序列.将此片断插入pEGFP-N1载体多克隆位点区,构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒.应用脂质体转染技术转染HepG2细胞并观察表达的绿色荧光.结果：成功构建MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达.结论：该载体的成功构建,为研究MAD2基因在细胞分裂中的功能及定位建立了有效的观察体系.     

HCV 5′非编码区和核心区重组真核表达质粒的构建及其细胞内定位

目的 :构建丙型肝炎病毒 (HCV)重组真核表达载体 ,为HCV感染基因免疫和基因治疗的研究奠定基础。方法 :构建含HCV 5′非编码区 (NCR)及编码核心蛋白C区基因片段的重组真核表达质粒pBBS2 12 HCV ,通过脂质体介导转染入人肝癌细胞株HepG2中 ,应用RT PCR及免疫组织化学方法鉴定HCV核心蛋白的表达及其在细胞内的定位。结果 :重组真核表达质粒在HepG2细胞中有稳定表达 ,HCV核心蛋白以胞浆内表达为主。结论 :成功构建了含HCV 5′NCR和核心C区基因片段的真核表达载体 ,明确核心抗原的细胞内定位主要在细胞胞浆内。     

HCV 5′非编码区和核心区重组真核表达质粒的构建及其细胞内定位

目的 :构建丙型肝炎病毒 (HCV)重组真核表达载体 ,为HCV感染基因免疫和基因治疗的研究奠定基础。方法 :构建含HCV 5′非编码区 (NCR)及编码核心蛋白C区基因片段的重组真核表达质粒pBBS2 12 HCV ,通过脂质体介导转染入人肝癌细胞株HepG2中 ,应用RT PCR及免疫组织化学方法鉴定HCV核心蛋白的表达及其在细胞内的定位。结果 :重组真核表达质粒在HepG2细胞中有稳定表达 ,HCV核心蛋白以胞浆内表达为主。结论 :成功构建了含HCV 5′NCR和核心C区基因片段的真核表达载体 ,明确核心抗原的细胞内定位主要在细胞胞浆内。     

GFP/HBV X融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

人类pEGFP/H2B真核表达质粒的构建及表达

目的:构建人H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HEK293细胞中表达.方法:通过RT-PCR从HEK293细胞总RNA中扩增获得H2B基因的部分cDNA序列,与载体pEGFP-C1连接构建H2B基因与GFP融合表达的真核表达质粒pEGFP/H2B,经酶切和测序鉴定;应用脂质体转染技术将重组质粒转染HEK293细胞观察融合蛋白的表达.结果:成功构建H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达载体,与对照组中转染空载体pEGFP-C1的HEK293细胞中的弥漫荧光相比,转染重组质粒的细胞中可观察到绿色荧光蛋白集中表达在细胞核内,分裂期细胞中可见与染色体形态一致的绿色荧光.结论:该载体的成功构建为研究染色体的分离机制建立了有效的观察体系.     

绿色荧光蛋白表达质粒的构建及鉴定

目的构建能表达绿色荧光蛋白的载体———pCDNA3.1-GFP。方法使用基因重组方法从质粒pGreenlantern中获取绿色荧光蛋白基因片段,克隆入PCDNA3.1的多克隆区,构建成PCDNA3.1-GFP,通过限制性核酸内切酶NotI与BamHI对所建质粒进行分析后,转染HepG2细胞并观察绿色荧光蛋白表达。结果经限制性内切酶及转染HepG2细胞表达鉴定,证实成功构建了PCDNA3.1-GFP。结论成功构建成携有绿色荧光蛋白报告基因哺乳动物表达载体,该质粒可用于融合表达目的蛋白,并将目的蛋白表达定位。     

绿色荧光蛋白和HCV5′NCR调控荧光素酶双顺反子真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的：探讨绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP)和HCV5′NCR(noncoding region)调控荧光素酶双顺反子真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达。方法：用基因重组技术，将真核表达载体pCMVNCRLuc的HCV5′NCR及其调控的荧光素酶基因亚克隆至报告载体pEGFP-C1的GFP基因下游，构建含GFP和HCV5′NCR调控荧光素酶双顺反子的真核表达载体pGFPNCRLuc。用脂质体基因转染技术，将pcGFPNCRLuc转染至肝细胞株QSG7701。结果：GFP和荧光素酶基因均得到高效表达，其荧光素酶表达强度与pCMVNCRLuc比较，差异无显著性（P＞0.05)，GFP表达水平与pEGFP-C1比较，差异无显著性（P＞0.05)。结论：成功构建HCV和HCV5′NCR调控荧光素酶双顺反子真核表达载体，HCV和荧光素酶基因在肝细胞内得到共表达。该结果为特异性抗HCV药物评价系统的建立创造了条件。     

带GFP的启动子鉴定质粒的构建及在HCV启动子鉴定中的应用

目的:利用已有质粒构建带GFP报告基因的启动子鉴定质粒,并用此质粒鉴定丙型肝炎病毒5非翻译区(HCV5'-UTR)启动基因表达的活性.方法:用限制性内切酶将质粒pEGFP-N1上的EGFP基因片断切下,与用相同酶切去除荧光素酶基因片断的PGL3 enhancer质粒大片断连接,得到带GFP的启动子鉴定质粒pEGFP enhancer.HCV 5'-UTR片断用PCR方法获得,插入pEGFP enhancer的多克隆区,构建HCV 5'-UTR驱动GFP表达质粒.应用脂质体转染技术转染HepG2细胞并观察荧光.结果:成功构建带GFP报告基因的启动子鉴定质粒,并在此基础上构建了HCV 5'-UTR启动GFP表达的质粒.前者转染HepG2细胞后,几乎无GFP表达,而后者观察到较强的绿色荧光.结论:该实验构建的带GFP报告基因的启动子鉴定质粒本底表达低,可用于真核启动子的鉴定.HCV 5'-UTR可以启动报告基因的表达,具有启动子活性.     

GDF5基因真核表达载体的构建及其在恒河猴骨髓间充质干细胞中的表达

目的克隆人软骨组织生长分化因子5（GDF5）基因及构建GDF5基因真核表达载体，观察其在恒河猴骨髓间充质干细胞（MSCs）中的表达情况。方法采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从人胎儿软骨组织克隆hGDF5基因全长cDNA，插入pEGFP-C2载体，构建重组真核表达质粒pEGFP-C2-GDF5。重组质粒脂质体介导法转染MSCs细胞，荧光显微镜观察报告基因的表达，RT-PCR法检测目的基因表达。结果成功克隆人软骨组织GDF5基因和构建GDF5真核表达质粒pEGFP-C2-GDF5，克隆在载体上的基因长度为1505bp，包含全部cDNA编码序列1505bp，测序显示与Genbank上的序列一致。重组质粒转染恒河猴MSCs细胞得到表达，绿色荧光蛋白在转染24h后开始表达，72h达高峰，然后表达逐渐减弱。转染后72h可检测到GDF5mRNA表达。结论人GDF5基因在恒河猴MSCs细胞的成功表达为应用恒河猴模型开展基于细胞的基因疗法修复骨和软骨损伤研究奠定了必要基础。     

凋亡抑制蛋白Livin shRNA真核表达载体的构建

目的设计构建Livin的shRNA真核表达载体，并转染宫颈癌HeLa细胞，进一步研究该表达载体对目的基因Livin的沉默效果，为宫颈癌基因治疗探索新方法。方法以Livin为靶基因，以Pgenesil-1质粒为载体，构建重组体，根据Livin基因cDNA序列，设计shRNA寡核苷酸序列，退火后克隆到空载体Pgenesil-1中，转化DH5α菌株，提取质粒，进行酶切鉴定和测序分析。将构建好的真核表达载体转染宫颈癌HeLa细胞。结果经酶切鉴定出的重组体测序结果与目的序列相同，重组载体构建成功，并被成功转入宫颈癌HeLa细胞，可见绿色荧光蛋白表达，48 h转染效率最高。结论利用RNA干扰技术可成功构建小干扰RNA重组体，为进一步研究宫颈癌基因治疗奠定基础。     

绿色荧光蛋白和HCV5′NCR调控荧光素酶双顺反子真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的 :探讨绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein ,GFP)和HCV 5′NCR(noncodingregion)调控荧光素酶双顺反子真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达。方法 :用基因重组技术 ,将真核表达载体pCMVNCRLuc的HCV5′NCR及其调控的荧光素酶基因亚克隆至报告载体pEGFP C1的GFP基因下游 ,构建含GFP和HCV 5′NCR调控荧光素酶双顺反子的真核表达载体pGFPNCRLuc。用脂质体基因转染技术 ,将pGFPNCRLuc转染至肝细胞株QSG770 1。结果 :GFP和荧光素酶基因均得到高效表达 ,其荧光素酶表达强度与pCMVNCRLuc比较 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,GFP表达水平与pEGFP C1比较 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论 :成功构建HCV和HCV 5′NCR调控荧光素酶双顺反子真核表达载体 ,HCV和荧光素酶基因在肝细胞内得到共表达。该结果为特异性抗HCV药物评价系统的建立创造了条件     

CCL11和 CCL26基因3′UTR 真核表达载体的构建和意义

目的：构建CCL11、CCL26基因3′非翻译区（3′UTR）真核表达载体。方法多聚酶链式反应（ PCR）扩增获得CCL11、CCL26基因3′UTR目的片段,双酶切目的基因片段及pMIR REPORT真核表达质粒后,将目的基因片段插入pMIR REPORT质粒,再将重组质粒转化感受态DH5α菌株,筛选阳性克隆行双酶切鉴定及测序分析。结果成功构建CCL11、CCL26基因3′UTR真核表达载体。结论 CCL11、CCL26基因3′UTR真核表达载体成功建立,为进一步研究CCL11、CCL26基因与MicroRNAs的关系提供实验基础。     

bFGF荧光真核表达载体构建及表达

目的 构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的荧光真核表达载体，以便进一步转染成骨细胞，研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法 应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到荧光真核表达载体pEGFP-C3，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况。结果 ①酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入片段的正确性。②荧光显微镜下观察GFP的表达情况，观察到部分经转染的细胞发出绿色荧光；免疫组化检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结论 成功地构建了bFGF荧光真核表达载体pEGFP-C3-bFGF，并在3T3细胞中表达了bFGF。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活SV40病毒早期启动子的研究

目的：探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A的反式激活作用。方法：扩增HCV NS5A基因，构建HCV NS5A基因真核表达载体pcDNA3．1(-)—NS5A；并转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，免疫印迹方法检测转染细胞中HCV NS5A蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3--promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果：质粒pcDNA3．1(-)—NS5A在HepG2细胞瞬时表达HCV NS5A蛋白，共转染实验中pcDNA3．1(-)—NS5A组的CAT表达活性是空质粒对照组的3．8倍。结论：构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS5A蛋白反式激活的靶基因，深入阐明HCV NS5A蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供依据。     

HBV前C/C基因与绿色荧光蛋白基因融合表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的 :构建含HBV前C C基因与绿色荧光蛋白基因的融合表达载体 ,并在真核细胞中表达。方法 :用PCR法扩增含 1.3倍HBVayw型全基因组真核表达载体pHBV1.3的前C C基因片断 ,应用含绿色荧光蛋白基因的真核表达质粒构建融合表达载体 ,采用脂质体介导方法将其转染到HEK2 93细胞 ,并用荧光显微镜及ELISA法检测融合蛋白的表达。结果 :经PCR及酶切鉴定 ,证实成功构建了含HBV前C C基因的真核表达重组体pEGFP -HB VC ,显微镜下观察及ELISA法证实在HEK2 93细胞中表达了相应融合蛋白。结论 :构建的重组表达载体能在真核细胞中表达目的蛋白与GFP的双功能融合蛋白 ,适合于针对HBV前C C区的相关研究。     

乙肝病毒HBx基因荧光真核表达质粒的构建与鉴定

目的：克隆乙肝病毒HBx基因及构建增强型绿色荧光蛋白-HBx基因（pEGFP—N1-HBx）荧光真核表达质粒并进行表达鉴定。方法：以CH—HEP-1肝癌细胞株基因组DNA为模板PCR法扩增HBx基因,PCR产物测序分析正确后克隆至真核表达载体pEGFP—N1,命名为pEGFP—N1-HBx。将该质粒转染肝细胞株HepG2以RT-PCR及荧光显微镜检测其表达情况。结果：酶切鉴定和序列分析证实构建质粒含HBx基因,RT-PCR检测和荧光显微镜观察表明构建的pEGFP—N1-HBx在肝癌细胞株HepG2真核细胞中表达,且其绿色荧光蛋白瞬时表达率为20％～30％。结论：HBx基因克隆及其真核表达载体pEGFP—N1-HBx构建成功,可用于肝癌发生发展的生物学研究。     

HDGF真核表达质粒的构建?表达及其生物活性检测

目的:构建pEGFP-HDGF真核表达质粒,转入胶质瘤U87细胞中,对其表达及生物学活性进行检测。方法:PCR扩增HDGF编码区序列,构建pEGFP-HDGF真核表达质粒,脂质体转染U87细胞,G418筛选稳定表达单克隆,荧光显微镜观察绿色荧光,RT-PCR及Westernblot检测融合蛋白在转染细胞中的整合及表达。通过U87细胞增殖实验对HDGF-GFP融合蛋白进行初步功能鉴定。结果:pEGFP-HDGF表达质粒转染U87细胞后,荧光显微镜下可见绿色荧光,RT-PCR、Westernblot结果证实在U87细胞中有HDGF-GFP融合蛋白的表达。细胞增殖实验的结果显示,稳定表达pEGFP-HDGF的U87细胞生长速率明显高于对照空载组细胞(P=0.006)。结论:pEGFP-HDGF真核表达质粒构建成功,且HDGF对于胶质瘤U87细胞株有着生长刺激作用,这将有助于胶质瘤发生发展的分子机制研究。     

肝癌靶向性AGAP表达载体构建及生物信息学分析

目的：构建肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）特异性镇痛抗肿瘤肽（analgesic-antitumor peptide,AGAP）基因真核表达载体,利用计算机辅助分析和预测所表达蛋白质的理化和结构特征,为探索生物毒素靶向抗肝癌作用奠定基础。方法：提取东亚钳蝎总RNA,用RT-PCR法扩增出AGAP基因,与载体pGL3/AFP连接构建重组质粒,酶切及测序鉴定,并利用蛋白质分析软件对其表达的蛋白二级结构水平及一些生物学特性进行预测,并转染HepG2细胞检测其是否表达。结果：重组质粒所表达的目的多肽经软件分析,发现在二级结构上没有变化,亲水性、抗原性等生物学活性也未受影响,转染HepG2细胞后能成功表达。结论：人AFP基因顺式作用元件调控AGAP真核表达载体构建成功。     

多药耐药肝癌细胞模型的建立

目的:构建人多药耐药基因(MDR1)的肝脏特异性真核表达栽体,转染HepG2细胞,建立多药耐药肝癌模型.方法:将小鼠清蛋白启动子序列(pALB)克隆到已成功构建的MDR1基因真核表达载体pcDNA-MDR1中,替换其中的CMV启动子序列,构建MDR1肝脏特异性真核表达载体pcDNA-ALBMDR1,利用KeyGenTransⅢ阳离子转染试剂转染HepG2细胞,用G418筛选稳定表达MDR1基因的细胞,并用RT-PCR方法检测MDR1基因的表达,通过测定细胞对阿霉素的耐受性以及阿霉素与多药耐药逆转剂维拉帕米联合用药情况确定MDR1基因在肝脏细胞中的功能.结果:酶切鉴定和测序结果证明构建的重组表达载体pcDNA-ALBMDR1序列正确.RT-PCR分析以及荧光显微镜观察结果表明:该表达载体已在HepG2细胞中有效转录并稳定表达.MTT药敏实验结果显示:转染pcDNA-ALBMDR1质粒的HepG2细胞对阿霉素的耐药性有显著提高,同时维拉帕米能够显著提高转染细胞对阿霉素的敏感性.结论:成功构建了稳定表达MDR1并具有多药耐药特性的肝癌细胞模型,该模型的建立将有助于多药耐药逆转剂的筛选与研究.