抗竹叶青蛇毒抗体F(ab'')2的制备

目的制备特异性强、高纯度的抗竹叶青蛇毒抗体F(ab')2.方法以竹叶青蛇毒为免疫原免疫马,试血效价达到要求后,从免疫马血浆中先提取IgG,然后酶解、过疏水柱后得到F(ab')2片段,以免疫扩散实验检测抗体F(ab')2片段的特异性,以小鼠中和试验测定其中和竹叶青蛇毒的能力.结果纯化得到的F(ab')2活性片段纯度可达90%;F(ab')2冻干品与竹叶青蛇毒在8∶1时出现免疫沉淀线,在20∶1时可保护小鼠100%存活.结论纯化得到的抗体F(ab')2活性片段对竹叶青蛇毒具有较好的中和能力.     

人血小板功能抗体及其片段的识别

目的研究特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者血小板膜糖蛋白（GP）特异性IgG抗体及其片段的免疫活性及对血小板聚集功能的影响.方法用改良单克隆抗体特异性俘获血小板抗原技术（MAIPA）检测84例慢性ITP患者血浆中抗GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ及GPⅥ自身抗体,比浊法血小板聚集试验筛选出自身抗体阳性并能抑制血小板聚集的患者,用蛋白A柱纯化其血浆IgG抗体并用胃蛋白酶制备F（ab＇）2片段.检测纯化的IgG抗体及其酶切片段与血小板GP的结合活性及对正常人血小板聚集功能的影响.结果 （1）84例ITP患者血浆中,48例（57.1%）抗GPⅡb/Ⅲa和/或GPⅠb/Ⅸ和/或GPⅥ自身抗体阳性,其中7例（14.6%）明显抑制了二磷酸腺苷、瑞斯托霉素或胶原诱导的血小板聚集;（2）纯化的IgG及F（ab＇）2片段具有与相应血小板GP的结合活性;（3）4例患者纯化IgG及F（ab＇）2片段具有抑制血小板聚集的功能.结论 F（ab＇）2片段是IgG自身抗体的功能片段,它不但保留了良好的抗原结合活性且可部分抑制血小板聚集功能,为人源化血小板糖蛋白特异性抗体的制备奠定了基础.     

鼠源性单克隆抗体F(ab′)2片段制备工艺

目的制备符合临床应用质量标准的鼠源性mAb F(ab′)2片段.方法采用胃蛋白酶消化小鼠腹水抗体,疏水作用色谱法纯化F(ab′)2片段的新工艺,替代原有的木瓜蛋白酶消化IgG,阴离子交换色谱法纯化的旧工艺.结果新工艺所制备的F(ab′)2 片段经SDS-PAGE检测纯度达98%以上,ABC免疫组化法测定免疫活性为1∶8000,回收率大于 50%,核酸含量及热原均合格,整个工艺流程可在48 h内完成.结论新工艺制备人用鼠源性mAb F(ab′)2片段更简便高效、安全实用,能够适应中试放大及大规模生产的要求.     

肝癌单克隆抗体F(ab′)_2段与葡萄球菌肠毒素A结合物的制备及其活性

目的：制备超抗原（SAg）葡萄球菌肠毒素A（SEA）与抗人肝细胞癌单克隆抗体（McAb）HAb18F（ab′）2段的结合物，并对其活性进行鉴定．方法：提取MCAbHAb18并用木瓜蛋白酶切取其F（ab′）2段，用SPDP制备HAb18F（ab′）2－SEA结合物，凝胶色谱柱纯化后用SDS－PAGE鉴定各收集峰，免疫组化ABC法鉴定结合物中的HAb18F（ab′）2的抗体活性，MMT法鉴定结合物中的SEA活化T细胞的活性．结果：成功地制备了HAb18F（ab′）2－SEA结合物，并且制备的结合物具有肝癌抗体活性和活化外周血单个核细胞的功能．结论：SPDP是一种很好的蛋白质交联剂，本实验制备的HAb18F（ab′）2－SEA结合物可用于McAb与SAg结合物导向治疗肝癌的实验研究．     

抗抗总黄曲霉毒素单抗F(ab’)2多克隆抗体的制备及特性

目的:以抗总黄曲霉毒素单抗2G2株F(ab’)2片段作为免疫原制备抗抗总黄曲霉毒素单抗独特型多克隆抗体。方法:制备抗总黄曲霉毒素单抗2G2株F(ab’)2片段,分别用F(ab’)2片段和F(ab’)2-KLH免疫日本大耳白兔,制备抗抗总黄曲霉毒素单抗独特型多克隆抗体。采用ELISA检测该抗体替代黄曲霉毒素B1(AFB1)的情况,并分析与其他单克隆抗体的交叉反应情况。用该多克隆抗体免疫BALB/C小鼠,采用间接非竞争ELISA检测小鼠血清,鉴定该抗体的亚型。结果:由2G2株F(ab’)2片段所得的抗抗总黄曲霉毒素单抗独特型多克隆抗体纯化后,替代游离AFB1达到20%、50%和80%竞争抑制时的质量浓度分别为1、4和25mg/L,分别相当于0.47、2.74和16.00μg/L游离AFB1;该抗体替代AFB1包被抗原达到20%、50%和80%竞争抑制时的质量浓度分别为1、4和19mg/L,分别相当于0.33、1.35和5.45μg/L游离AFB1。小鼠生物鉴定显示该多克隆抗体为Ab2β型。结论:成功制备了抗抗总黄曲霉毒素单抗独特型多克隆抗体,为研制AFB1无毒检测试剂盒提供了依据。     

抗CD3分子的抗体诱导BalB／c小鼠胸腺细胞凋亡的机制浅探

目的 我们与其他课题组曾经报道，抗CD3抗体在体内诱导小鼠胸腺中未成熟T细胞凋亡，而此种诱导凋亡的效应能被糖皮质激素受体拮抗剂RU486部分阻断。依此现象进而观察CD3抗体的F（ab′）2和Fc片段在引起凋亡过程中的不同作用，揭示其可能机制。方法 胃蛋白酶消化经过纯化、浓缩和鉴定得到高纯度的抗CD3抗体F(ab′)2片段。利用TUNEL原位凋亡检测4h胸腺细胞早期凋亡；利用胸腺称重、胸腺细胞计数、抗CD4／CD8荧光双染流式细胞仪检测观察20h胸腺细胞晚期凋亡。结果 抗CD3抗体F(ab′)2片段单独不能引起小鼠胸腺细胞凋亡，而F(ab′)2辅以抗F(ab′)2二抗则可以显著的引起未成熟BALB/c小鼠胸腺细胞凋亡，且凋亡作用可以被糖皮质激素受体阻滞剂RU486部分抑制。结论 抗CD3抗体桥梁联接了小鼠胸腺细胞与胸腺上皮细胞，引发胸腺上皮细胞释放的糖皮质激素诱导邻近的胸腺细胞凋亡。     

^99mTc标记单克隆抗体及片段对荷人结肠癌裸鼠的放射免疫显像研究

目的 探讨单克隆抗体ND1对大肠癌的诊断价值。方法 利用放射免疫法对荷人结肠癌裸鼠模型进行显像研究。结果 ^99mTc直接标记抗人结肠癌单克隆抗体ND1及F（ab)2片段,标记率为94%和87%,标记后抗体的免疫活性良好。注入荷人结肠癌裸鼠体内16小时后。肿瘤组织中出现较高的特异性浓聚,肿瘤轮廓显示清晰,F（ab)2片段的放射本底消除快,图像质量优于ND1。体内分布显示：ND1及F（ab)2片段可与移植瘤特异性结合。肿瘤与正常器官组织的放射比值（T/NT）、F（ab)2片段显高于ND1,ND1在肿瘤,血液及器官组织均有较高的放射性摄取,不利于放射性本底的消除。结论 ^99mTc-F(ab)2,对大肠癌的放射免疫显像图像清晰,优于^99mTc-ND1,为其临床应用提供了实验依据。     

抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其F(ab′)_2与Fab′片段的抗肿瘤作用

目的研究抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其F(ab′)2、Fab′片段对小鼠肝癌22(H22)及小鼠Lewis癌肺转移的治疗作用。方法ELISA实验检测3G11及其片段与多种肿瘤细胞及Ⅳ型胶原酶的免疫反应性,明胶酶谱法测定其对HT-1080细胞分泌Ⅳ型胶原酶活性的影响,MTT法测定其对H22细胞的细胞毒作用。用小鼠肝癌22及小鼠Lewis肺癌模型评价单抗3G11及其片段抑制肿瘤生长及抗肿瘤转移活性。结果单抗3G11及其片段对多种肿瘤细胞及Ⅳ型胶原酶均呈阳性反应,单抗3G11抑制肿瘤细胞HT-1080分泌Ⅳ型胶原酶的活性。单抗3G11对H22细胞有微弱的细胞毒作用。单抗3G1130mg/kg对小鼠移植性肝癌的抑制率为51·8%,F(ab′)210mg/kg为49·9%,Fab′20mg/kg为39·3%。F(ab′)2片段10mg/kg对小鼠Lewis癌肺转移的抑制率为76%。结论抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其片段对小鼠移植性肝癌22生长以及对小鼠Lewis癌肺转移有中度抑制作用,可能用于研制抗体靶向药物。     

抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其F(ab')2与Fab'片段的抗肿瘤作用

目的 研究抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其F（ab’）2、Fab’片段对小鼠肝癌22（H22）及小鼠lewis癌肺转移的治疗作用。方法 ELISA实验检测3G11及其片段与多种肿瘤细胞及Ⅳ型胶原酶的免疫反应性,明胶酶谱法测定其对HT-1080细胞分泌Ⅳ型胶原酶活性的影响,MTT法测定其对H22细胞的细胞毒作用。用小鼠肝癌22及小鼠Lewis肺癌模型评价单抗3G11及其片段抑制肿瘤生长及抗肿瘤转移活性。结果 单抗3G11及其片段对多种肿瘤细胞及Ⅳ型胶原酶均呈阳性反应,单抗3G11抑制肿瘤细胞HT-1080分泌Ⅳ型胶原酶的活性。单抗3G11对H22细胞有微弱的细胞毒作用。单抗3G1130mg／kg对小鼠移植性肝癌的抑制率为51．8％,F（ab＇）210mg/kg为49．9％,Fab’20mg／kg为39．3％。F（ab’）2片段10mg／kg对小鼠lewis癌肺转移的抑制率为76％。结论 抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11及其片段对小鼠移植性肝癌22生长以及对小鼠lewis癌肺转移有中度抑制作用,可能用于研制抗体靶向药物。     

单克隆抗体TNT-1的纯化、F(ab)_2片段化及其免疫活性的测定

TNT-1是-种鼠IgG_2a单抗,已用于肿瘤病人的临床试验。本文将介绍从腹水中进一步纯化TNT-1的方法及制备其F(ah′)_2片段的条件。经Protein A亲和柱层析从小鼠腹水中提取出的lgG,再通过阳离子交换树脂柱Mono S,用缓冲液A(20 mmol/L MES,pH6.3)和缓冲液B(lmol/L NaCI),在快速蛋白液相色层(FPLC)系统上进行梯度洗脱分离,可制得纯净的TNT-1抗体,其免疫活性可达80％～85％;经纯化的TNT-1,用胃蛋白酶消化,制备F(ah′)~2片段,其消化条件是:酶的用量为抗体的1/250,pH3.8,温度37℃,时间4～5 /小时。消化后的混合物,用protein A亲和结合法除去完整的IgG,其余的F(ab′)_2和Fab、Fc等片段,在Mono S柱上,按前述的条件分离。产物TNT-1或F(ah′)_2的免疫活性,用标记抗体和过量抗原结合的方法测定;分高纯化过程中的洗脱峰,用间接免疫荧光技术监测其活性。结果戾明,TNR-1的F(ab′)_2片段的制备是成功的,色层分离纯化的方法简便而有效,并已成功地应用于批量生产。     

C57BL/6小鼠系膜增生型肾小球肾炎的复制

目的：探索一种复制小鼠系膜增生型。肾小球。肾炎动物模型的方法。方法：80只C57BL／6小鼠随机分为4组（每组20只）：A-正常对照组；B-竹叶青蛇毒2mg／kg注射组；C-竹叶青蛇毒4mg／kg注射组；D-竹叶青蛇毒6mg／ks注射组。按照分组要求计算B、C、D3组小鼠中每只小鼠需注射的竹叶青蛇毒的总量，配制3种不同浓度的竹叶青蛇毒液，B、C、D3组小鼠分别尾静脉注射不同浓度的竹叶青蛇毒液0．2mL，A组小鼠尾静脉注射生理盐水0．2mL以进行对照。结果：竹叶青蛇毒注射后的小鼠均出现中毒性症状。C、D组小鼠因蛇毒注射剂量较大，死亡率高达50％，且集中于前3d内死亡，3d后中毒小鼠的活动基本如常。B组与正常对照组小鼠无死亡。中毒小鼠的肾功能与正常对照组相较无明显差别，但均出现了肾小球系膜细胞增生，系膜基质增多，肾小球及间质内炎性细胞浸润等病理学改变。结论：竹叶青蛇毒尾静脉注射是一种复制小鼠系膜增生型肾小球肾炎动物模型的较好的方法。     

~(99m)Tc-C_(50)-F(ab′)_2放射免疫显像早期诊断卵巢癌的实验研究

【目的】探讨单克隆抗体 (McAB)的F(ab′) 2 片段在卵巢癌放射免疫显像诊断中的应用价值。【方法】利用胃蛋白酶消化抗癌胚抗原单克隆抗体 (C50 ) ,酶切产物经SDS PAGE电泳鉴定后 ,经SephadexG 10 0凝胶柱纯化 ,获得F(ab′) 2 片段。分别将99mTc标记的C50 ,F(ab′) 2 及正常鼠IgG行荷人卵巢癌裸鼠移植瘤放免显像 ,并比较其结果。【结果】①片段F(ab′) 2 的产率为 33%± 3 2 % ,其最大理论产率的 49%。酶联免疫吸附方法和免疫细胞化学染色均证实其保留较好的免疫活性。② 2 4h放射免疫显像可见片段组移植瘤部位有较高浓度的放射性物质聚集 ,肿瘤与非肿瘤组织放射性活度之比 (T/NT)片段组最高。【结论】利用单克隆抗体片段进行放免显像 ,效果优于全抗体。     

抗HCG抗体IgG-F(ab’)_2对HCG所致小鼠子宫效应的中和作用

以小鼠子宫增重法及子宫的组织学检查对抗HCG抗体IgG—F(ab’)_2对HCG的中和作用进行了研究。当用低稀释度F(ab’)_2片段进行中和时,子宫未出现有意义的子宫增重及内膜增生,当用较高稀释度F(ab’)_2片段进行中和时,子宫内膜呈高度水肿、充血及炎细胞浸润,腺体也未见明显增生。本文结果指出,抗HCG抗体与HCG发生中和作用时,抗体的Fc段是不需要的。     

抗F(ab)_2荧光抗体与外周血淋巴细胞的结合率

本文报导用荧光标记抗人F(ab＇)_2抗体测定正常人外周血B淋巴细胞的百分数。该试验将人Ig用胃蛋白酶处理,使其断裂为F(ab＇)_2和Fc两段,通过层析柱,获得F(ab＇)_2组分免疫家兔,将兔抗人抗体,通过离子交换层析,得到纯化的抗人F(ab＇)_2抗体,将该抗体用异硫氰酸荧光黄(FITC)标记为     

融合表达β趋化因子受体5NH2端膜外第一襻及其特异抗体F(ab′)2的制备

目的:研究β趋化因子受体5（CCR5）NH2 端膜外第一襻结构域的功能及其特异抗体F(ab′)2的制备。方法:计算机分析趋化因子超基因家族，定位超基因家族中同源顺序最低的结构域NH2端膜外结构域，PCR扩增出该结构域114个核苷酸序列。构建融合表达载体pGEX-IN/NR5，经测序鉴定正确后，在E. coli中表达,经纯化后免疫新西兰兔。蛋白A亲和层析和胰蛋白酶消化IgG，经Sepharose-12 柱层析制备F(ab′)2。结果：经还原和非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳和FAX分析证明得到抗CCR5 NH2端的特异性抗体。结论：本方法为一简捷快速的特定功能结构域抗体F(ab′)2制备方法，对研究该基因在体内的表达及生物学功能提供了重要的实验材料，同时也对超基因家族中亚家族特异抗体研制提供了一种研究思路和方法。     

抗总黄曲霉毒素单克隆抗体2G2 F(ab'')2片段的特性

目的:研究经无花果蛋白酶酶切后所得的抗总黄曲霉毒素单抗2G2 F(ab′)2片段的特性,为研制开发特异性、灵敏度较高的黄曲霉毒素B1抗独特型单克隆、多克隆抗体提供科学依据.方法:在制备出抗总黄曲霉毒素单克隆抗体2G2株及其2G2 F(ab′)2片段的基础上,采用非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(非还原SDS-PAGE)和酶联免疫吸附法(ELISA)对单抗2G2及其F(ab′)2片段的特性进行研究并加以比较.结果:单抗2G2 F(ab′)2片段和单抗2G2的相对分子质量分别为105 000和180 000.单抗2G2 F(ab′)2片段和单抗2G2的比效价分别为3.33和1.25.单抗2G2 F(ab′)2片段的最低检出限和达到50%竞争抑制率时的检出限分别为0.17 μg/L和0.67μg/L,单抗2 G2的分别为0.47 μg/L和1 92 μg/L.单抗2G2 F(ab′)2片段的亲和力常数为2.95×10-9 mol/L,单抗2G2的亲和力常数为1.52×10-10 mol/L.结论:单抗2G2 F(ab′)2片段灵敏度优于完整抗体,可利用其生产特异性和灵敏度较高的黄曲霉毒素B1抗独特型多克隆和单克隆抗体.     

抗总黄曲霉毒素单克隆抗体2G2 F(ab')2片段的特性

目的:研究经无花果蛋白酶酶切后所得的抗总黄曲霉毒素单抗2G2F(ab′)2片段的特性,为研制开发特异性、灵敏度较高的黄曲霉毒素B1抗独特型单克隆、多克隆抗体提供科学依据。方法:在制备出抗总黄曲霉毒素单克隆抗体2G2株及其2G2F(ab′)2片段的基础上,采用非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(非还原SDS-PAGE)和酶联免疫吸附法(ELISA)对单抗2G2及其F(ab′)2片段的特性进行研究并加以比较。结果:单抗2G2F(ab′)2片段和单抗2G2的相对分子质量分别为105000和180000。单抗2G2F(ab′)2片段和单抗2G2的比效价分别为3.33和1.25。单抗2G2F(ab′)2片段的最低检出限和达到50%竞争抑制率时的检出限分别为0.17μg/L和0.67μg/L,单抗2G2的分别为0.47μg/L和1.92μg/L。单抗2G2F(ab′)2片段的亲和力常数为2.95×10-9mol/L,单抗2G2的亲和力常数为1.52×10-10mol/L。结论:单抗2G2F(ab′)2片段灵敏度优于完整抗体,可利用其生产特异性和灵敏度较高的黄曲霉毒素B1抗独特型多克隆和单克隆抗体。     

抗蝮蛇毒磷酸二酯酶单克隆抗体的制备及鉴定

从蝮蛇毒中提取磷酸二酯酶,用此酶免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Fo融合,以间接ELISA检测杂交瘤细胞培养上清液和小鼠腹水中的特异性抗体,其效价分别为1∶128和1∶51 200.抗原阻断试验结果表明,此抗体对蛇毒磷酸二酯酶具有特异性.该杂交瘤细胞株定为G_8,该株单抗属鼠IgG_(2a)亚型,经体外持续培养6个月,其分泌抗体性能稳定.     

抗钠泵α2亚单位截断性片段多肽抗体的制备与鉴定

目的采用多肽制备技术和免疫学技术制备抗钠泵α2亚单位截断性片段及其抗体,为检测和研究钠泵α2亚单位的组织学
分布及其功能研究提供实验基础。方法根据NCBI-Genebank 获得大鼠钠泵α2 亚单位M1~M2 膜外区截断性片段目的多肽
（LAAMEDEPSNDN）,采用9-氟甲氧羰基（Fmoc）固相合成法合成目的多肽,并采用碳化二亚胺法制备出多肽与孔戚血蓝素复
合物,免疫新西兰大白兔,免疫4次后获得抗血清,测定其效价。随后采用protein A纯化IgG抗体,并将其用于大鼠主动脉血管
平滑肌细胞钠泵α2 亚单的组织学检测。结果（1）人工合成的大鼠钠泵α2 亚单位截断性片段长13 氨基酸残基
（LAAMEDEPSNDN-C）,理论相对分子质量：1408.48,质谱实测相对分子质量：1407.90;高效色谱分析纯度HPLC纯度>85.5%;
（2）ELISA法检测免疫后兔子的抗血清效价均大于1∶512 000,蛋白A亲和纯化获得亲和纯化抗体浓度为0.965 mg/ml,按照1∶
1000稀释（终浓度1 μg/ml）,ELISA检测抗体效价为1∶256 000;（3）该抗体按照1∶100~1∶200稀释可用于免疫细胞学检测。结
论成功制备高效价抗钠泵α2亚单位截断性片段抗体可用于钠泵α2亚单位的ELISA和免疫细胞化学实验,为钠泵α2亚单位的
组织细胞学检测和功能研究提供新的实验基础。
     

呼吸道合胞病毒重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法及免疫原性研究

目的 建立呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法,并研究其免疫原性.方法 PCR扩增G1和F/M2基因片段,经酶切后插入原核表达载体pET-DsbA中,构建重组质粒pET-DsbA-G1F/M2,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni+螯合亲和色谱法纯化尿素变性的包涵体溶液,梯度透析复性,Western-blot鉴定重组蛋白的RSV特异性,免疫BALA/c小鼠,用ELISA测定抗体滴度,MTT法测定细胞毒性T细胞活性(CTL).结果 构建的重组质粒在E.coli中表达了RSV特异性的重组蛋白,经变性、纯化并复性后获得了高纯度的DsbA-G1F/M2(＞90%);该蛋白诱导了高滴度的RSV特异性抗体和CTL活性.结论 建立了重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法,该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究开发RSV重组亚单位疫苗奠定了基础.