人谷胱甘肽硫转移酶M1基因在CHO细胞中的表达

目的　构建人谷胱甘肽硫转移酶M1(GSTM1)的CHO细胞表达体系。方法　重组质粒pcDNA3 1 GSTM1用LipofectamineTM2 0 0 0转染CHO细胞 ,用G418筛选细胞的阳性克隆 ,并用PCR、RT PCR和Westernblot进行鉴定 ,测定GSTM1酶活性。结果　GSTM1基因已转染到CHO细胞的基因组 ,并转录表达 ,生成GSTM1蛋白 ,经测定活性达到2 8mmol/ (min·mgprot)。结论　通过CHO GSTM1细胞表达 ,为基因工程生产具有完整功能GSTM1的进一步纯化提供了材料 ,为研究化学致癌物在真核细胞中的代谢 ,作为遗传药理学、毒理学研究的候选细胞株奠定了基础。     

周期型马来丝虫基因稳定转染细胞株的建立

摘要:目的　将含周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Bm-CPI）基因的重组质粒pcDNA3.1（+）-Bm-CPI转染人宫颈癌细胞（Hela细胞）获得重组质粒稳定转染细胞株,为重组蛋白的获得提供基础。方法　将成功构建的重组质粒pcDNA3.1（+）-Bm-CPI转染Hela细胞,以G418筛选转染细胞,通过RT-PCR和SDS-PAGE鉴定G418筛选后的单克隆抗性细胞株。结果　重组真核表达质粒pcDNA3.1（+）-Bm-CPI转染Hela细胞后,d 14可见G418抗性细胞株开始形成。G418抗性Hela细胞株筛选、扩大培养后RT-PCR扩增出621bp左右的目的条带;SDS-PAGE检测获得了明显的目的条带。结论　实验证实pcDNA3.1（+）-Bm-CPI重组质粒被成功转入Hela细胞,并获得稳定表达;为进一步研究Bm-CPI表达、蛋白纯化和测定其生物学活性奠定了基础。     

HO-1不同活性真核表达载体的构建及鉴定

目的构建含有HO-1基因的重组载体并将其稳定转染到肝癌细胞系HepG2中。方法采用PCR技术扩增wtHO-1/mHO-1G143H基因片断,EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后连接pcDNA3.1（＋）载体与目的片段,转化DH5a菌株感受细胞,获得阳性重组质粒。采用脂质体法转染HepG2细胞系,G418筛选抗性克隆,利用半定量RT-PCR、Western blot检测转染细胞系中HO-1基因的表达。结果成功制作了HO-1活性增高和降低的细胞模型。结论 HO-1不同活性真核表达载体的成功构建,为进一步研究HO-1的功能奠定了基础。     

人IL-15基因在CHO细胞中的表达及其对鼻咽癌细胞增殖的抑制作用

目的在CHO细胞中进行人白细胞介素-15基因真核表达载体的稳定表达,并检测重组表达蛋白rhIL-15对鼻咽癌细胞体外增殖的抑制作用。方法将真核表达载体pcDNA3.1( )-hIL-15转染CHO细胞,G418筛选稳定表达株;采用RT-PCR和ELISA法对hIL-15的表达进行检测,MTT法检测rhIL-15对人鼻咽癌细胞系CNE-2Z体外增殖的抑制效应。结果人IL-15在CHO细胞中获得稳定表达,RT-PCR显示细胞的rhIL-15mRNA呈现高水平,ELISA检测到rhIL-15在细胞中的分泌性表达,浓度达(3.08±0.23)μg/ml,且所表达的人IL-15具有较强的抑制CNE-2Z鼻咽癌细胞增殖的作用。结论成功地在CHO细胞中获得了hIL-15蛋白的高效、稳定表达,重组表达蛋白rhIL-15体外能有效地抑制鼻咽癌细胞增殖,为进一步研究人IL-15抗肿瘤的分子机制及潜在的应用奠定了基础。     

TIF3转基因CHO和COS7细胞株的构建与鉴定

目的：TIF3（Mouse Translation Initiation Facfor 3)是从镉转化BALB／c-3T3细胞中克隆出来的新基因，其在基因文库（GenBank)的新添编号为AF271072。为了对该基因的生物学功能进行研究，构建了TIF3转基因CHO和COS7细胞株并作了鉴定。方法：采用磷酸钙介导转染技术和G418细胞筛选法，以pcDNA3.1/V5-His-TOPO为表达载体，构建TIF3转基因CHO和COS7细胞株；应用Western Blot技术对转基因表达产物进行分析与鉴定。实验设计分无转染组（空白对照）、载体转染组（载体对照）和目的基因转染组（载体＋TIF3cDNA)。结果：结果显示，无论在CHO细胞还是COS细胞，经转染和G418筛选后,无转染组的细胞100％死亡，而载体转染组和TIF3cDNA转染组的细胞形成较锪细胞集落。提示克隆化基因的细胞转染及G418筛选效果良好。经Western Blot分析与鉴定，在7株转染和经G418反复筛选的CHO细胞株中，有3株具有高效稳定表达约36kDa的TIF3编码蛋白质；在4株转染和经G418反复筛选的COS7细胞株中有2株也具有高效稳定的TIF3编码蛋白质表达，而无转染组和载体对照组的CHO和COS7细胞均缺乏此蛋白质表达。结论：本研究成功地构建了3株TIF3转基因CHO细胞株和2株TIF3转基因COS7细胞株。这两类TIF3转基因哺乳动物细胞稳定表达系统的建立，对今后的镉化物相关癌基因的发现及其生物学功能的研究具有重要的应用价值。     

肠上皮细胞中性氨基酸载体B0AT1的真核表达及稳定转染体系的建立

目的: 构建可表达人中性氨基酸载体B0AT1基因的真核表达载体,建立重组质粒转染的Hela细胞系,筛选出稳定表达人B0AT1的细胞株. 方法: 提取人正常小肠上皮细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增出B0AT1基因片段,EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后,将其插入至真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-B0AT1,转化E.coli DH5α菌株感受态细胞,将阳性克隆脂质体法转染Hela细胞,经G418筛选获得稳定表达株,用RT-PCR法检测B0AT1基因的mRNA表达. 结果: 从小肠上皮细胞中成功克隆到人B0AT1基因.酶切和序列测定表明已成功构建真核表达载体pcDNA3.1-B0AT1,将此重组质粒转染的Hela细胞,可稳定表达人B0AT1基因,并筛选出稳定表达B0AT1的Hela细胞系.氨基酸摄取实验证实,转染pcDNA3.1-B0AT1的Hela细胞具有B0AT1基因的生物学活性. 结论: 重组人中性氨基酸载体B0AT1克隆成功,并在Hela细胞中获得稳定表达.     

巨噬细胞抑制因子在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的:在毕赤酵母表达系统中获得巨噬细胞抑制因子(MIC-1)高效分泌表达,并鉴定其免疫活性。方法:从BeWo细胞系中提取总RNA,通过反转录PCR获得目的片段,然后将基因亚克隆入pPIC9k表达载体,线性化后转化GS115酵母细胞,经G418抗性筛选获多拷贝重组子并诱导表达,PCR鉴定目的基因的整合。表达产物用Westernblot鉴定生物活性。结果:经过G418筛选到34株阳性克隆,MIC-1蛋白最高表达量为6.332mg/L。结论:成功构建了MIC-1表达载体,在酵母中获得多拷贝高效表达,并且形成正确的蛋白结构。     

VEGF165在哺乳动物细胞中的稳定表达

目的探讨pcDNA3．1-VEGF165质粒对哺乳动物细胞的表达和转染。方法将pcDNA3．1-VEGF165质粒用电转的方法导入CHO细胞中，C418筛选细胞克隆。通过RT—PCR、ELISA、Westen—blot在转录水平和蛋白质水平上检测VEGF165在转基因CHO细胞中的表达。通过内皮细胞增殖实验和血管通透性实验检测所表达的VEGF165的生物学活性。结果获得有C418抗性的CHO细胞克隆。RT—PCR扩增出一条大小约600bp的特异性泳带，测序结果与VEGF165mRNA一致。ELISA显示细胞培养上清的VEGF浓度约为10-20ng／ml。WESTEN—BLOT检测到大小为23KD的特异性蛋白质条带。内皮细胞增殖实验显示细胞培养上清具有促内皮细胞增殖作用。血管通透性实验显示细胞培养上清明显增加毛细血管通透性。结论pcDNA3．1-VEGF165质粒真核表达系统能在哺乳动物细胞中表达具有良好生物学活性的VEGF165蛋白。     

增强型绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子包装细胞系的建立及鉴定

目的：建立及鉴定产生绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子（hRI）的PA317包装细胞系。方法：采用脂质体转染法将pLNCX-EGFP-C1-hRI质粒转染至PA317包装细胞,分为空白细胞组（未转染组）、pLNCX-EGFP-C1转染组（对照组）、pLNCX-EGFP-C1-hRI转染组（实验组）,每组设3个复孔,转然后用RT-PCR和Western blot方法检测egfp-hRI基因在PA317细胞的表达。结果：RT-PCR和Western blot方法显示,转染后在PA317细胞中检测到egfp-hRI基因表达;用脂质体转染法获得了G418阳性的PA317包装细胞克隆。结论：实验成功建立了产生绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的PA317包装细胞系,为后续试验奠定了基础。     

上调HCCR-2基因表达对乳腺癌细胞增殖与凋亡的影响

目的利用细胞转基因技术探讨人宫颈癌癌基因-2(HCCR-2)对人乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响及其可能的分子机制。方法经脂质体介导将含有HCCR-2真核表达质粒转染人乳腺癌MCF-7细胞株,采用G418筛选阳性细胞克隆及Western blot鉴定;Western blot检测阳性细胞克隆Bcl-2、Bax蛋白表达改变;流式细胞仪检测细胞凋亡率;噻唑盐(MTT)比色法检测阳性细胞克隆的增殖活性。结果成功建立高表达HCCR-2的阳性MCF-7细胞克隆(M-23),并证实其Bcl-2蛋白表达与细胞增殖活性均显著增高,而Bax蛋白表达与细胞凋亡显著降低。结论上调MCF-7细胞HCCR-2基因后,细胞增殖活性增加,细胞凋亡降低,其作用机制与Bcl-2表达增加而Bax表达降低。     

人谷胱甘肽硫转移酶A1原核表达系统的构建及高效表达

目的　对人谷胱甘肽硫转移酶A1(GSTA1)原核表达系统的构建及高效表达。方法　采用RT -PCR方法将肝组织中提取总RNA扩增人GSTA1基因的cDNA序列 ,将其插入到原核表达载体pET30a多克隆位点中 ,构建重组表达质粒 ,并用PCR扩增、酶切分析及序列测定等方法对重组质粒进行鉴定 ,并进行了高效表达。结果　人GSTA1克隆到原核表达载体pET30a多克隆位点中 ,测序结果同GenbankGSTA1(GI:2 2 0 914 5 3)cDNA序列相比较 ,在 5 12位点T→C ,氨基酸由Met→Thr,同源性为 99% ,基因登陆号为AY5 32 92 8。通过IPTG诱导表达 ,在 34.4KDa处 1、2、3、4小时的表达量分别为 4 1.8%、6 8%、6 8.3%、83%。结论　经Westernblot分析 ,证实GSTA1基因在原核表达系统中有蛋白质表达     

高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白NP真核表达载体的构建、表达与鉴定

目的构建高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白(NP)的真核表达载体,并在哺乳动物细胞中表达、鉴定其编码重组蛋白NP。方法采用RT-PCR法扩增NP基因,T-A克隆到pMD18-T载体中构建pMD18-T-NP质粒。经PCR、双酶切鉴定后,双酶切阳性质粒与pXJ40-HA载体,电泳后胶回收,连接目的片段,构建pXJ40-HA-NP质粒,经PCR、双酶切、测序分析鉴定为阳性的质粒即为NP蛋白的真核表达载体。转染293T细胞后,采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组NP蛋白的表达。结果成功构建了高致病性禽流感病毒H5N1亚型NP基因的真核表达载体,并在293T细胞中成功表达出分子量为56kD的重组蛋白。结论成功构建的NP蛋白真核表达载体为进一步研究其功能,研发高致病性禽流感病毒H5N1亚型的诊断、治疗方法和疫苗奠定了基础。     

乙肝病毒preS1基因与截短C基因真核表达载体构建及表达

目的建立乙型肝炎病毒（HCV）preS1基因与截短C基因真核表达载体，并在CHO细胞中瞬时表达。方法PCR方法扩增HBV核心区羧基端部分缺失的基因片段和preS1全基因，克隆入真核表达载体pcDNA3．1（-）后测序鉴定，并通过脂质体瞬时转染CHO细胞。结果构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-Ct-preS1，成功转染CHO细胞，间接免疫荧光和RT—PCR证实pcDNA3．1（-）-Ct-preS1在CHO中表达截短的核心基因和preS1基因融合蛋白。结论成功构建preS1基因与截短C基因真核表达载体，可在CHO细胞中瞬时表达，为深入研究HBV基因免疫奠定了基础。     

柴胡皂苷d对免疫性肝纤维化大鼠TGF-β1、HYP、SOD、MDA的影响

目的构建大鼠免疫性肝纤维化模型,探讨柴胡皂苷D(SS-d)抗模型鼠肝纤维化的药理学活性及其相关机制。方法猪血清免疫法建立大鼠肝纤维化模型,实验分为6组:正常对照组、模型组、高中低剂量SS-d用药组(20、10、5mg/kg)及秋水仙素(Col,0.1mg/kg)用药组。放射免疫分析法测定大鼠血清透明质酸酶(HA)、层粘连蛋白(LN)和III型前胶原(PCIII)的水平。分光分析法检测标本中超氧化物歧化酶(SOD)活性和羟脯氨酸(Hyp)、丙二醛(MDA)的含量。荧光定量PCR和Westernblot检测肝组织中TGF-β1mRNA和蛋白表达的变化。结果成功构建了免疫性大鼠肝纤维化模型,模型鼠中血清HA、LN和PCIII显著高于正常对照组(P﹤0.01),SS-d可以剂量依赖性地抑制模型组血清中HA、LN和PCIII肝纤维化指标的升高(P﹤0.05)。与模型组比较SS-d可以剂量依赖性地减低肝组织中Hyp和MDA的含量,同时也剂量依赖性地升高SOD的活性(P﹤0.05)。荧光定量PCR和Westernblot检测结果显示SS-d可以剂量依赖性地下调模型鼠肝组织中TGF-β1mRNA和蛋白的表达水平。结论 SS-d具有较好的抗肝纤维化作用,其作用机制可能与提高SOD活性、减少氧自由基的生成、抑制TGF-β1信号通路的活化有关。     

齐墩果酸对白血病HL-60细胞cav-1表达的影响

目的：研究齐墩果酸（oleanolic acid,OA）对白血病HL-60细胞窖蛋白-1（Caveolin-1,CAV-1）表达的影响。方法：OA作用HL-60细胞后,倒置显电镜观察细胞形态;RT-PCR检测HL-60细胞cav-1的mRNA表达;Western blot检测CAV-1蛋白水平。结果：OA作用HL-60细胞后,RT-PCR检测cav-1mRNA表达上调（P〈0.01）;Western blot检测CAV-1蛋白水平升高（P〈0.01）。结论：OA通过上调CAV-1的表达,抑制HL-60细胞增殖。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白3稳定细胞系的建立

目的利用丙型肝炎病毒非结构基因NS3的真核表达载体（pCMV-Tag1-NS3）在HEK293细胞中进行表达。方法通过酶切分析和DNA序列分析鉴定pCMV-Tag1-NS3重组载体构建正确后,通过脂质体介导转染HEK293细胞,用RT-PCR和Western blotting证实丙型肝炎非结构蛋白NS3基因（HCV-NS3）表达。结果 RT-PCR结果显示HCV-NS3基因的mRNA在转染的HKK293细胞中表达,Western blotting结果也显示蛋白质能正确表达。结论成功构建了实现HCV-NS3过表达的稳定HEK293细胞系,为获得HCV非结构蛋白3的重组蛋白以及早期诊断试剂的研制与筛选药物提供了基础。     

LKB1 - AMPK - mTOR信号通路在良性和恶性胸腔积液中的表达

目的 研究LKB1 - AMPK - mTOR信号通路在肿瘤患者胸腔积液中的表达,从分子水平探明其在良、恶性胸腔积液中的影响,为肿瘤的诊断和治疗提供新思路。方法 以肿瘤患者的胸腔积液为研究对象,其中恶性胸水（肺腺癌）55例,良性胸水45例;将良性胸水作为对照组,恶性胸水为实验组,分别抽提2组细胞总RNA与总蛋白,RT - PCR检测LKB1、AMPKα和mTOR mRNA表达情况,Western blot方法检测AMPKα、P - AMPKα、LKB1、mTOR及p - mTOR蛋白表达情况。结果 RT - PCR 结果显示,与良性对照组比较,恶性胸水中LKB1 mRNA表达量降低,差异有统计学意义 (P＜0.01);AMPKa mRNA表达量降低,差异有统计学意义 (P＜0.001);mTOR mRNA表达量升高,差异有统计学意义(P＜0.001)。Western blot 结果显示,与良性对照组比较,恶性胸水中LKB1蛋白表达量降低,差异有统计学意义(P＜0.001);AMPKα、mTOR 蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05)。结论 从分子水平可以初步推测此信号通路是通过激活LKB1进而使AMPK活化,负性调节mTOR表达这一经典活化途径调节恶性积液的基因表达。     

EXPRESSION OF CLAUDIN-1 IN MOUSE TESTIS

In testis, tight junctions (TJs) between adjacent Sertoli cells are important for the formation of the blood-testis barrier (BTB) and crucial for spermatogenesis. The present study aimed to find postnatal changes in the expression of claudin-1, one of the TJ genes in mouse testis. By semiquantitative RT-PCR, it was found that claudin-1 expression in testis increased up to a peak at 10 days after birth and decreased thereafter. Western blot analysis showed abundant expression of 21-kDa protein in testis, lung, and brain from the adult mouse. The developmental change in the expression of claudin-1 protein in testis coincided with that from the RT-PCR. Testosterone treatment significantly increased claudin-1 expression in immature Sertoli cells, suggesting the possible regulation of claudin-1 expression by androgen in mouse Sertoli cells. Claudin-1 expression appears to be developmentally regulated in the mouse testis.     

茶多酚和茶色素对肝癌细胞株HepG2细胞周期的影响

为探讨茶对肝癌细胞周期的影响 ,体外培养人肝癌细胞株HepG2 ,加入终浓度为 50mg L和 1 0 0mg L茶多酚和茶色素作用 48h后 ,流式细胞仪分析DNA含量 ,Westernblot观察对细胞周期蛋白P2 1 WAF1 CIP1 和细胞周期素D1 (cyclinD1 ) ,RT PCR检测细胞周期素依赖激酶 4 (Cdk4)在mRNA水平上的表达情况。结果表明 ,茶多酚和茶色素引起了细胞周期G1 期阻滞 (G1 arrest) ,抑制了cyclinD1蛋白的表达 ,诱导了P2 1 WAF1 CIP1 蛋白的表达增加 ,并且显著抑制了Cdk4在mRNA水平上的表达。因此 ,诱导细胞周期阻滞可能是茶预防肿瘤的一个重要机制     

小鼠Tox3基因重组慢病毒载体的构建及其在卵巢颗粒细胞中的表达

目的：构建重组慢病毒载体pCDH-Tox3-Flag,并检测其转染小鼠原代卵泡颗粒细胞后的表达情况。方法：利用DNA重组技术将小鼠Tox3基因克隆入慢病毒表达载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pCDH-Tox3-Flag、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染HEK293FT细胞,包装重组慢病毒LV-Tox3-Flag,并感染小鼠原代颗粒细胞,用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Tox3 mRNA的转录水平,蛋白质印迹（Western blot）法检测TOX3-Flag蛋白的表达情况。结果：经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体LV-Tox3;RT-PCR及Western blot 结果显示慢病毒感染小鼠原代颗粒细胞后,Tox3基因能在细胞内正确转录、翻译并稳定表达TOX3蛋白。结论：成功建立Tox3基因慢病毒表达载体LV-Tox3-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠原代颗粒细胞,并使Tox3基因得到稳定表达,为后续研究Tox3基因在生殖相关疾病的生理与病理作用奠定了基础。