兔脂肪干细胞的分离培养鉴定及诱导分化研究

目的:分离培养家兔脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ASCs),观察体外培养生长特性,并在特定条件下诱导分化,探讨其成脂成骨分化能力。方法:无菌条件下切取家兔腹股沟处脂肪组织,0.25%Ⅰ型胶原酶消化,分离培养原代细胞,取第3代ASCs做实验,用HE染色观察细胞形态,MTT比色法测定细胞生长曲线;用流式细胞仪检测其细胞表面标志物;用油红O染色和茜素红染色鉴定成脂和成骨诱导分化。结果:从家兔脂肪组织中分离获得的ASCs形态为长梭形,成纤维细胞样,生长活力旺盛,具有较强的增殖能力;流式细胞仪分析CD29呈阳性表达,CD31呈阴性表达;成脂诱导的细胞油红O染色阳性,成骨诱导的细胞茜素红染色阳性。结论:本实验分离培养的细胞为ASCs,具有成脂和成骨分化潜能。     

2型糖尿病大鼠脂肪干细胞体外成骨能力的研究

目的:比较2型糖尿病(T2MD)大鼠和正常SD大鼠脂肪来源干细胞(ASCs)的增殖及多向分化能力。方法:取16只SPF级8周龄SD大鼠,随机分为两组(n=8):糖尿病组,采用高脂高糖饲料构建T2DM大鼠模型;对照组常规饲料喂养,比较两组大鼠的血糖水平。建模成功8周后,分别培养两组大鼠腹股沟处的ASCs,显微镜下观察细胞形态;CCk-8法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞表面标志物;取第3代细胞行成骨和成脂诱导实验,实时定量PCR检测成骨诱导7 d时成骨相关基因的表达。结果:两组大鼠脂肪组织均可分离获得ASCs,且细胞形态和增殖能力无显著差异(P>0.05);两组细胞均高表达CD44和CD90,低表达CD34和CD45;T2DM大鼠P3代ASCs成脂诱导后油红O染色较正常组强,而成骨诱导后碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色较正常组弱;ALP蛋白活性检测较正常组低;ALP、OCN、OPG和RUNX2等成骨相关基因的表达水平较正常组低。结论:T2DM大鼠ASCs体外成骨分化能力较弱。     

大鼠牙囊细胞多向分化潜能的体外研究

目的:体外研究用差速贴壁法和有限稀释法纯化的大鼠牙囊细胞(Dental foilicle cells,DF-Cs)的多向分化潜能,为用于口腔组织工程的种子细胞奠定基础。方法:体式显微镜下准确分离7 d龄SD大鼠第一磨牙牙囊组织,使用酶消化法、有限稀释法、差速贴壁法进行培养和纯化细胞,取第3代细胞分别进行以下检测:①流式细胞仪鉴定细胞表面抗原标记;②骨向诱导、成脂诱导、成神经诱导和相关检测。结果:①差速贴壁法和有限稀释法纯化培养的大鼠牙囊细胞大多呈长梭形,部分细胞呈三角形,细胞形态呈现异质性;②流式细胞仪检测结果显示所获得的牙囊干细胞表面标记CD29、CD90阳性率分别为95.6%、98.6%,而CD45的阳性率仅为4.2%;③成骨诱导后,茜素红染色呈阳性,ALP染色显示ALP表达增强明显;成脂诱导后细胞胞浆内可见明显脂滴,油红O染色呈阳性;神经细胞诱导后细胞形态发生明显改变,神经微管蛋白染色呈阳性。结论:体外培养的大鼠牙囊细胞具有较强的多向分化能力,可作为口腔组织工程理想的种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养与鉴定

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的体外培养方法及其生物学特性。方法:体外分离、培养大鼠BMSCs,进行细胞形态学观察、生长曲线测定、细胞表面标记物检测;并采用体外诱导分化方法对BMSCs多向分化潜能进行鉴定。结果:大鼠BMSCs传代后细胞生长状态相对稳定,呈梭形;流式细胞仪鉴定CD90阳性率为88.2%,CD29阳性率为98%,CD34阴性率为2.8%,CD45阴性率为2.7%。成骨诱导21 d后,茜素红染色后可在显微镜下观察到矿化结节形成。成脂诱导14 d,油红O染色后显微镜下可见红色脂滴形成。结论:BMSCs在体外培养中贴壁生长,增殖较快;表达骨髓组织来源干细胞的表面标记物CD29、CD90;诱导后能向成骨细胞、脂肪细胞分化。     

犬外周血基质细胞的分离培养及其横向分化潜能研究

目的：对犬外周血基质细胞（peripheral blood stromal cells,PBSCs）进行体外分离培养,研究其向成骨、成脂方向诱导分化的潜能。方法：取犬外周血,利用密度梯度离心法分离培养犬外周血基质细胞,免疫组化方法检测CD34和CD105表达情况;并用特定诱导液将分离的细胞向成骨细胞和脂肪细胞定向诱导分化。结果：该细胞表达CD105,不表达CD34;成骨诱导后,矿化结节茜素红染色阳性、OPN表达阳性;成脂诱导后,经油红O染色可见细胞内脂滴的积累。结论：利用密度梯度离心与贴壁培养相结合的方法可分离培养出外周血基质细胞,外周血基质细胞经诱导培养后具有多向分化潜能,有可能成为组织工程的种子细胞。     

兔下颌骨来源骨髓间充质干细胞的体外培养及鉴定

目的:探讨兔下颌骨来源的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)体外分离、培养并对下颌骨来源的BMMSCs进行鉴定.为骨组织工程提供种子细胞.方法:取兔下颌骨中的骨松质,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁培养,取P2或P3代BMMSCs进行检测.倒置显微镜下观察细胞形态;MTT法测定细胞增殖并绘制细胞生长曲线;克隆形成实验计算克隆形成率;向成骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞多向诱导分化;流式细胞仪检测细胞表面抗原标记.采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析.结果:细胞经传代后形态一致,呈梭形或三角形;细胞生长曲线显示,下颌骨BMMSCs经历潜伏期、对数生长期和平台期;克隆形成率为37％;成骨及成脂诱导形成钙结节及脂滴,茜素红及油红O染色呈阳性;成骨骼肌诱导desmin抗原标记阳性;流式细胞仪检测结果显示,所获得的下颌骨BMMSCs纯度较高.CD90和CD146表面标记阳性率分别为98.7％、98.1％.结论:从兔下颌骨分离的BMMSCs纯度较高,有强大的自我复制、增殖特性和体外多向诱导分化潜能,有望成为骨组织工程的种子细胞.     

CKIP-1对骨髓间充质干细胞体外增殖和分化能力的影响

目的：探讨CKIP-1基因对小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖和分化能力的调控。方法：选择CKIP-1基因敲除型小鼠（KO）和野生型C57小鼠（WT）,采用全骨髓贴壁法培养BMSCs,取第3代BMSCs,分为KO组和WT组,分别采用成骨及成脂诱导液对细胞进行诱导培养,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测目的细胞表面标记分子,用ALP染色、茜素红染色、油红O染色分别对细胞成骨及成脂能力做定量分析。结果：2种细胞增殖和干细胞分子表达相似;成骨诱导后ALP染色显示,KO组的细胞染色的阳性率要大于WT组。茜素红染色观察显示KO组的矿化结节要多于WT组;油红O染色显示KO组细胞的脂质沉淀量大于WT组。结论：CKIP-1基因缺失可以使BMSCs成骨及成脂分化能力增强,对其增殖影响不明显。     

脂肪干细胞的培养鉴定及多向诱导分化

目的:进行脂肪干细胞的分离、培养和鉴定,阐明脂肪干细胞的生物学特性。方法:无菌条件下取新西兰大耳白兔腹股沟处脂肪组织,从中获得纯化的脂肪来源干细胞。HE染色观察细胞形态;流式细胞术检测细胞表面标志物;多向诱导后检测其成脂、成骨及成软骨分化能力。结果:提取的兔脂肪干细胞形态为成纤维细胞样,生长旺盛,可以稳定增殖20代以上。流式细胞术分析显示CD44呈阳性表达,CD34、CD14呈阴性表达;经体外诱导培养后,向成脂细胞、成骨细胞及成软骨细胞分化。结论:本实验成功分离、培养和鉴定了脂肪干细胞,脂肪干细胞体外增殖稳定,并且具有成脂、成骨及成软骨多向分化潜能。     

富血小板纤维蛋白对兔脂肪干细胞成骨分化的影响

目的：体外分离培养兔脂肪干细胞（adipose—derived stem cells,ADSCs）,鉴定其分化能力并观察富血小板纤维蛋白（platelet—rich fibrin,PRF）对ADSCs成骨分化的影响。方法：取新西兰兔腹股沟处的脂肪组织,将其分离获得脂肪干细胞,培养至第三代用于实验。分别以油红O、茜素红染色鉴定其成脂和成骨分化能力。取兔耳中央动脉血一次离心法制备PRF膜。将脂肪干细胞分为2组：对照组不含PRF膜;实验组含PRF膜。用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测不同时间点PRF对ADSCs成骨分化的影响。结果：脂肪干细胞呈长梭形贴壁生长;油红O及茜素红染色均呈阳性;在不同的时间点,实验组ALP活性值均高于对照组（P〈0．05）。结论：ADSCs具有成骨的潜能,且PRF可以促进ADSCs向成骨细胞分化。     

大鼠颌骨与胫骨骨髓基质细胞生物学特性和基因表达差异的比较

目的 :比较大鼠颌骨来源骨髓基质细胞(M-BMSCs)与胫骨来源骨髓基质细胞(T-BMSCs)生物学特性的差异。方法:体外通过全骨髓贴壁法,分离和培养SD大鼠M-BMSCs和T-BMSCs,取第3代细胞用于:1流式细胞检测鉴定表面标志;2MTT、细胞周期、克隆形成率检测细胞增殖能力差异;3成骨、成脂诱导及染色检测细胞多项分化潜能;4碱性磷酸酶(ALP)活性、染色、免疫荧光染色检测细胞成骨活性的差异;5荧光定量PCR检测Wnt1、Wnt5a、Hoxa11、Runx2、Ocn、Col I的表达差异和成骨诱导后各基因的表达变化。结果:1 M-BMSCs和T-BMSCs阳性表达CD29、CD44,阴性表达CD45;2MTT、细胞周期检测、克隆形成率显示T-BMSCs细胞增殖能力较高;3M-BMSCs在成骨诱导后矿化能力更强;而T-BMSCs成脂诱导形成脂滴的能力更强;4M-BMSCs表达ALP的水平更高;5荧光定量PCR示2种细胞的Wnt1、Wnt5a、Hoxa11、Runx2、Ocn、ColⅠ表达存在差异。结论:体外培养的M-BMSCs和TBMSCs有着不同的生物学特点,其相关基因Wnt1、Wnt5a、Hoxa11、Runx2、Ocn、ColⅠ的表达上存在差异。     

糖基化终末产物对人牙周膜干细胞骨向分化能力影响的研究

目的:探讨糖基化终末产物(AGEs-HSA)对人牙周膜干细胞(HPDLSC)骨向分化能力的影响。方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,流式细胞仪检测牙周膜细胞表型分子CD44、CD146、stor-1、CD90,对其进行干细胞鉴定,将培养出的牙周膜干细胞与不同浓度的AGE-HSA共同培养,并矿化诱导后茜素红染色观察钙结节形成情况、碱性磷酸酶染色观察ALP活性、实时定量聚合酶链反应(real timePCR)检测成骨基因表达情况。结果:流式细胞仪细胞表型分析CD44、CD146、stor-1、CD90表达呈阳性。成骨诱导21 d后茜素红染色,对照组和实验组均出现不同程度的矿化结节,定量分析显示1、10、100、200μg/mLAGEs组矿化能力均比对照组低,差异均有统计学意义(P<0.05);不同浓度的实验组之间矿化能力均有统计学差异(P<0.05),且随着AGEs浓度的升高,矿化能力逐渐降低。成骨诱导7 d ALP染色比较发现各实验组均比对照组减弱。成骨诱导1周后RT-PCR检测各实验组的成骨基因ALP、Runx-2、Col-1、Runx-2 mRNA表达水平均较对照组低,差异有统计学意义(P<0.05);不同浓度的实验组之间各成骨基因的表达也有统计学差异(P<0.05)。结论:AGEs能抑制HPDLSC的骨向分化,并在一定范围内呈浓度依赖性。     

小鼠上颌突和下颌突间充质细胞成骨分化的体外研究

目的：研究上、下颌突间充质细胞在体外的成骨能力。方法 ：体外培养胚胎13.5d（E13.5）的小鼠上、下颌突间充质细胞,观察其细胞形态。取第1代细胞进行成骨诱导培养7 d,通过免疫荧光、ALP染色、茜素红染色和qPCR检测其成骨能力。应用SPSS 18.0软件包对实验结果进行独立样本t检验。结果：E13.5的小鼠上、下颌突间充质细胞能在体外成功培养和传代。成骨诱导可促进上、下颌突间充质细胞表达成骨标志物,但下颌突间充质细胞成骨标志物OCN和OPN的表达、ALP染色和茜素红染色较上颌突间充质细胞弱。结论：上、下颌突间充质细胞在体外能成骨分化,下颌突间充质细胞较上颌突间充质细胞的成骨能力稍弱。     

Isolation and characterization of multipotent human periodontal ligament stem cells

BACKGROUND: Periodontal ligament (PDL) repair is thought to involve mesenchymal progenitor cells capable of forming fibroblasts, osteoblasts and cementoblasts. However, full characterization of PDL stem cell (SC) populations has not been achieved. OBJECTIVE: To isolate and characterize PDLSC and assess their capability to differentiate into bone, cartilage and adipose tissue. METHODS: Human PDL cells were stained for STRO-1, FACS sorted and expanded in culture. Human bone marrow SC (BMSC) served as a positive control. PDLSC and BMSC were cultured using standard conditions conducive for osteogenic, chondrogenic and adipogenic differentiation. Osteogenic induction was assayed using alizarine red S staining and expression of alkaline phosphatase (ALP) and bone sialoprotein (BSP). Adipogenic induction was assayed using Oil Red O staining and the expression of PPAR gamma 2 (early) and LPL (late) adipogenic markers. Chondrogenic induction was assayed by collagen type II expression and toluidine blue staining. RESULTS: Human PDL tissue contains about 27% STRO-1 positive cells with 3% strongly positive. In osteogenic cultures ALP was observed by day-7 in BMSC and day-14 in PDLSC. BSP expression was detectable by day-7; with more intense staining in PDLSC cultures. In adipogenic cultures both cell populations showed positive Oil Red O staining by day-25 with PPAR gamma 2 and LPL expression. By day-21, both BMSC and PDLSC chondrogenic induced cultures expressed collagen type II and glycosaminoglycans. CONCLUSIONS: The PDL contains SC that have the potential to differentiate into osteoblasts, chondrocytes and adipocytes, comparable with previously characterized BMSC. This adult PDLSC population can be utilized for potential therapeutic procedures related to PDL regeneration.     

牙囊干细胞诱导成骨的体外研究

目的:体外研究牙囊干细胞(DFSC)的成骨能力,为其在牙周组织工程中的应用提供理论基础。方法:结合组织块法和酶消化法分离培养DFSC,用有限稀释法纯化细胞,经细胞形态、免疫组化和流式细胞技术鉴定DFSC后,然后进行成骨诱导,并通过碱性磷酸酶和茜素红染色、Real-timePCR、Western-blot检测成骨/牙骨质细胞表面标记物ALP、OCN、BMP2、RUNX2的表达。结果:DFSC具有较强的增殖能力,免疫组化示波形丝蛋白表达阳性,角蛋白表达阴性;DFSC高表达间充质干细胞表面标记物CD44、CD90、CD105、CD146;随着诱导时间的增加,其ALP、OCN、BMP2、RUNX2的表达明显上调(P＜0.05)。结论:DFSC是牙周组织再生良好的种子细胞,必将为牙周组织再生治疗开辟新的途径。     

A nanoscale ridge/groove pattern arrayed surface enhances adipogenic differentiation of human supernumerary tooth-derived dental pulp stem cells in vitro

Objective

The aim of this study was to establish human dental pulp stem cells (hDPSCs) from supernumerary teeth and determine the effects of a 350-nm nano-patterned surface on adipogenic and osteogenic differentiation of hDPSCs.

Design

Several surface markers were analysed by FACS to confirm the isolated cells as hDPSCs. To demonstrate the effects of a nano-patterned surface on the differentiation of hDPSCs, the cells were cultured on a nano-patterned surface with or without adipogenic or osteogenic induction factors. Cells were then stained with Oil red O or Alizarin red, and the lineage specific genes LPL and Runx-2 were analysed by real-time PCR at 3, 6 and 9 days after culture.

Results

The hDPSCs on a nano-patterned surface showed a linear arrangement compared to irregular cells on a conventional surface. During adipogenic differentiation, more Oil red O stained cells were found in the nano-patterned group than in the conventional group. On the other hand, there was no significant difference in Alizarin red staining between the nano-pattern and conventional surface groups after induction of osteogenic differentiation. Gene expression analyses revealed significantly higher expression of LPL in the nano-patterned group than in the conventional group, whereas Runx-2 expression was higher in the conventional group than in the nano-patterned group.

Conclusion

This study showed that a nano-patterned surface may be able to enhance adipogenic differentiation of hDPSCs by altering their morphology and gene expression patterns, whereas the same surface may inhibit or suppress osteogenic differentiation of the cells.     

低强度脉冲超声对不同钛表面骨髓间充干细胞成骨分化的影响

目的:观察低强度脉冲超声(LIPUS)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在钛片表面成骨分化的影响.方法:将体外培养的BMSCs分别接种于光滑钛表面和大颗粒喷砂酸蚀(SLA)钛表面,进行矿化诱导并实施超声干预和假刺激.于矿化诱导后3、7d进行碱性磷酸酶(ALP)定量检测,14 d进行ALP染色观察;矿化诱导21 d后行茜素红染色;于矿化诱导14、21 d检测成骨相关基因及蛋白表达.结果:矿化诱导后3、7d超声组ALP活性较对照组高(P＜0.05),14 d超声组与对照组相比钛片表面ALP染色明显深染;茜素红染色显示,21 d后超声组的染色更明显且形成更多的矿化结节;超声组的成骨相关蛋白成骨转录因子2、骨形成蛋白、骨桥蛋白表达增高;RT-PCR检测到成骨相关基因、ALP、成骨转录因子2、骨形成蛋白、骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白均有不同程度表达增高(P＜0.05).结论:LIPUS可以促进光滑及SLA钛表面BMSCs的成骨分化.     

干细胞表面标志物在牙髓干细胞中的表达

目的:探讨磁珠分选后培养的人牙髓干细胞的表面标记抗原随培养代数增加的变化情况。方法:改良组织块法培养的人牙髓细胞,至第2代（P2）时,用磁珠方法分选出STRO-1阳性细胞,用流式细胞术分别检测P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8代的干细胞表面标志物CD73、CD90、CD105、 CD166、STRO-1。取P3代细胞,分别进行成骨诱导和成脂诱导。21 d后,分别行茜素红染色和油红O染色,观察矿化物形成情况和脂滴形成情况,同时以未诱导细胞为对照。结果:STRO-1在牙髓干细胞表面随代数增加而下降,CD73、CD90、CD105、 CD166的表达比较稳定,茜素红染色可见矿化结节形成,油红O染色显示形成大量脂滴。结论:STRO-1在牙髓干细胞表面随代数增加而下降,其他干细胞标志物比较稳定。