巢式RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的意义

目的 探讨巢式RT-PCR技术在检测急性早幼粒细胞白血病(APL)患者PML/RARα融合基因的价值。 方法 采用巢式RT-PCR检测218例初诊为APL患者的PML/RARα融合基因的表达水平及在部分患者的动态变化;随机选择39例APL完全缓解(CR)的患者,分别用流式细胞术(FCM)和巢式RT-PCR监测外周血或骨髓中的微小残留病(MRD)白血病细胞。 结果 在确诊的167例APL患者中PML/RARα融合基因阳性率为90.4%(151/167);39例APL-CR患者中PML/RARα融合基因阳性率76.9%(30/39);FCM和巢式RT-PCR监测APL-CR患者MRD有很好的一致性(P＞0.05)。 结论 巢式RT-PCR对APL的诊断有高灵敏度和高特异性;对APL的疗效及预后判断有重要临床意义。     

中期荧光原位杂交在急性早幼粒细胞白血病诊断和微小残留病检测中的应用

为研究中期荧光原位杂交(M-FISH)在急性早幼粒细胞白血病(APL)诊断及其微小残留病(MRD)检测中的价值,应用17号全染色体彩涂探针对10例初诊时按细胞形态学诊断为急性髓细胞白血病(AML)的未治疗患者(初治APL 5例,复发APL 3例,AML-M1和AML-M5各1例)和10例治疗后获完全缓解(CR)的APL患者作了M-FISH检测,并与常规细胞遗传学和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)结果相比较.10例未治AML中,7例M-FISH呈阳性结果,核型分析显示其中4例有t(15;17)易位,3例为正常核型,它们中除1例未检测外,其余6例的RT-PCR均检出PML/RARα融合转录本;3例M-FISH呈阴性结果,其中1例核型分析揭示del(2q)×2异常,RT-PCR显示PML/RARα融合转录本阳性,1例有复杂核型异常,RT-PCR显示PML/RARα融合转录本阴性,1例有t(9;22)易位,RT-PCR显示PML/RARα融合转录本阴性而BCR/ABL融合转录本阳性.后两者的诊断由AML-M3改正为AML-M2.10例CR后的APL核型分析均未见异常,而15次M-FISH检测有12次都发现1-5个阳性细胞,此与RT-PCR结果相一致.白血病复发见于其中1例,该例相隔13个月的两次检测均为阳性.上述结果表明,M-FISH对于APL的诊断及其MRD的检测有重要应用价值,它虽不如RT-PCR敏感,但由于它能定量检测增殖细胞内的染色体易位,似比RT-PCR更能预测白血病的复发.     

实时荧光定量PCR检测PML-RARα融合基因的临床应用研究

目的 利用PML-RARα融合基因作为标志物,应用实时荧光定量PCR技术,监测急性早幼粒细胞白血病(APL)微小残留病(minimal residual disease,MRD)患者体内病毒的状态,探讨预测APL复发风险的方法.方法 利用本实验室建立的定量检测APL患者PML-RARα融合基因的方法,对25例处于初诊、完全缓解(complete remission,CR)、复发等不同阶段的APL患者进行了PML-RARα融合基因的定量检测,并对其中6例患者的MRD状态进行了动态监测.结果 应用荧光定量PCR技术分析患者初诊、CR和复发状态的PML-RARα基因对数值(lg)水平,结果 显示有统计学意义(x2=6.847,P＜0.05);随访期患者的PML-RARα对数值(lg)水平变化较大:初诊时较高(-0.61±0.79),CR时下降(-1.31±0.62),复发时又出现上升(-0.57±0.44),提示若该患者在CR时的对数值呈现上升趋势,患者复发的机率大.结论 应用实时荧光定量(RQ)-PCR技术定量检测PML-RARα融合基因,对监测APL患者MRD状态具有临床适用性,随访期的MRD动态追踪监测具有预后价值.     

实时定量RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARa融合基因

本研究旨在建立用实时定量RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病（APL）PML-RARa mRNA的方法,探讨APLPML-RARa融合基因表达水平与疗效的关系。用RT-PCR扩增培养的NB4细胞的PML-RARa融合基因,取1μgNB4细胞的总cDNA进行10倍的梯度稀释,作为标准品,建立荧光定量RT-PCR方法,对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行了测定。定量检测4例急性早幼粒细胞白血病（APL）患者治疗前后骨髓内PML-RARa融合基因转录本水平,并对1例经治疗完全缓解后又复发的患者PML-RARa转录本水平（拷贝数）进行动态监测。结果表明：用本研究建立的实时定量RT-PCR方法可检测出10-5μgNB4细胞cDNA中的PML-RARa融合基因,其重复性的CT值,管间、批间变异系数（CV）分别为2.1%、3.8%。4例患者初治骨髓PML-RARa基因转录本水平的分别为1884、5533、1803、4677拷贝,平均为3475拷贝。经ATRA＋化疗治疗后其PML-RARa基因转录水平下降至40、135、79、229拷贝,平均为121拷贝。还有1例患者治疗前PML-RARa基因转录本水平为8600拷贝,经过4个月治疗,虽然此时患者处于完全缓解期,但其转录水平拷贝数仍有730。3个月后患者出现复发,转录本水平升至为11000拷贝。经过ATRA＋化疗治疗后转录本水平又逐渐下降至1200拷贝。结论;建立的实时定量RT-PCR灵敏、重复性好。治疗后APL患者的PML-RARa融合基因转录本水平明显下降,复发时基因转录本水平又升高。融合基因表达水平的改变与临床疾病进展关系一致,这有助于监测白血病微小残留病,评价疗效及判断预后。     

PML／RARa融合基因检测在早幼粒细胞性白血病鉴别诊断中的意义

目的对MIC分型不髓确诊的早幼粒细胞性白血病进行鉴别诊断。方法应用筑巢式逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测PML／RARa融合基因。结果9例不能完全确诊的患者,5例PML／RARa阳性,另4例结合MIC分型与融合基因结果分别诊断为MDS,CIVIL,M2,M2复发。2倒长期完全缓解的APL患者,临床和遗传学达缓解,但1例融合基因仍然阳性。结论利用RT-PCR检测PML／RARa融台基因不但可以用来进行早幼粒细胞性白血病鉴别诊断,而且可以用来供临床选择治疗药物、预后判断、疗效观察以及微量残留白血病细胞检测。     

应用RT-PCR和荧光原位杂交监测急性早幼粒细胞白血病微小残留白血病

目的应用RT-PCR和荧光原位杂交技术(FISH)检测急性早幼粒细胞白血病(APL)患者体内PML-RARα融合基因的表达,监测患者体内微小残留白血病的情况。方法采用全反式维甲酸(ATRA)和三氧化二砷(As2O3)联合治疗APL,运用RT-PCR和FISH技术检测和分析APL患者体内诱导缓解后及巩固维持治疗后PML-RARα融合基因。结果 46例APL患者PML-RARα融合基因均为阳性,其中34例患者在诱导化疗结束达完全缓解后检测,25例(73.5%)患者基因检测呈阴性,9例(26.5%)患者RT-PCR和/或FISH检测阳性,融合基因阳性和阴性复发APL的预测值分别为44.4%和4.3%;31例再经ATRA及As2O3巩固及维持治疗后,27例患者达到分子生物学缓解,无复发病例,4例融合基因阳性患者,3例复发APL,其复发APL的阳性预测值为75%。结论 RT-PCR和FISH技术是非常有效的监测APL患者体内微小残留白血病的实验方法,其对疾病的诊断、治疗及预后评估具有重要临床价值。     

WT1基因在急性髓细胞性白血病微小残留病检测中的应用

目的探讨联合检测肾母细胞瘤基因1(WT1)和融合基因在急性髓细胞性白血病(AML)微小残留病(MRD)中的应用价值。方法收集2018年1月至2020年12月于该院确诊并完成RUNX1-RUNX1T1、早幼粒细胞白血病蛋白(PML)/视黄酸受体(RAR)α和WT1基因检测的伴重现性遗传学异常的AML患者。检测RUNX1-RUNX1T1、PML/RARα和WT1转录本水平,将RUNX1-RUNX1T1、PML/RARα融合基因转录本水平为0%看作融合基因阴性组,将RUNX1-RUNX1T1或PML/RARα融合基因转录本水平均不为0%看作融合基因阳性组。结果融合基因阴性组患者WT1转录本水平为0.096%(0.007%,1.990%),融合基因阳性组患者WT1转录本水平为1.420%(0.100%,60.340%),融合基因阴性组患者WT1转录本水平低于融合基因阳性组患者(P<0.05)。融合基因高表达组(融合基因转录本水平≥1%)患者融合基因转录本水平高于WT1转录本水平(P<0.05),融合基因低表达组(融合基因转录本水平<1%)患者WT1转录本水平高于融合基因转录本水平(P<0.05)。结论可联合检测融合基因和WT1,以此提高MRD的检测灵敏度。     

急性早幼粒细胞白血病患者PML/RARα融合基因首次转阴时间及其临床意义探讨

目的:为了观察和分析急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)PML/RARα融合基因首次转阴时间和首次转阴时间长短的临床意义。方法:选取我院初诊APL患者60例,按照APL临床路径行诱导缓解及缓解后巩固治疗和维持治疗;应用多重巢式PCR动态监测APL患者PML/RARα融合基因的表达水平变化,计算首次转阴时间,随访观察并评价首次转阴时间的临床意义。结果:除3例死亡和1例失访外,其余56例初诊APL患者经正规治疗后,其PML/RARα融合基因均在24至381 d之间首次转阴,平均首次转阴时间为(131±90)d。首次转阴时间在PML/RARα融合基因不同亚型之间存在差异,L型转阴时间较S型的短(P=0.032),而不同年龄、性别、危险度分层组别之间差异均无统计学意义。首次转阴后的56例患者分别随访25 d至1979 d,中位随访时间为946 d,其中1例133 d首次转阴患者维持3个月后转阳并且随后出现临床复发,其余55例患者均长期保持分子水平缓解。结论:初诊APL患者PML/RARα融合基因平均约在正规治疗后4个月首次转阴;不同基因亚型之间首次转阴时间存在差异。PML/RARα融合基因首次转阴时间可客观反映APL患者治疗后白血病细胞的消减水平,对临床治疗有提示作用,但不能作为判断预后的绝对依据;以PML/RARα融合基因动态监测微小残留病灶对分析APL复发具有重要的临床意义。     

实时定量荧光PCR检测白血病融合基因

本研究旨在建立实时定量荧光PCR的方法并检测CML、ALL、APL患者中融合基因的拷贝数,观察患者体内融合基因转录水平的变化。构建质粒标准品,制作标准曲线。检测49例患者的骨髓及外周血标本130份,对个别患者连续监测融合基因转录表达水平,结果表明：在82．4％（28／34）的CML患者中检测到BCR—ABL^p210阳性（BCR—ABLP210／ABL比值为0．01～3．19）,其中在1例CML急淋变患者检测到BCR—ABL^p210。和BCR—ABL^p190双阳性;在66．7％（4／6）的ALL患者中检测到BCR—ABL阳性,其中2例BCR—ABL^p210阳性,2例BCR—ABL^p190阳性;在77．8％（7／9）的APL患者中检测到PML—RARa融合基因阳性（PML—RARa／ABL比值为0．0014～3．199）,其中3例为长型,3例为短型,1例为变异型,检测结果为阴性的患者处于缓解期;连续监测患者融合基因转录表达水平与临床缓解和复发的变化情况相吻合。结论：实时定量荧光PCR技术成熟、操作简便,检测白血病融合基因结果准确稳定,对于临床明确诊断、具体分型、动态观测肿瘤负荷、选择治疗方案、评估治疗效果和预后都有较大价值,值得推广应用。     

实时定量聚合酶链反应在急性早幼粒细胞白血病融合基因检测中的临床应用

目的 比较不同类型的逆转录荧光实时定量聚合酶链反应（RQ-PCR）检测急性早幼粒细胞白血病（APL）PML-RARα融合基因的方法.方法 建立荧光染料SYBR Green Ⅰ和Eva GreenRQ-PCR技术,同时检测56例APL融合基因PML-RARα的表达水平,并且与传统巢式PCR方法进行敏感度比较.选择10例初诊患者随机分为两组,分别给予维甲酸（ATRA）加化疗或ATRA加三氧化二砷治疗.每3周抽取骨髓标本,检测治疗后PML-RARα表达的变化.结果 两种RQ-PCR的灵敏度均可达到50拷贝,稍低于巢式PCR,但RQ-PCR定量准确,不易污染.分别取10^3拷贝和10^7拷贝的PML-RARα质粒以及患者cDNA同时做8次SYBR-Green Ⅰ平行扩增,批内变异系数分别为7.31%、8.26%和5.02%.不同APL患者PML-RARα表达水平有较大差异,初诊患者PML-RARα/GAPDH比值介于0.018～0.799,中位值为0.070;使用这两种染料建立的RQ-PCR方法进行定量检测,荧光染料Eva-Green荧光强度高于SYBR GreenⅠ 4倍.对接受ATRA加化疗或ATRA加三氧化二砷治疗两种不同治疗方案的APL患者动态观察发现,2～4周PML-RARα转录本均迅速减少,2个月后80%PML-RARα转阴,但两种治疗方式无明显差异.结论 RQ-PCR可以准确检测微小残留病（MRD）融合基因表达水平;Eva Green和SYBR Green Ⅰ都可以用于RQ-PCR,但是Eva Green更敏感高效;监测融合基因表达可以有效观察不同治疗方法的治疗效果.     

实时定量RT-PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因方法的建立

目的 建立用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测急性早幼粒细胞白血病(APL)PML-RARα mRNA的方法.方法 制备目的基因PML-RARα的RNA标准品及管家基因β-actin的RNA标准品.然后将目的基因PML-RARα和管家基因β-actin的标准品梯度稀释作为模板进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线.利用成功构建的两个标准曲线测定APL患者的目的基因PML-RARα与管家基因β-actin的相对值,分析不同状态患者的微小残留病(MRD)水平是否有差别,从而指导临床的治疗.结果 用本研究建立的实时定量RT-PCR方法可检测出10～5 μg NB4细胞cDNA中的PML-RARα融合基因,其重复性的循环域值(Ct值),管间、批间变异系数(CV)分别为2.2%、4.0%.结论 本研究所建立的实时定量RT-PCR方法灵敏度高、重复性好.应用本法检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因表达水平的改变,有助于监测白血病微小残留病,评价疗效及判断预后.     

含PML/RARα（L型）与ABL双基因质粒标准品的制备及应用

目的建立一个含PML/RARα（L型）与ABL双基因质粒标准品,用于PML/RARαL型）的定量检测。方法从NB4细胞中提取总RNA并逆转录为cDNA,以此为模板,设计PML/RARα（L型）与ABL基因特异性引物进行PCR,PCR产物经琼脂糖电泳、胶回收、PCMV4载体克隆后转化DH5α工程菌,提取质粒进行酶切、测序鉴定,提取质粒用于制作荧光定量PCR标准曲线,同时对质粒的稳定性能进行评价。结果结果NB4细胞提取的总RNA完整性良好,构建的质粒经酶切鉴定后与目的条带一致,测序结果与目的片段几乎完全一致,且质粒的原始浓度为9×1012copies/ml,倍比稀释至9×104copies/ml,均能得到良好的标准曲线（R2≈1）,且质粒的稳定性好,提示含PML/RARa（L型）与ABL双基因荧光定量PCR质粒标准品构建成功。结论本研究建立了制备含PML/RARα（L型）与ABL双基因质粒标准品方法,并成功制备出稳定的含PML/RARα（L型）与ABL双基因质粒标准品。     

急性早幼粒细胞白血病PML维甲酸受体α融合基因定量检测的应用价值

目的探讨早幼粒细胞白血病PML维甲酸受体α融合基因(PML-RARα)定量检测在急性早幼粒细胞白血病诊断、治疗中的临床应用价值。方法采用实时定量聚合酶链反应对12例急性早幼粒细胞白血病患者初诊、治疗后完全缓解及复发时PML-RARα进行定量检测,分析不同阶段其变化程度,并与同阶段细胞形态学、染色体分析进行比较。结果 12例急性早幼粒细胞白血病患者初发时PML-RARα均为阳性,完全缓解阶段转为阴性或定量结果呈逐渐下降趋势,当复发时PML-RARα再次并早于细胞形态学和染色体分析出现阳性,且定量结果明显高于初发阶段。结论 PML-RARα定量检测可为急性早幼粒细胞白血病诊断、治疗及提示复发提供可靠的依据。     

改进的RT-PCR检测PML/RARα融合基因快速诊断急性早幼粒细胞白血病

在急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞中迅速、准确检出PMI/RARα融合基因对于及时应用全反式维甲酸(ATRA)或亚砷酸(As2O3)提高诱导缓解率、减轻出血导致的早期死亡至关重要，但目前临床上采用的嵌套式RT—PCR方法繁琐且费时，亟待改进以满足临床APL快速、准确诊断的需要。本研究采用TRIZOL快速提取高质量的细胞总RNA，随机引物反转录，热启动单轮PCR，适当控制MgCl2及引物浓度和Taq酶用量，4条引物，3个体系，相同循环参数，对40例初诊APL患骨髓标本同时扩增PML/RARα融合基因及内对照RARα。结果显示，40例APL患标本均扩增出特异条带，非APL标本无特异扩增产物；阳性扩增片段清晰易辩、断裂点类型易于确定，检测可在6小时内完成。结论：此改进的RT-PCR检测PML/RARα融合基因快速、特异、简便，完全满足临床对初诊APL诊断的需要。     

Ph+/bcr-abl+急性淋巴细胞白血病微小残留病变的细胞遗传学分析、巢式RT-PCR及流式细胞术检测

为了探索检测Ph^ ／bcr-abl^ 急性淋巴细胞白血病(ALL)患的微小残留病变(MRD)的简便而灵敏的方法，对84例初治ALL患和其中的缓解期患的骨髓分别用细胞遗传学、流式细胞术和巢式RT—PCR检测。结果表明，缓解期患骨髓中不存在Ph^ 染色体，巢式RT-PCR方法检测到1l／14例缓解期患存在MRD(bcr-abl融合基因)(阳性率78．57％)，而流式细胞术检测到5／14的缓解期患阳性(阳性率35．71％)。巢式PCR的灵敏度达到10^-6-10^-7水平，流式细胞检测的灵敏度达到10^-4-10^-5水平。结论：Ph染色体核型分析技术检测MRD不够灵敏，而巢式RT—PCR检测MRD较流式细胞技术检测灵敏度更高，且更易于开展应用。