虫草素通过下调TGF-β抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化

目的：探讨虫草素对高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响。方法：体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞株（NRK52E细胞株）,分为正常对照组（葡萄糖5.5 mmol/L,NG组）、高糖组（葡萄糖30 mmol/L,HG组）、高糖＋虫草素组（葡萄糖30 mmol/L＋虫草素10μg/ml,HG＋C组）。分别于刺激12 h,24 h,48 h后收集细胞。应用定量RT-PCR测定NRK52E TGF-β,E-cadherin,α-SMA mRNA的表达;Western印迹方法检测TGF-β、E-cadherin、α-SMA蛋白的表达。结果：高糖刺激后NRK52E细胞的TGF-β和α-SMA mRNA及蛋白表达明显高于正常糖组（P〈0.01）,而虫草素组TGF-β和α-SMA mRNA及蛋白表达显著低于高糖组（P〈0.05）;高糖诱导的NRK52E细胞E-cadherin mRNA及蛋白水平明显降低（P〈0.01）;而虫草素组NRK52E细胞E-cadherin mRNA及蛋白水平显著高于高糖组（P〈0.05）。结论：虫草素可以明显抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化,其机制可能是通过下调TGF-β实现。     

Smad7对高糖介导大鼠肾小管上皮细胞转分化和胶原I合成的影响

目的探讨Smad7对高糖介导肾小管上皮细胞转分化和胶原（Col）I合成的影响。方法体外培养转染Smad7的大鼠近端肾小管上皮细胞株（NRK52E细胞），分为强力霉素（Dox）诱导组和未加强力霉素的对照组。前者予Dox诱导24h后，给予高糖刺激；后者不加Dox诱导。采用免疫细胞化学方法检测磷酸化（p）-Smad2／3核转位情况；RT-PCR检测Smad7的表达；Western印迹方法检测不同时间点Smad7、α-SMA、E-钙黏蛋白（cadherin）和Col I蛋白的表达水平。结果成功构建了Dox调控的可上调Smad7表达的NRK52E细胞。NRK52E细胞在基础状态下可表达低水平p-Smad2／3（16．1％），与未加Dox的对照组比较，Dox诱导组可显著抑制高糖刺激的NRK52E细胞TGF-β受体调控信号蛋白Smad2／3的活化和核转位（30.3％比58．5％，P〈0．01）。上调表达Smad7可显著抑制高糖介导的NRK52E细胞α-SMA和Col I蛋白的表达；逆转高糖介导的NRK52E细胞E-cadherin蛋白的下调表达。结论基因转染上调表达Smad7可通过TGF-β受体调控信号蛋白Smad2／3的活化和核转位而阻抑高糖介导的肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质的合成。     

黄芪通过c-met调控TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化

AB 目的：探讨黄芪对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质分泌的作用及机制。方法：体外培养正常大鼠肾小管上皮细胞（NRK52E）,应用倒置相差显微镜观察NRK52E细胞形态学变化;免疫组织化学染色法及实时荧光定量PCR法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,肝细胞生长因子HGF受体（c-met）的表达;ELISA法定量检测细胞上清液中胶原Ⅰ（Col-Ⅰ）,胶原Ⅲ（Col-Ⅲ）和纤维黏连蛋白（FN）的水平。结果：TGF-β1可诱导肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化（TEMT）,TGF-β1诱导组细胞肥大、拉长,呈长梭形,α-SMA表达明显增强,Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN分泌增加（P〈0.05）。加入不同浓度黄芪后,细胞形态接近正常肾小管上皮细胞形态,α-SMA表达、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN分泌均较TGF-β1诱导组明显抑制（P〈0.05）,c-met表达较TGF-β1诱导组增加（P〈0.05）且呈剂量依赖性。结论：TGF-β1可以诱导肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化,增加细胞外基质成分Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和FN的分泌;黄芪能够抑制TGF-β1诱导的NRK52E细胞转分化以及细胞外基质的分泌;黄芪抑制细胞转分化的机制可能与其增强c-met的表达有关。     

Par-3蛋白在转化生长因子?茁1介导的大鼠肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的 观察转化生长因子（TGF)β1诱导的正常大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E）转分化（EMT）过程中细胞极性蛋白Par-3的表达及上调Par-3蛋白表达对TGF-β1诱导NRK52E细胞转分化进程的影响。 方法 应用TGF-β1 (10 μg/L)刺激NRK52E细胞，采用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光方法分别检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Par-3 mRNA和蛋白的表达；应用Lipofectmine 2000将pKH3-HA-Par-3质粒瞬时转染NEK52E细胞，采用Western印迹观察上调表达Par-3对上述指标的影响。 结果 TGF-β1刺激后，NRK52E细胞α-SMA蛋白和mRNA水平上调，E-cadherin蛋白和mRNA的表达下调；Par-3蛋白表达呈时间依赖模式下调，72 h TGF-β1刺激组与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。但Par-3 mRNA水平在各时间点差异均无统计学意义（P > 0.05）。脂质体转染外源性质粒pKH3-HA-Par-3上调表达Par-3可显著抑制TGF-β1诱导NRK52E细胞α-SMA蛋白的上调表达；逆转E-cadherin蛋白的下调表达。 结论 在TGF-β1诱导NRK52E细胞转分化进程中细胞极性Par-3蛋白表达下调，基因转染上调表达Par-3可部分减轻EMT的程度，提示Par-3蛋白在TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和肾脏纤维化中可发挥保护性作用。     

Erbin在肾间质纤维化中的表达和作用

目的 探讨Erbin在肾脏间质纤维化中表达量的变化及上调Erbin对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E）转分化的影响。 方法 体内实验采用SD大鼠5/6肾切除法建立肾纤维化动物模型,收集并检测各组血清中Scr、BUN水平;Masson染色观察肾间质纤维化程度;免疫组化及Western印迹检测Erbin的分布与表达。 体外实验采用TGF-β1（10 μg/L）刺激NRK52E细胞72 h建立上皮细胞-间充质转分化（EMT）细胞模型;免疫荧光及Western印迹法检测E钙黏蛋白（E-cadherin）和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达变化;RT-PCR及Western 印迹法检测Erbin的表达变化。用脂质体2000将质粒 Prk5-myc-Erbin瞬时转染至NRK52E细胞,Western印迹法观察上调Erbin表达后对上述各种指标的影响。 结果 （1）假手术组大鼠肾功能正常[Scr（33.96±7.28） μmol/L、BUN（8.11±2.55） mmol/L],Masson染色未见肾间质纤维化,Erbin在肾小管表达较少;模型组大鼠Scr [（140.52±61.11） μmol/L]、BUN[（34.23±7.66） mmol/L] 均显著高于假手术组（均P < 0.05）,肾间质可见明显纤维化,Erbin 在肾小管表达也明显增加,是假手术组的2.9倍（P < 0.01）。（2）正常NRK52E 细胞表达E-cadherin,少量表达Erbin和α-SMA。TGF-β1刺激后,NRK52E细胞E-cadherin表达显著减少,Erbin和α-SMA则表达增加（均P < 0.05）;而转染质粒Prk5-myc-Erbin可逆转TGF-β1诱导的NRK52E细胞E-cadherin表达下调,并可抑制α-SMA表达上调（均P < 0.05）。 结论 Erbin在肾间质纤维化中表达增加,上调Erbin表达可抑制TGF-β1诱导NRK52E发生EMT, 提示Erbin在肾脏纤维化中可发挥保护作用。     

红细胞生成素对高糖诱导肾小管细胞凋亡的影响

目的 探讨红细胞生成素（EPO）是否可以抑制高糖诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞凋亡及其相关机制。 方法 传代培养大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK-52E）,分为正常对照组（NC组）、渗透浓度对照组（OC组）、高糖组（HG组）、高糖+EPO 50 U/ml组（E1组）和高糖+EPO 100 U/ml组（E2组）。免疫荧光检测NRK-52E细胞有无EPO受体（EPOR）表达。Western印迹检测高糖对EPOR表达的影响。流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡指数。荧光探针CM-H2DCFDA检测细胞内活性氧（ROS）的水平。RT-PCR检测bcl-2、bax、capases-3 mRNA的表达。 结果 （1）NRK-52E细胞表达EPOR,且高糖可刺激EPOR表达增加。（2）高糖可诱导NRK-52E细胞凋亡,与葡萄糖相同渗透浓度的甘露醇不能明显诱导细胞凋亡。E1、E2组细胞早、晚期凋亡率显著低于HG组（P < 0.05）。（3）高糖刺激 NRK-52E细胞后,细胞内ROS产生增多,bcl-2 mRNA的表达下调,bax、caspase-3 mRNA的表达上调。EPO可以抑制细胞内ROS的产生,上调bcl-2 mRNA 表达,下调bax、caspase-3 mRNA 表达。 结论 EPO可能通过EPOR的介导,缓解高糖诱导的氧化应激,上调bcl-2 mRNA表达,下调bax、caspase-3 mRNA表达,抑制NRK-52E细胞凋亡。     

高糖环境下舒洛地特对大鼠近端肾小管上皮细胞增殖及细胞间黏附分子1表达的影响

目的探讨舒洛地特对高糖培养的大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E）增殖和细胞间黏附分子1（ICAM-1）表达的影响。方法将NRK52E细胞用5．6mmol／L葡萄糖（NG组）、25mmol／L葡萄糖（HG组）、25mmol／L葡萄糖联合不同浓度舒洛地特（终浓度分别为0．5LRU／ml、1．0LRU／ml、2LRU／ml）于96孔板中分别培养24h、48h、72h后,运用MTT法测定细胞增殖变化。24h后,运用RT-PCR和Western blotting方法检测ICAM-1mRNA和蛋白质的表达。结果HG组细胞增殖及ICAM-1的表达均增强,舒洛地特组能抑制这种趋势并且呈剂量依赖性。结论舒洛地特能通过减少ICAM-1的表达而起到保护肾脏的作用。     

Smad7对高糖介导大鼠肾小管上皮细胞转分化和胶原Ⅰ合成的影响

目的探讨Smad7对高糖介导肾小管上皮细胞转分化和胶原(Col)Ⅰ合成的影响。方法体外培养转染Smad7的大鼠近端肾小管上皮细胞株(NRK52E细胞),分为强力霉素(Dox)诱导组和未加强力霉素的对照组。前者予Dox诱导24 h后,给予高糖刺激;后者不加Dox诱导。采用免疫细胞化学方法检测磷酸化(p)-Smad2/3核转位情况;RT-PCR检测Smad7的表达;Western印迹方法检测不同时间点Smad7、α-SMA、E-钙黏蛋白(cadherin)和ColⅠ蛋白的表达水平。结果成功构建了Dox调控的可上调Smad7表达的NRK52E细胞。NRK52E细胞在基础状态下可表达低水平p-Smad2/3(16．1％),与未加Dox的对照组比较,Dox诱导组可显著抑制高糖刺激的NRK52E细胞TGF-β受体调控信号蛋白Smad2/3的活化和核转位(30．3％比58．5％, P<0．01)。上调表达Smad7可显著抑制高糖介导的NRK52E细胞α-SMA和ColⅠ蛋白的表达;逆转高糖介导的NRK52E细胞E-cadherin蛋白的下调表达。结论基因转染上调表达Smad7可通过TGF-β受体调控信号蛋白Smad2/3的活化和核转位而阻抑高糖介导的肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质的合成。     

血管内皮生长因子C参与肾间质纤维化的进程

目的探讨血管内皮生长因子C（VEGF-C）在大鼠。肾小管上皮细胞向间充质细胞转化（EMT）过程中的变化及其作用通路,并利用动物模型研究血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂替米沙坦对VEGF-C的影响,从而探讨VEGF-C在肾间质纤维化中的作用。方法体外培养大鼠肾小管上皮细胞（NRK52E）,用转化生长因子B1（TGF-β1）孵育不同时间,观察其对VEGF-C、上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、磷酸化AKT（P-AKT）等表达的影响,并在TGF-131作用同时加入PBK抑制剂Wortmannin,观察上述指标的变化;用单侧输尿管结扎术（UUO）制作SD大鼠肾间质纤维化模型,将21只大鼠随机分为假手术组、模型组和替米沙坦治疗组,每组7只。2周后,用免疫组织化学法检测α平滑肌肌动蛋白（mSMA）及VEGF-C在肾组织的分布,用RT-PCR和Westernblot—ring法检测其mRNA和蛋白表达。结果TGF-β1促进EMT的同时促进VEGF-C的表达增加。加入Wortmannin后EMT被抑制,同时VEGF-C的表达减低。动物模型组α-SMA和VEGF-C表达较假手术组高,替米沙坦治疗组α-SMA和VEGF-C表达较模型组低。结论TGF-β1可通过P13K—AKT通路促进VEGF-C的表达,VEGF-C与α-SMA的变化有同步性,提示VEGF-C可能参与肾间质纤维化的进程。     

白蛋白刺激肾小管上皮细胞表达基质金属蛋白酶2和9

目的探讨白蛋白对近端肾小管上皮细胞表达基质金属蛋白酶2（MMP-2）和MMP-9的影响。方法大鼠近端肾小管细胞株NRK52E培养至70％或100％融合时，分别给予不同浓度（0．1～1．0g／L）去脂和非去脂牛血清白蛋白（dBSA和BSA）刺激，于24、48、72h收集培养液，用明胶酶谱和Western印迹方法检测培养液MMP-2和MMP-9活性和蛋白水平。结果与空白对照组比较，1．0g／LBSA刺激未完全融合NRK52E72h后，MMP-2和MMP-9活性分别上调276％、176％（P〈0．05）。与刺激24h比较，1．0g／LBSA刺激72h，在未完全融合NRK52E的MMP-2和MMP-9活性分别上调536％、148％；在完全融合NRK52E分别上调212％、184％（P〈0．05）。与完全融合NRK52E比较，1．0g／LBSA刺激未完全融合NRK52E 72h，MMP-2活性上调增加了274％，MMP-9活性上调减少了45．1％（P〈0．05）。dBSA刺激结果与BSA类似。结论白蛋白刺激呈剂量和时间依赖性上调近端肾小管细胞表达MMP-2和MMP-9。细胞完全融合可抑制MMP-2表达，促进MMP-9表达。     

Role of P311 in interleukin-1α-induced epithelial to myofibroblast transition in kidney tubular epithelial cells

Abstract

Tubular epithelial-myofibroblast transition (TEMT) is an important process in renal tubulointerstitial fibrosis. Interleukin-1α (IL-1α) and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) have been demonstrated to be key inducers of TEMT. In mouse embryonic fibroblast cells (NIH3T3), P311 protein induces phenotypic changes that are consistent to myofibroblast transformation. In the present study, we investigated the role of P311 gene and protein as well as potential mechanisms underlying TEMT in normal rat kidney tubular epithelial cells (NRK52E). Morphological and molecular changes were determined in NRK52E cells that were treated with IL-1α and/or P311 antibodies. The results showed that the NRK52E cells triggered by IL-1α became fibroblast-like cells, exhibiting hypertrophy of elongated and fusiform-shaped cells. IL-1α induced a time-dependent increase in P311 gene expression in NRK52E cells, with a peak time at 4 days. The expression levels of P311 gene were positively correlated with α-SMA and TGF-β1 gene expression levels. Anti-P311 antibody inhibited P311 and α-SMA expression in the presence of IL-1α. In contrast, anti-P311 antibody increased the expression of TGF-β1 gene in cells cultured with IL-1α. Therefore, P311 gene, together with α-SMA and TGF-β1 genes, was induced in the process of TEMT. P311 protein triggered by interleukin-1α may promote TEMT through a TGF-β1-independent pathway.     

肿瘤坏死因子α对脂多糖诱导的肝星状细胞表达结缔组织生长因子的影响

目的 观察脂多糖(LPS)体外作用于大鼠肝星状细胞(HSC)时肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和结缔组织生长因子(CTGF)表达变化,探讨TNF-α对LPS诱导的HSC中CTGF表达的影响.方法 用一步密度梯度离心法分离大鼠HSC,体外培养LPS处理HSC,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测不同LPS浓度处理的HSC CTGF mRNA表达水平,并用ELISA双抗体夹心法测定TNF-α浓度.结果 TNF-α水平随LPS浓度增加而增加,LPS可上调CTGF mRNA的表达,TNF-α浓度及CTGF mRNA表达水平呈一定的平行关系.结论 LPS可上调HSC中CTGF mRNA表达,该过程可能是通过TNF-α介导的.     

血管紧张素Ⅱ通过TLR4-MyD88途径诱导大鼠肾小管上皮细胞炎性因子释放

目的 观察血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激肾小管上皮细胞（NRK-52E）后肿瘤坏死因子α（TNF-α）和热休克蛋白47（HSP47）的表达,分析Toll样受体4（TLR4）信号通路的变化与上述因子的关联,探讨AngⅡ促进NRK-52E细胞炎性反应、纤维化的天然免疫机制。 方法 细胞同步化后,将其分为4组：对照组、AngⅡ（10-7 mmol/L）组、坎地沙坦（10-5 mmol/L）+AngⅡ组、TLR4阻断剂（20 mg/L）+AngⅡ组,培养6 h后RT-PCR法检测TLR4及转接信号髓分化因子88（MyD88）mRNA表达水平;12 h后免疫荧光法检测细胞表面TLR4蛋白表达;24 h后以ELISA法检测细胞上清液TNF-α及HSP47的浓度。 结果 与对照组相比,AngⅡ显著上调NRK-52E细胞 TLR4、MyD88 mRNA和TLR4蛋白表达（均P < 0.01）,并诱导细胞TNF-α和HSP47的释放（均P < 0.01）。与AngⅡ组相比,TLR4阻断剂和坎地沙坦干预均显著抑制 AngⅡ对细胞TLR4、MyD88的刺激效应（均P < 0.01）;坎地沙坦抑制AngⅡ诱导的细胞 TNF-α、HSP47的释放（均P < 0.01）,TLR4阻断剂对细胞 TNF-α、HSP47的下调呈剂量依赖性。 结论 AngⅡ对NRK-52E细胞天然免疫信号TLR4、MyD88具有激活效应,该信号激活可能是AngⅡ促进肾小管细胞炎性相关因子释放的重要机制之一。坎地沙坦抑制肾小管细胞炎性因子的体外效应也与其调节该信号通路有关。     

吡咯烷二硫代氨基甲酸盐增强肿瘤坏死因子α诱导人胃癌细胞株SGC-7901凋亡作用的研究

目的研究核转录因子-κb（NF—κb）抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）对肿瘤坏死因子α（TNF—α）诱导的人胃癌细胞株SGC-7901生长抑制及凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法应用噻唑蓝（MTr）法检测不同浓度的PDTC和TNF-α以及两者联合应用对SGC-7901细胞增殖的抑制率：采用Hoechst检测SGC-7901细胞凋亡情况：Westernblot检测SGC-7901细胞survivin和easpase-3蛋白的表达。结果PDTC在15、30、60和100μmol／L浓度时．对SGC-7901的细胞生长抑制率分别为（12．14±0．91）％、（20．00±1．11）％、（37．63±1．01）％和（41.46±1．07）％．均可抑制细胞增殖（P〈0．01）。TNF-α为25mg／L时,对SGC．7901细胞的生长抑制率为（2．38±0．67）％,与对照组（1．50±0．81）％相比,差异无统计学意义（F=28．28,P〉0．05）：而在50、100和150mg／L浓度时,对SGC-7901细胞的生长抑制率分别为（4．53±0．85）％、（4．43±0．70）％和（4．74±1．07）％,与对照组相比,差异有统计学意义（P〈0．05）。PDTC15μmol／L分别与25、50、100和150mg／L的TNF．仅联合应用时,对SGC-7901的细胞生长抑制率则分别为（18．94±1．10）％、（30．23±0．89）％、（41．55±0．94）％和（53．34±0．98）％,与单用TNF—α或单用15μmol／LPDTC比较,细胞生长抑制率增加（P〈0．01）。Hoechst检测结果显示,TNF-α100mg／L组、PDTC15μmol／L组及两者联合应用组细胞凋亡率均显著增加（P〈0．01）,且联合用药组细胞凋亡率增高最为显著（P〈0．01）。PDTC（15μmol／L）与TNF-α（100mg／L）联合用药与单用TNF—α（100mg／L）比较,细胞survivin蛋白表达明显降低（P〈0．01）,与单用PDTC（15μmol／L）比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;但caspase-3蛋白的表达联合用药组较两者分别单用时显著增加（P〈0．01）。结论PDTC可增强TNF-α对人SGC-7901细胞的促凋亡作用,其机制可能与PDTC阻断TNF-α诱导的NF—κb活性、下调survivin表达并最终上调凋亡蛋白easpase-3的表达有关。     

Protective mechanism of NALP3?siRNA on rat renal tubular epithelial cells from hypoxia/ reoxygenation injury

Objective To explore the mechanism of protecting cells from hypoxia/reoxygenation (H/R) injury by constructing specific small interference RNA (siRNA) to inhibit NALP3 expression in rat renal tubular epithelial cells (NRK?52E). Methods (1) To establish the H/R injury model of NRK?52E by regulating the pressure of N2 in incubator to hypoxia condition, the cells were cultured with hypoxia for 1 h and then with reoxygenation for 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 16 h and 24 h. The activity of lactae dehydrogenase (LDH) in the culture medium, cell count and cell viability, the expression of NALP3 were determined by biochemical method, trypan blue exclusion and Western blotting. (2) The siRNA was transfected into NRK?52E. The irrespective siRNA transfected group was used as control. NALP3 expression was examined by Western blotting. (3) The cells were divided into 4 groups: control group, H/R group, irrespective siRNA transfected group and NALP3?siRNA transfected group. To establish the H/R injury model of NRK?52E by regulating the pressure of N2 in incubator to hypoxia condition, the cells were cultured with hypoxia for 1 h and then with reoxygenation for 4 h. And the expression of NALP3 was determined by Western blotting. (4)Cellular apoptosis was examined by Annexin V/PI staining and flow cytometry. NF?κB DNA binding activity, IκB?α, Bcl?2 and Bax expression were examined by EMSA and Western blotting. Results (1)Compared with the control group, the activity of LDH significantly increased, cell count and cell viability significantly decreased (all P<0.05). The expression of NALP3 significantly increased and peaked at 4 h after H/R. (2)The specific siRNA could efficiently inhibit NALP3 expression in NRK?52E. Compared with the irrespective siRNA transfected group, the protein expression of NALP3 was significantly down?regulated in NALP3 siRNA transfected group (P<0.05). (3)After hypoxia 1 h and reoxygenation 4 h, the activity of LDH and the expression of NALP3 increased. Compared with the irrespective siRNA transfected group, LDH concentration in media and the expression of NALP3 significantly decreased in NALP3?siRNA transfected group. (4)After hypoxia 1 h and reoxygenation 4 h, NF?κB DNA binding activity was increased, IκB?α phosphorylation and degradation, Bcl?2 and Bax were significantly up?regulated. However, compared with the irrespective siRNA transfected group , NF?κB DNA binding activity, IκB?α degradation and Bax/Bcl?2 were significantly decreased (P<0.05) in NALP3?siRNA transfected group. At the same time, the ratio of apoptosis was significantly increased in three groups than that in control. Compared with the irrespective siRNA transfected group, the ratio of apoptosis in NALP3?siRNA transfected group was significantly decreased (P<0.05). Conclusions H/R induces the expression of NALP3 in NRK?52E. The synthesized siRNA can inhibit the expression of NALP3 and protect NRK?52E from hypoxia/reoxygenation injury. The mechanism may be via inhibiting the activation of NF?κB, modulating expression of Bcl?2 and Bax, as well as decreasing cell apoptosis.     

囊泡型H+-ATP酶B亚基在转化生长因子β1致肾小管上皮细胞转分化中的变化及其意义

目的 探讨在转化生长因子（TGF）β1致大鼠肾小管上皮细胞（NRK52E）发生上皮细胞向间质细胞转分化（EMT）过程中囊泡型H+-ATP酶（V-ATPase）B亚基的变化及其可能意义。 方法 NRK52E细胞无血清培养后予TGF-β1（10 μg/L）刺激不同时间（0、6、12、24、48、72 h）,应用实时定量PCR、Western印迹、免疫荧光技术检测?琢平滑肌肌动蛋白（?琢-SMA）、E钙黏素（E-cadherin）、V-ATPase B亚基（B1、B2）mRNA、蛋白表达及分布的变化。 结果 TGF-β1刺激NRK52E细胞48 h后?琢-SMA mRNA及蛋白表达显著上调,E-cadherin mRNA及蛋白表达显著下调,同时V-ATPase B2亚基mRNA及蛋白表达也显著增加（均P < 0.05）。但是B1亚基在细胞内表达很低,刺激后也未见显著变化。免疫荧光也显示V-ATPase B2亚基在细胞内的分布明显增加并向胞膜聚集。 结论 在NRK52E内主要分布的是V-ATPase B2亚基。TGF-β1刺激NRK52E EMT过程中V-ATPase B2亚基表达显著增加,这提示B2亚基可能参与肾小管EMT过程。     

Numb基因在大鼠肾小管上皮细胞转分化过程中的作用

目的 探讨Numb在大鼠肾小管上皮细胞转分化过程中的作用。 方法 重组人转化生长因子β1（TGF-β1）刺激大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E细胞),不同浓度TGF-β1 （0、1、5、10、15、20 μg/L）作用48 h与TGF-β1 10 μg/L作用不同时间(0、24、48、72 h)后,采用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光染色分别检测NRK52E细胞内E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Numb 的表达。采用RNA干扰技术下调Numb表达,Western印迹观察改变Numb水平对E-cadherin、α-SMA蛋白水平的影响。 结果 TGF-β1以剂量及时间依赖的方式诱导NRK52E细胞E-cadherin 蛋白表达下调,α-SMA 蛋白表达增高。Numb蛋白的表达随TGF-β1浓度的增加而增高,在5、10、15和20 μg/L时分别为0 μg/L时的1.33倍（P = 0.024)、1.39倍（P = 0.035）、1.45倍（P = 0.025）和1.51倍（P = 0.000)。而Numb蛋白和mRNA的表达亦随TGF-β1作用时间的延长而增高,作用24 h、48 h、72 h,Numb蛋白分别为0 h的1.48倍（P = 0.046)、1.54倍（P = 0.011）、1.79倍（P = 0.028）,Numb mRNA分别为0 h的1.56倍（P = 0.012)、1.82倍（P = 0.008）、1.82倍（P = 0.002）;同时Numb的分布也发生了改变,大量聚集在胞质中。下调Numb表达可以显著抑制TGF-β1诱导的α-SMA表达上调（为Numb表达正常时的18.1%,P = 0.004）、E-cadherin表达下调（为Numb表达正常时的2.19倍,P = 0.004）。 结论 Numb可以促进肾小管上皮细胞发生转分化。     

Protective effects of adipose-derived stem cells with phosphodiesterase 5 inhibition by lentivirus-mediated stable gene silencing on ischemia-reperfusion injury of renal tubular epithelial cells

Objective To explore the protective effects of adipose-derived stem cells (ADSCs) with phosphodiesterase 5 inhibition by lentivirus-mediated stable gene silencing on the proliferation and apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by ischemia-reperfusion injury in vitro. Methods To isolate cultivate and indentify ADSCs from rats. Lentiviral expression vector of carrying PDE5 shRNA gene was transfected into ADSCs, and a negative control group was set up．Western blotting was used to detect PDE5 protein expression levels. ADSCs were co-cultured with NRK-52E in a transwell system, and NRK-52E cells were treated with ischemia/reoxygenation protocol. Edu assay was performed to evaluate the proliferation of NRK cells, flow cytometry to detect the apoptosis of NRK cells, and ELISA to quantify the protein expressions of fibroblast growth factor (FGF) and hepatocyte growth factor (HGF). The expression of E-cadherin and cytokeratin 18 (CK18) was quantified by real time PCR and flow cytometry. Results Western blotting for PDE5 protein indicated a significant reduction of PDE5 protein levels in PDE5 shRNA transduced population. After the treatment of ischemia/reoxygenation in vitro, the proliferative viability and apoptosis of NRK-52E cells co-cultured with ADSCs induced by PDE5 gene inhibition were significantly improved, compared to the normal group (all P＜0.05). And the release of HGF, FGF were markedly enhanced (all P＜0.05). Moreover, the NRK-52E cells survival, the expression of E-cadherin and CK18 on PDE5 inhibited ADSCs co-cultured with I/R injured NRK cells was significantly increased compared to that in the negative control group (all P＜0.05). Conclusion ADSCs preconditioned by inhibition of PDE5 can be a powerful novel approach to improve the survival of renal tubular cells following ischemia-reperfusion injury, and have an obvious tendency to transform epithelial cells.