胰蛋白酶法和Triton—X100法去除瓣膜细胞的效果比较

目的比较胰蛋白酶法和Triton—X100法去除异种或同种心脏瓣膜上细胞的效果。方法选取新鲜猪主动脉瓣膜片分别置入0．05％胰酶溶液和0．25％Triton-X100溶液中处理48h，并以未经处理的新鲜瓣膜片作对照，行光镜及电镜观察．并作热皱缩温度、断裂强度和断裂拉伸率测定。结果光镜和电镜下均显示，胰酶法和Triton-X100法均彻底去除了主动脉瓣膜上的细胞成分，但Triton—X100法对瓣膜支架结构的损伤较大。热皱缩温度、断裂强度和断裂拉伸率在新鲜瓣膜组和胰酶组间无显著性差异，但Triton—X100组与新鲜瓣膜组及胰酶组相比均有下降。结论胰酶法去除猪主动脉瓣膜细胞彻底．保持了瓣叶支架结构，优于Triton—X100法。     

三种去细胞方法构建的猪主动脉瓣膜支架的性能比较

目的:评价不同去细胞方法制备的猪主动脉瓣支架的组织学、生物力学特性及组织相容性,寻找更合适的去细胞心脏瓣膜支架制备方法.方法:分别采用3种不同的去细胞方法对新鲜猪主动脉瓣叶及带瓣主动脉管道进行脱细胞处理:0.01%胰蛋白酶 1%Triton 核酸酶组用含有0.01%胰蛋白酶-1%Triton和核酸酶的去细胞溶液37℃持续震荡24 h;0.01%胰蛋白酶8 h 1%脱氧胆酸(DCA) 核酸酶组先用 0.01%胰蛋白酶37℃持续震荡消化处理8 h,终止胰酶后加入含有1?A和核酸酶的去细胞溶液37℃持续震荡24 h;1?A 核酸酶32 h组:用含有1?A和核酸酶的去细胞溶液37℃持续震荡32 h;同时以PBS漂洗的新鲜瓣叶作为对照组.通过H-E染色、扫描电镜和透射电镜观察评价去细胞效果.测定瓣叶弹性模量、最大抗张强度、应力伸长比及断裂伸长比以评价各组瓣叶的生物力学特性.大鼠皮下包埋实验评价去细胞支架的免疫源性、体内炎性反应及改建情况.结果:0.01%胰蛋白酶8 h 1?A 核酸酶组细胞去除完全,优于0.01%胰蛋白酶 1%Triton 核酸酶组和1?A 核酸酶32 h组.所制备瓣膜支架的弹性模量及最大抗张强度大于0.01%胰蛋白酶 1%Triton 核酸酶组.应力伸长比及断裂伸长比则小于0.01%胰蛋白酶 1%Triton 核酸酶组,与新鲜瓣叶无明显差异.体内埋植实验炎症反应轻微,宿主成纤维细胞能够长入支架并对其进行改建.结论:短时间低浓度胰蛋白酶与1?A和核酸酶相结合的去细胞法方便有效,既能完全去除猪带瓣主动脉管道的细胞成分,使免疫源性显著下降;同时瓣叶的生物力学特性保持稳定,可为受体细胞化组织工程心脏瓣膜的提供可靠的支架材料.     

去细胞猪主动脉瓣膜支架的生物学特性

目的探讨以Triton-X100、脱氧胆酸钠和核酸酶去细胞后的组织工程心脏瓣膜支架的生物学特性。方法经Triton-X100、脱氧胆酸钠和核酸酶处理新鲜猪主动脉瓣膜,去除内皮细胞和间质细胞,常规苏木精伊红染色,电子扫描显微镜检查,评价去细胞效果,并检测去细胞瓣叶的力学特性、可溶性蛋白含量、同时行兔皮下包埋实验,观察其免疫反应性。结果Triton-X100、脱氧胆酸钠和核酸酶能有效去除细胞成分,获得组织工程心脏瓣膜支架。去细胞瓣叶与新鲜瓣叶有相同的拉伸强度-拉伸率曲线。可溶性蛋白含量明显降低,去细胞瓣叶的免疫反应性明显降低。结论经Triton-X100、脱氧胆酸钠和核酸酶去细胞处理的猪主动脉瓣膜可以做为组织工程瓣膜支架。     

猪主动脉组织工程瓣膜制备的初步研究

目的：初步探索猪主动脉组织工程瓣膜的制备方法。方法：经胰酶－EDTA、表面活性剂、核酸酶处理，去除猪主动脉瓣的细胞成分，测定瓣叶去细胞前、后的生物力学特性，并在其表面种植BAECs。结果：猪主动脉瓣膜中的细胞成分能完全被去除，获得完整无细胞的纤维网状支架，瓣叶去细胞前、后的断裂强度和断裂伸长率无明显变化，瓣膜近端存留的主动脉壁中的细胞一半被去除；种植的BAECs在去细胞瓣膜表面、主动脉内膜形成一连续的细胞层。结论：猪主动脉瓣膜去细胞后获得的纤维支架适宜血管内皮细胞的生长，可以用来构建组织工程瓣膜。     

直接染色法观察组织工程心脏瓣膜构建中种植细胞的生长

为了快速观察组织工程心脏瓣膜构建中种植细胞的生长状况，采用去细胞猪主动脉瓣叶为支架，将新生牛主动脉内皮细胞种植于其上，第3、7天取瓣叶行H－E直接染色，并以常规切片H－E染色和扫描电镜作为对照。结果发现，该3种方法观察所见细胞第3、7天的生长疏密状况基本同步。提示，瓣叶H－E直接染色可方便快捷地观察种植细胞的生长状况。     

骨髓间充质干细胞和猪去细胞瓣膜支架构建组织工程瓣膜

目的 探讨运用组织工程技术以骨髓间充质干细胞和去细胞猪心脏瓣膜支架构建组织工程心脏瓣膜的方法.方法 体外培养、扩增自体骨髓间充质干细胞并鉴定,接种于以曲拉通-脱氧胆酸钠、RnaseⅠ和DnaseⅠ去细胞的猪心脏瓣膜支架上,形成细胞材料复合物,体外培养7 d,将该复合物移植于裸鼠腹腔,4周后行组织学检测.结果 骨髓间充质干细胞具有与成纤维细胞相似的生物学特性,表达ASMA,Vimentin抗原,去细胞瓣膜去细胞彻底,骨髓间充质干细胞可在支架表面良好生长,形成表面光滑的细胞层,分泌细胞外基质,生长好.在裸鼠体内可继续扩增,形成多层细胞.结论 运用组织工程技术以骨髓间充质干细胞和去细胞猪心脏瓣膜可生成初级组织工程瓣膜.     

不同方法脱猪主动脉瓣细胞效果比较

目的:比较不同脱细胞方法处理猪主动脉瓣叶的效果,探讨组织工程心脏瓣膜生物支架的最佳制备方法.方法:取猪主动脉瓣膜,消毒后随机分组.Ⅰ组瓣叶不做处理,作为对照组.Ⅱ组Triton X-100、核酸酶(DNaseⅠ、RNase Ⅰ)处理.Ⅲ组采用低浓度胰蛋白酶、EDTA、核酸酶、DCA处理.Ⅳ组用DCA、核酸酶处理.对各组脱细胞瓣叶进行大体、光镜、电镜观察及理化检测.结果:Ⅳ组方法不可完全去除细胞成分,Ⅱ、Ⅲ组方法可完全去除细胞成分,但Ⅱ组瓣叶原有的超微结构有所改变.结论:低浓度胰蛋白酶、EDTA、核酸酶、DCA联合应用是理想的组织工程心脏瓣膜生物支架制备方法.     

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽固定去细胞瓣构建组织工程瓣膜的实验研究

目的：研究促黏附分子精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽对去细胞瓣组织工程心脏瓣膜（TEHV）构建的影响：方法：酶＋去污剂法制备去细胞瓣天然支架，应用化学交联剂Sulfo-LC-SPDP，使GRGDSPC肽与之稳定纳合，然后表面种植大鼠肌成纤维细胞以构建TEHV文验组采用GRGDSPC肽固定去细胞瓣，对照组则为未处理去细胞瓣．体外培养1周后取瓣叶，作苏木精-伊红（H-E）染色和扫描电镜观察，检测羟脯氨酸和DNA含量，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测瓣膜Ⅰ型胶原、赖氨酰氧化酶（LOX）mRNA表达：结果：与对照组比较，实验组形态学显示细胞紧密联合且胞外基质丰富，羟脯氨酸和DNA含量值增高，Ⅰ型胶原、LOX mRNA表达增强：结论：RGD肽表面修饰去细胞瓣，提高天然支架细胞黏附性，促进种子细胞生长、繁殖与细胞外基质分泌，有利TEHV构建。     

牛心包组织工程心脏瓣膜支架脱细胞的研究

目的 研究去污剂-酶消化法、胰蛋白酶消化法和去氧胆酸钠法,去除新鲜牛心包组织细胞的效果和保护基质的能力,为组织工程心脏瓣膜的构建提供较满意的支架材料.方法 分别采用去污剂-酶消化法、胰蛋白酶消化法和去氧胆酸钠法,处理新鲜牛心包组织,光学显微镜、扫描电镜观察脱细胞效果和胶原纤维、弹力纤维改变;热皱缩实验、拉力测试观察基质的物理性能变化;DNA抽提比较脱细胞前后细胞数量差异.结果 3种方法均能完全去除细胞,与去污剂-酶消化法比较,其他2种方法对基质的破坏明显.结论 去污剂-酶消化法脱细胞效果好,且具有良好的保护基质能力.     

牛心包组织工程心脏瓣膜支架脱细胞的研究

目的研究去污剂-酶消化法、胰蛋白酶消化法和去氧胆酸钠法,去除新鲜牛心包组织细胞的效果和保护基质的能力,为组织工程心脏瓣膜的构建提供较满意的支架材料。方法分别采用去污剂-酶消化法、胰蛋白酶消化法和去氧胆酸钠法,处理新鲜牛心包组织,光学显微镜、扫描电镜观察脱细胞效果和胶原纤维、弹力纤维改变;热皱缩实验、拉力测试观察基质的物理性能变化;DNA抽提比较脱细胞前后细胞数量差异。结果3种方法均能完全去除细胞,与去污剂-酶消化法比较,其他2种方法对基质的破坏明显。结论去污剂-酶消化法脱细胞效果好,且具有良好的保护基质能力。     

不同脱细胞方法对猪主动脉瓣生物学特性的影响

目的研究不同脱细胞方法对猪主动脉瓣的生物学特性的影响。方法新鲜猪主动脉瓣叶随机分为4组：新鲜瓣叶对照组（组Ⅰ）及脱细胞组（组Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）。脱细胞处理：组Ⅱ用0.05%胰蛋白酶;组Ⅲ用1 Tri-tonX-100＋核酸酶;组Ⅳ用1 TritonX-100＋核酸酶＋0.05%胰蛋白酶。瓣叶分别于大鼠皮下包埋;测定生物学特性;血小板液中孵育,观察血小板黏附情况。结果组Ⅱ瓣叶纤维结构受损,极限抗张强度明显下降（P〈0.05）,其余2组脱细胞组性能无明显变化。组Ⅳ瓣叶皮下包埋的炎症反应较组Ⅱ、Ⅲ为轻。血小板黏附性组Ⅳ瓣叶反应较组Ⅱ、Ⅲ为轻。结论组Ⅳ脱细胞方法能更好的降低瓣叶的免疫原性并保持其生物学特性,是一种较为理想地脱细胞方法。     

脱细胞处理对猪主动脉瓣与同种瓣组织构成及免疫差异的影响

目的研究脱细胞前后猪主动脉瓣瓣膜与人同种主动脉瓣的组织构成及免疫差异,探讨清除猪主动脉瓣异种抗原的方法。方法选购液氮冻存人主动脉瓣3条,猪主动脉瓣(液氮保存)4条,使用胰蛋白酶脱细胞处理,制作脱细胞瓣膜支架,分同种瓣-同种瓣脱细胞-猪主动脉瓣-猪主动脉瓣脱细胞4组,提取瓣膜蛋白,使用SDS-PAGE电泳法分析各组蛋白构成;使用各组蛋白提取物诱导U-937细胞移动,测定细胞移动量,分析瓣膜支架存在的免疫原性。结果胰蛋白酶可有效清除瓣膜细胞。SDS-PAGE蛋白电泳显示,猪主动脉瓣叶成分较同种主动脉瓣叶蛋白组成存在明显差异。脱细胞处理可显著减小猪主动脉瓣与脱细胞同种瓣的差异,但在26 000～43 000之间猪主动脉瓣叶蛋白组分仍明显较同种主动脉瓣叶条带多。U-937细胞移动实验显示脱细胞处理可明显减少细胞移动量,但比较脱细胞同种瓣,脱细胞猪主动脉瓣诱导细胞移动量较多(P<0.05)。结论胰蛋白酶脱细胞处理可降低猪主动脉瓣及同种瓣免疫原性。脱细胞处理后的瓣膜支架存在一定抗原性,其中以猪主动脉瓣脱细胞后抗原性仍较强。     

不同脱细胞方法对猪主动脉瓣的组织学及生物力学特性的影响

目的:研究不同脱细胞方法对猪主动脉瓣的组织学及生物力学特性的影响。方法:瓣叶随机分为5组:新鲜瓣叶对照组(组Ⅰ)及脱细胞组(组Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)。脱细胞处理:组Ⅱ用1％Triton X-100+核酸酶;组Ⅲ用0.01％胰蛋白酶+核酸酶;组Ⅳ用0.05％胰蛋白酶;组Ⅴ用1％Triton X-100+0.01％胰蛋白酶+核酸酶。瓣叶分别行大鼠皮下包埋,并测定生物力学特性。结果:组Ⅳ瓣叶纤维结构受损,其极限抗张强度明显下降(P<0.05),其余3个脱细胞组生物力学性能无变化。组Ⅳ、Ⅴ瓣叶皮下包埋的炎性反应较组Ⅱ、Ⅲ为轻。结论:1％Triton X-100+0.01％胰蛋白酶+核酸酶脱细胞法能更好地降低瓣叶的免疫原性并保持其生物力学特性,是一种较为理想的脱细胞方法。     

去细胞猪主动脉瓣的制备

目的 完全去除猪主动脉瓣的细胞,制备成去细胞猪瓣支架.方法 采用胰酶+TritonX-100制备去细胞猪瓣支架,标本进行形态、组织结构观察,并进行DNA含量和力学强度测定.以新鲜猪瓣为对照将去细胞瓣叶家兔皮下坪藏4周后分别取材,光镜进行检查.结果 采用胰酶+TritonX.100法能完全脱除猪主动脉瓣膜细胞,去细胞后瓣膜可溶性蛋白明显丢失[(0.24±0.04)%vs(0.48±0.12)%],瓣叶含水量增加[(92.2±1.5)%vs(89.2±1.6)%](P<0.01),但去细胞猪瓣仍保持了良好纤维支架结构,热皱缩温度[(67.9±1.0)℃vs(68.8±0.8)℃]和断裂强度[(489.3±19.0)g/mm2vs(540.7±19.5)g/mm2]未见显著变化(P>0.01).埋藏于兔皮下的去细胞猪主动脉瓣有轻微组织反应,可见少量中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞浸润,炎性反应明显轻于新鲜猪瓣组.结论 成功制备去细胞猪瓣支架,并保持良好的纤维支架结构和机械强度,抗原性轻微.     

S100A11对主动脉夹层的影响及其机制

目的 探讨S100A11在主动脉夹层(aortic dissection, AD)中的作用及其可能的机制。方法 在体内实验中,通过饮水摄入β-氨基丙腈建立AD模型。构建S100A11-shRNA慢病毒载体,尾静脉注射AD模型大鼠。HE染色观察主动脉的病理变化,TUNEL染色观察细胞凋亡,免疫组化法检测S100A11、RAGE、p-p38蛋白表达,Western blot检测MMP-2、MMP-9、Bax、Bcl-2、PCNA和ki67蛋白表达水平。在体外实验中,利用pIRES2-GFP将S100A11过表达载体转染至人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)中。流式检测细胞凋亡,Western blot检测RAGE/p38MAPK通路及MMP-2、MMP-9、Bax、Bcl-2、PCNA、ki67蛋白表达。最后用RAGE抑制剂FPS ZM1和p38抑制剂SB203580处理细胞,Western blot检测相关蛋白的表达。结果 sh-S100A11能够缓解主动脉病理变化,减少细胞凋亡。与正常组和假手术组相比,AD模型大鼠S100A11、RAGE、p-p38、MMP-2、MMP-9和Bax水平升高,Bcl-2、PCNA和ki67水平降低,而Lv-S100A11-shRNA组趋势相反。细胞实验结果显示S100A11可通过RAGE-p38MAPK通路靶向下游基因MMP-2、MMP-9、Bax、Bcl-2、PCNA和ki67促进细胞凋亡。结论 S100A11基因在AD大鼠中有较高水平表达,干扰或过表达该基因表明S100A11可通过RAGE-p38MAPK通路促进细胞凋亡,提示S100A11可能是AD诊断和治疗的靶点之一。     

钙结合蛋白S100A1与心力衰竭

钙结合蛋白S100A1被认为是一种钙依赖性心脏收缩因子.心力衰竭时S100A1蛋白表达减低,增加S100A1蛋白表达可通过调节心肌钙转运、抑制心室重构、减少心肌细胞凋亡和恢复心肌能量供应等机制增加心脏收缩功能,因此恢复衰竭心肌内S100A1蛋白水平是治疗心力衰竭的有效措施.     

UF-100清洁剂的研制与初步应用

目的：研制一种质优价廉新型清洁剂来取代价格昂贵的原装配套清洁剂（CELL-CLEAN）,以降低试剂成本。方法：将尿素、SDS、吐温80及脱色剂等按一定比例配制成9种不同浓度的试剂,运用正交试验优化设计出最佳配方。用原装配套清洁剂清洗仪器后对抽取的临床患者100份尿液样本进行检测,再用新型清洁剂反复清洗UF-100尿沉渣分析仪后,对这100份尿液样本再次进行检测,对实验结果进行比较分析。结果：自研清洁剂与UF-100尿液沉渣分析仪的原装配套清洁剂相比较,五种有形成分检测结果均无显著性差异（P〉0.05）。结论：新型清洁剂清洗效果满足要求,可以取代UF-100原装配套清洁剂,具有推广应用价值。