人ski基因真核表达载体的构建及促细胞增殖作用

背景：c-Ski既可促进组织修复,又能降低瘢痕形成,有望成为一个全新的基因治疗药物。 目的：构建人ski基因的真核表达载体,并对其促成纤维细胞增殖效果进行验证。 方法：RT-PCR法从人包皮培养原代成纤维细胞总RNA中扩增出人ski基因,连同真核表达启动子CMV克隆到pUC118载体上,酶切和测序验证后,应用脂质体将其转染到培养的大鼠皮肤成纤维细胞中。 结果与结论：酶切和测序结果证实表达质粒构建成功,Western blot显示Ski蛋白在转染细胞中成功表达,且可显著提高转染细胞的增殖效应,说明以pUC118为骨架的重组ski表达质粒具有促进大鼠皮肤成纤维细胞增殖的作用。     

NOV基因真核表达载体的构建及在大鼠真皮多能干细胞中的表达

目的 构建肾母细胞瘤过度表达(NOV)基因真核表达载体并检测其在真皮多能干细胞中的表达. 方法 利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,以新生大鼠大脑组织总RNA为模板,扩增出1 178bp的NOV基因的cDNA编码区序列,然后用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切后定向克隆入真核表达载体pEGFP-N1质粒中,用脂质体法将重组质粒转染入大鼠真皮多能干细胞中,荧光显微镜观察转染产物,RT-PCR法检测转染细胞中NOV基因表达. 结果 NOV基因cDNA正确克隆到真核表达载体pEGFP-N1质粒中;重组质粒体外转染入大鼠真皮多能干细胞后,可见转染细胞有绿色荧光表达.转染细胞中检测到NOV基因. 结论 构建成功NOV基因重组质粒,并能在大鼠真皮多能干细胞中稳定表达,为NOV基因及真皮多能干细胞的作用研究提供了有利的分子工具.     

转染碱性成纤维细胞生长因子骨髓间充质干细胞复合小肠黏膜下层构建的组织工程皮肤

背景：研究证实,小肠黏膜下层不存在免疫原性,不会引起异种移植中常见的排斥反应,是一种比较理想的人工真皮替代物。 目的：通过基因转染的方法将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至骨髓间充质干细胞,并复合猪小肠黏膜下层构建组织工程皮肤。 方法：日本大耳兔骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后,通过pCDNA3.1质粒将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至生长状态良好的骨髓间充质干细胞,并将转染后的细胞接种于制备好的猪小肠黏膜下层上,进行体外联合培养,构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况,流式细胞术检测骨髓间充质干细胞表型,WesternBlot检测pCDNA-bFGF真核表达载体转染兔骨髓间充质干细胞的结果,并观察组织工程皮肤的结构。 结果与结论：传代后骨髓间充质干细胞生长迅速,呈长梭形,形态良好。细胞的表面抗原CD90、CD44有阳性表达,而CD45为阴性。碱性成纤维细胞生长因子基因转染入兔骨髓基质干细胞并能稳定表达,转染后的骨髓间充质干细胞在猪小肠黏膜下层中生长良好,可体外构建组织工程皮肤。     

人sTRAIL基因载体构建及其在真皮干细胞的表达

背景：基于肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor，TNF)可溶性相关凋亡诱导配体(soluble related apoptosis inducing ligand, sTRAIL)抗瘤的生物特性，克隆sTRAIL基因，构建其真核表达载体，为肿瘤细胞凋亡的实验研究奠定基础。 目的：构建真核表达载体pEGFP-N1/sTRAIL，并转染真皮干细胞，以探究sTRAIL基因导入真皮干细胞的表达情况。 方法：采用RT-PCR二步法，以人胎盘组织总RNA为模板，扩增sTRAIL的cDNA序列，将其克隆入pMD18-T载体，随后亚克隆入载体pEGFP-N1中，构建其真核瞬时表达载体pEGFP-N1/sTRAIL，以Fugene 6转染技术，将sTRAIL基因导入真皮干细胞。倒置显微镜下观测转染后真皮干细胞生长变化及sTRAIL在其中的表达等情况。RT-PCR法对目的基因转染的真皮干细胞进行鉴定。 结果与结论：克隆到sTRAIL基因的cDNA序列，成功构建了其真核表达载体，该真核表达载体能携带sTRAIL基因在真皮干细胞中正常表达。倒置显微镜下观测到转染后真皮干细胞生长状态与未转染的真皮干细胞无差异。以经sTRAIL基因转染的真皮干细胞该基因组DNA为模板，用RT-PCR法能扩增到sTRAIL基因cDNA序列。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染兔骨髓间充质干细胞*☆

背景：碱性成纤维细胞生长因子对于创伤修复具有明显的促进作用,但局部应用难以持久地发挥作用。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞后的表达情况。 设计、时间及地点：细胞基因学体外观察,于2009-03/08在云南大学生命科学院完成。 材料：日本大耳白兔1只,购于昆明医学院动物科。pCDNA3.1质粒为美国Invitrogen产品。 方法：抽取兔髂前上棘骨髓,采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,待细胞融合至培养瓶底80%时消化传代。参考GeneBank碱性成纤维细胞生长因子cDNA序列设计合成基因,电泳纯化后xholⅠ、BamHⅠ双酶切回收凝胶,以限制性核酸内切酶对PcDNA Vector质粒进行酶切、电泳和凝胶回收,连接碱性成纤维细胞生长因子DNA与PcDNA Vector质粒,构建pCDNA-碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体,运用脂质体转染法将重组体转染至兔骨髓间充质干细胞中,并筛选稳定转染株。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞表面抗原的表达,Western blot法检测目的蛋白的表达。 结果：流式细胞仪检测结果示所培养细胞表面抗原呈CD90,CD44阳性,CD45呈阴性;免疫组化检测结果示骨髓间充质干细胞血管源性细胞表面抗原CD34呈阴性,而相对特异性标记物CD44呈阳性。转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞提取的细胞裂解液中,在Mr 23 000处有一条明显阳性杂交带;而转染pCDNA3.1(-)空载体的骨髓间充质干细胞提取蛋白未见阳性条带。 结论：实验成功地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞,该目的基因可稳定表达。     

碱性成纤维细胞生长因子-慢病毒真核表达载体的构建及转染

背景：以往研究多采用质粒载体,由于其转染效率不高,且转染时需借助脂质体转染剂进行转染,转染具有细胞毒性,操作复杂等难以应用于临床。 目的：构建携带人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)基因的慢病毒载体,转染成骨方向诱导的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),鉴定bFGF基因表达。 方法：实验组：设计人bFGF基因引物,用Trizol法提取胎盘组织RNA,用RT-PCR的方法扩增出bFGF基因,连接至pLenti6/V5-D-TOPO® 表达质粒,经Xho-Ⅰ、BamH-Ⅰ双酶切和DNA测序证实质粒正确构建。在脂质体转染剂Lipofectamine 2000的介导下,将bFGF-pLenti6/V5-D-TOPO表达质粒同包装质粒pLP1、pLP2、 包膜质粒pLP/VSVG 共转染293FT细胞株,收集bFGF-慢病毒上清转染诱导后第2代的兔BMSCs。对照组：设计GFP基因引物,以GFP- PMSLV-Plazmid为模板,PCR的方法扩增出GFP基因,连接至pLenti6/V5-D-TOPO® 表达质粒,构建GFP-慢病毒载体,并转染BMSCs。RT-PCR和Wetern-blot方法检测bFGF、GFP基因的表达。 结果与结论：转染48 h后,对照组BMSCs可见绿色荧光蛋白表达;实验组BMSCs在转染15 d后,RT-PCR方法扩增出bFGF基因,Western-blot检测出目的蛋白表达。提示成功构建携带人bFGF和GFP基因的真核表达载体,建立转染兔BMSCs的方法。     

肌肉转录调节因子和连接蛋白43转基因成纤维细胞移植对心肌梗死大鼠脑钠素及梗死面积的影响

背景：研究表明基因工程将成纤维细胞改造为可兴奋细胞是可能的；而真皮成纤维细胞是机体内数量最大的“种子细胞库”。 目的：观察肌肉转录调节因子（myogenic determination,MyoD）和连接蛋白43(connexin 43,Cx43)基因共转染真皮成纤维细胞后在心肌梗死部位原位移植对急性心肌梗死大鼠血浆脑钠素浓度和心肌梗死面积的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2006-06/2007-03在同济大学附属东方医院细胞治疗室和上海中医药大学动物实验中心完成。 材料：雄性SD大鼠60只随机分成正常对照组、心肌梗死对照组、正常移植组和心肌梗死移植组，每组15只。 方法：结扎左冠状动脉前降支制备心肌梗死模型。4周后再次开胸在自结扎远端紧靠结扎处，心肌梗死区与非梗死区交界处用微量注射器将100 μL经BrdU标记的MyoD/Cx43-FB细胞悬液(细胞数1.0×106 )注入左冠状动脉前降支，在结扎远端已缺血的心肌上用同样的针头于靠近心尖部、室间隔部、左室前侧壁缺血的心肌上多点多位置将另外100 μL移植细胞悬液注入到心肌内，深度约4 mm；对照组同法等量注入未含细胞的DMEM细胞培养液。 主要观察指标：细胞移植前和移植后1 d，1，2，4周动态检测血浆脑钠素浓度；同时监测各组大鼠心率、动脉压、左心室内压及左心室等容收缩期室内压最大上升速率和下降速率等血流动力学指标的变化；4周后处死大鼠取心肌标本染色后测定心肌梗死面积。 结果：①免疫组织化学检测结果显示心肌瘢痕区边缘有BrdU阳性细胞存在。②细胞移植可显著改善心肌梗死大鼠的血流动力学。③心肌梗死对照组和心肌梗死移植组大鼠的血浆脑钠素浓度较正常对照组和正常移植组明显升高(P < 0.01)；在移植后1 d、1周、2周心肌梗死移植组与心肌梗死对照组血浆脑钠素浓度差异无显著性意义，4周后明显降低（P < 0.01）。④心肌梗死移植组的梗死面积显著小于心肌梗死对照组(P < 0.01)。 结论：MyoD和Cx43基因联合转染成纤维细胞后原位移植修复坏死心肌组织，能减小梗死面积。     

基于GatewayTM系统Dec1慢病毒表达载体的构建

目的 利用GatewayTM技术构建分化型胚胎软骨发育基因1(Dec1)的慢病毒表达载体并建立稳定表达该目的基因的人胶质瘤U87细胞株.方法 从人脑胶质瘤组织中提取总RNA,经反转录得到目的cDNA.设计含有特异性酶切位点的引物,通过逆转录酶-多聚酶链反应(RT-PCR),获得用于重组的Dec1目的基因全长.将目的片段克隆至入门载体(pENTRTM 3C)中产生入门克隆.利用GatewayTM技术,将入门克隆中的目的片段转接于目的载体(pLenti6.3/V5-DEST)中产生表达克隆pLenti6.3-Dec1.在293T细胞中包装慢病毒表达载体pLenti6.3-Dec1并转染U87细胞,通过灭瘟素筛选、Western blot鉴定,获得稳定表达Dec1的U87细胞株.结果 Dec1基因全长的获取与慢病毒表达载体pLenti6.3-Dec1的构建经PCR和测序得到证实.用pLenti6.3-Dec1转染U87细胞后,通过灭瘟素筛选,获得稳定表达Dec1的U87细胞株.结论 成功构建了pLenti6.3-Dec1慢病毒表达载体并建立稳定表达Dec1的人胶质瘤U87细胞株,为深入研究Dec1分子机制奠定了基础.     

转染碱性成纤维细胞生长因子基因在成肌细胞中表达及调控系统的建立

背景：作者前期研究已经成功将碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast grouth factor, bFGF)基因转入鼠眼外肌的肌卫星细胞中，证明其能够在眼外肌的成肌细胞中表达并促进细胞增殖，促进其分化能力。 目的：进一步探讨转染后碱性成纤维细胞生长因子基因在成肌细胞中表达的调控方法。 方法：将目的基因碱性成纤维细胞生长因子与诱导表达载体pcDNA4/TO/myc-HisTMA连接，通过经菌落PCR和酶切鉴定的阳性克隆测序和EcoRⅠ and Hind Ⅲ双酶切处理和Xho Ⅰ单酶切处理验证。筛选并确定C2C12成肌细胞的抗生素的敏感性。通过脂质体转染技术，建立C2C12稳定表达pcDNA6/TR细胞系，经Western blot (蛋白印迹法)鉴定。将pcDNA4/TO/myc-孙HisTMA-bFGF转染到pcDNA6/TR-C2C12细胞系，免疫荧光法及Western blot法检测碱性成纤维细胞生长因子在四环素诱导的转染了pcDNA4/TO/myc-HisTMA-bFGF的C2C12细胞内的表达及其分泌情况，并设对照。 结果与结论：①经测序对照，双酶及单酶切处理均证实碱性成纤维细胞生长因子与诱导表达载体pcDNA4/TO/myc-HisTMA成功连接。②blasticidin对C2C12细胞的最小致死浓度为10 mg/L，zeocin对C2C12细胞的最小致死质量浓度为750 mg/L。③建立的pcDNA6/TR- C2C12细胞系正确。④经四环素处理的转染了pcDNA4/TO/myc-HisTMA- bFGF的成肌细胞基因表达阳性，未经处理的则为阴性；经四环素处理的转染了pcDNA4/TO/myc- HisTMA-bFGF的成肌细胞产生碱性成纤维细胞生长因子蛋白，24 h达高峰，未处理的则不能产生碱性成纤维细胞生长因子蛋白。结果提示应用四环素抑制调节系统，可以调节碱性成纤维细胞生长因子基因在成肌细胞中的表达。     

长波紫外线照射皮肤成纤维细胞表皮生长因子受体的表达*☆

背景：长波紫外线与人体皮肤老化关系密切,主要作用于表皮和真皮全层。 目的：观察长波紫外线照射对体外培养的皮肤成纤维细胞的表皮生长因子受体表达的影响。 方法：体外培养人成纤维细胞,将细胞分为对照组、长波紫外线照射5,10,20 J/cm2组。照射24 h后,分别用实时PCR和Western blot检测表皮生长因子受体mRNA和蛋白的表达情况。 结果与结论：体外培养的皮肤成纤维细胞随着长波紫外线照射剂量的增加,表皮生长因子受体的mRNA与蛋白水平均显著增加,提示长波紫外线可以诱导成纤维细胞里的表皮生长因子的表达。