人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况。结果PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank序列号NM_000209)序列一致。证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1中。Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达。结论成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达。     

人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达.方法 以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因.序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况.结果 PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1, 经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和 850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank 序列号NM_000209)序列一致.证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1 中.Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达.结论 成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达.     

乙肝病毒抗原基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)相关抗原基因真核表达载体,检测各抗原基因在体外真核细胞中的表达情况.方法:以含有1.3倍的HBV全基因组序列的质粒PcDNA3.1-HBV为模板,PCR扩增HBV的各抗原基因片段,通过连接至中间克隆载体Peasy-T1-Simple,酶切及测序鉴定正确后,...     

人乙酰肝素酶基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建人乙酰肝素酶基因（HPA）的真核表达载体pEGFP-N1/HPA,初步探讨其在人胚肾细胞293T中的表达情况.方法 以pOTB7/HPA质粒为模板,PCR扩增HPA基冈,经限制性内切酶酶切后,连接到pEGFP-N1载体上,并对重组表达载体pEGFP-N1/HPA进行酶切与测序鉴定.用脂质体lipefectmi...     

人GM-CSF基因真核表达载体构建与表达

【目的】构建以基因佐剂hGM-CSF基因为基础的真核表达质粒pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞HeLa中表达与鉴定。【方法】采用聚合酶链反应从载体pORF-hGM-CSF中,扩增出hGM-CSF基因,克隆到双顺反子真核表达载体pIRES的多克隆位点B（MCSB）中,构建pIGM-CSF真核表达载体。然后采用脂质体转染法将其转染HeLa细胞,用RT-PCR在RNA水平和ELISA在蛋白水平检测其在真核细胞中的表达。【结果】所克隆hGM-CSF基因片段经测序完全正确;重组质粒转染Hela细胞后,检测有hGM-CSF表达。【结论】成功构建含基因佐剂真核表达载体pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞中能有效表达,为继续克隆目的抗原从而构建双顺反子真核表达质粒奠定了基础。     

人IL-18基因真核表达载体的构建

目的:通过克隆人的Interleukin-18基因,构建Interleukin-18基因的哺乳动物细胞真核表达载体。方法:把人基因组DNA通过PCR获得Interleukin-18,克隆载体pMD18-T/Interleukin-18,并将其转化到大肠杆菌里,最后进行重组真核表达载体pCDNA3.1/Interleukin-18的构建和鉴定。结果:以人总DNA为模板扩增出580 bp左右的特异性条带,测序结果与GeneBank测序结果相比,除两个碱基外,其余的完全一致,翻译成的氨基酸序列相同。对重组质粒pCDNA3.1/Interleukin-18进行双酶切鉴定并测序,结果也完全一致。结论:重组质粒pCDNA3.1/Interleukin-18由真核载体pCDNA3.1和Interleukin-18片段组成。且插入的Interleukin-18片段与已知序列完全相同。     

人GM-CSF基因真核表达载体构建与表达

 【目的】构建以基因佐剂hGM-CSF基因为基础的真核表达质粒pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞HeLa中表达与鉴定。【方法】采用聚合酶链反应从载体pORF-hGM-CSF中,扩增出hGM-CSF基因,克隆到双顺反子真核表达载体pIRES的多克隆位点B（MCSB）中,构建pIGM-CSF真核表达载体。然后采用脂质体转染法将其转染HeLa细胞,用RT-PCR在RNA水平和ELISA在蛋白水平检测其在真核细胞中的表达。【结果】所克隆hGM-CSF基因片段经测序完全正确;重组质粒转染Hela细胞后,检测有hGM-CSF表达。【结论】成功构建含基因佐剂真核表达载体pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞中能有效表达,为继续克隆目的抗原从而构建双顺反子真核表达质粒奠定了基础。     

携带人尾型同源盒基因-2基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建尾型同源盒基因-2(CDX2)基因的慢病毒表达载体并进行鉴定。方法 PCR扩增CDX2基因片段后,将其克隆入慢病毒表达载体pWPI,通过PCR、酶切和测序鉴定重组质粒。重组质粒转染包装细胞293T后获得包装的病毒颗粒。病毒颗粒感染直肠癌细胞XB1847,经PCR和Western Blot证明重组慢病毒携带的CDX2在XB1847细胞内表达的情况。结果经PCR扩增、酶切及测序验证,重组质粒构建成功,命名为pWPI-CDX2。PCR和Western Blot证明重组慢病毒感染XB1847细胞后CDX2能稳定表达。结论成功构建了携带CDX2的慢病毒载体,为研究CDX2在直肠癌中的功能提供了实验基础。     

人SMRT基因真核和原核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人SMRT基因真核和原核表达载体。方法：体外人工合成SMRT-C645bp对应的基因片段,克隆至pUC57载体,酶切,测序正确后,PCR扩增目的基因片段,酶切后亚克隆至pCMV-myc载体和pGEX-6p-1载体,并酶切和测序鉴定。结果：成功构建了人pCMV-myc-SMRT真核表达载体和pGEX-6p-1-SMRT原核表达载体。结论：成功构建了人SMRT真核和原核表达载体,为下一步蛋白间相互作用的证实提供了基础。     

bFGF荧光真核表达载体构建及表达

目的 构建可在哺乳细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的荧光真核表达载体，以便进一步转染成骨细胞，研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法 应用基因重组技术，将已经克隆的bFGF基因从PBR322－bFGF载体上亚克隆到荧光真核表达载体pEGFP-C3，构建的重组质粒经脂质体介导转染3T3细胞，36h后观察瞬时表达情况。结果 ①酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入片段的正确性。②荧光显微镜下观察GFP的表达情况，观察到部分经转染的细胞发出绿色荧光；免疫组化检测bFGF的表达分泌情况，结果显示部分经转染的细胞呈阳性（棕色颗粒）。结论 成功地构建了bFGF荧光真核表达载体pEGFP-C3-bFGF，并在3T3细胞中表达了bFGF。     

人IL-37b基因真核表达载体的构建与表达

目的：构建pEGFP-N1/IL-37b真核表达载体,并检测其在THP-1细胞中的表达情况。方法：从人PBMCs中提取总RNA,利用RT-qPCR技术扩增出IL-37b基因编码区序列,克隆至pEGFP-N1真核表达载体,将构建的重组质粒pEGFP-N1/IL-37b转染到THP-1细胞中,通过RT-qPCR和Western blot检测IL-37的表达。结果：双酶切及基因测序结果显示 IL-37b基因正确插入真核表达载体pEGFP-N1中;RT-qPCR和Western blot结果显示转染THP-1细胞后,IL-37表达水平明显升高（P＜0.01）。结论：成功构建了新型抗炎因子IL-37真核表达载体pEGFP-N1/IL-37b,为进一步研究IL-37功能及与相关疾病的关系奠定基础。     

IL-2/Fc融合基因真核表达载体的构建和表达

目的：构建含人IL-2 cDNA基因和免疫球蛋白Fc片段融合基因的真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在真核细胞中表达，以期用于乙型肝炎病毒(HBV)DNA疫苗的研究。方法：应用重叠延伸剪切技术(SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段IL-2／Fc，回收后克隆到中间pGEM—T：Easy TA克隆载体，得到合适的酶切位点后，用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA 3．1中，得到真核重组载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc。然后用脂质体法转染SP2／0细胞。结果：对重组载体进行限制性酶切鉴定及测序分析，证明连接正确；经ELISA检测证实，该重组载体能够在真核细胞中外分泌表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在SP2／0细胞中有效表达。     

人CYB5R2基因真核表达载体的构建

目的构建人CYB5R2基因真核表达载体,并观察其在人鼻咽癌细胞HONE1中的表达。方法根据表达载体pCMV-Tag3A上的多克隆位点和CYB5R2基因CDS序列设计引物,应用RT-PCR从人睾丸cDNA中克隆出CYB5R2的CDS,并进行TA克隆。对经PER、双酶切和双向测序验证正确的质粒,进行CDS目的片段的回收,将其连接于pCMV-Tag3A载体的多克隆位点内构建真核载体,然后进行PCR、双酶切和双向测序验证。脂质体法转染鼻咽癌细胞HONE1细胞,荧光显微镜观察和RT—PCR验证该基因的表达。结果PCR、双酶切和双向测序结果显示pCMV-Tag3-CYB5R2-CDS真核表达载体构建成功,荧光显微镜和RT—PER的结果显示该重组质粒在HONE1细胞中正确表达。结论成功构建了pCMV-Tag3-CYB5R2-CDS真核表达载体,并在鼻咽癌细胞HONE1中表达,为进一步验证其抑癌作用及探索其抑癌机制做准备。     

NF2基因突变体真核表达载体的构建和表达

目的构建NF2突变体真核表达载体,并观察其在人胚肾细胞HEK293中的表达。方法采用分子生物学方法构建NF2突变体,将突变体克隆入真核表达载体pEGFP—N1中,进行筛选和鉴定,然后在脂质体介导下,将重组载体转染至真核细胞HEK293中,应用Western blot法检测蛋白的表达。结果通过使用重叠延伸PCR法定位突变,从野生型NF2基因cDNA模板中扩增得到预期大小的NF2突变体条带,DNA测序证实NF2突变体序列的正确性。重组载体转染HEK293后能产生merlin蛋白。结论本研究成功构建重组载体pEGFP—N1-NF2突变体,其转染HEK293后,能有效表达于HEK293中。     

人pcDNA3.1-TPX2真核表达载体的构建与表达

目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达。方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1连接后转化感受态大肠杆菌JM109,并进行酶切分析和序列测定。将构建的质粒pcDNA3.1-TPX2体外转染EC9706细胞,进行稳定筛选。用Western blot鉴定基因的表达。结果:DNA测序和BLAST比对表明克隆的人TPX2基因序列正确,进一步酶切分析显示,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并在EC9706细胞中获得稳定表达。结论:TPX2基因真核表达载体的成功构建为后续研究TPX2基因在肿瘤细胞中的功能奠定了基础。     

人白细胞介素-18真核表达载体的构建及测序分析

目的：构建含有人白细胞介素—18(IL-18)基因的真核表达载体，并对其进行测序分析。方法：通过分子克隆技术，将IL-18基因插入真核表达载体pVAX1中，构建真核表达载体pVAXl—IL—18，并经BamHI／EcoRI双酶切及测序鉴定。利用Blast程序，搜索NCBI GenBank中与重组质粒(pVAX1—IL—18)中编码IL-18基因同源的序列。结果：人IL—18基因成功地克隆至真核表达载体pVAX1中，pVAX1—IL—18中编码IL—18的序列与GenBank中所报道的IL-18编码序列完全—致。结论：成功地构建人IL—18基因真核表达载体，为其作为核酸疫苗的细胞因子佐剂奠定了基础。     

人组织激肽释放酶基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定人组织激肽释放酶基(h-TKK)基因真核表达质粒。方法 设计含pnI和BamH Ⅰ酶切住点的人组织激肤释放酶基因引物，采用PCR法从原核pBluescripe Ⅱ KSKK( )中扩增KKcDNA片段，亚克隆至padtrack-CMV真核表达裁体，转化感受态大肠杆菌DHl0B，酶切鉴定阳性重组子，并进行序列测定。结果经 PCR能扩增出738bp的片段，与预期片段大小相符，构建的重组体经酶切鉴定能切出插入片段，测序结果与预期序列完全一致。结论 成功构建了人组织激肽释放酶基因真核表达重组体pAdtrack-CMV KK。