异体表皮细胞和成纤维细胞库的建立

目的 寻找表皮细胞和成纤维细胞体外培养、鉴定、冻存与复苏的可行方法.方法 酶消化法分离表皮细胞和成纤维细胞,分别进行原代、传代培养,并对细胞进行冻存与复苏.表皮细胞进行广谱角蛋白-异硫氰酸荧光素(PAN-FITC)免疫荧光染色,成纤维细胞行波形蛋白-FITC免疫荧光染色.结果 表皮细胞呈克降样增长,以后细胞逐渐互相融合.PAN-FITC染色均为阳性.成纤维细胞的体外生长活力强,波形蛋白-FITC染色呈阳性.结论 酶消化法是表皮细胞和成纤维细胞体外培养的重要方法,本实验为构建组织工程皮肤奠定了基础.     

人角质形成细胞体外分离与无血清培养的实验研究

目的探讨一种体外人皮肤角质形成细胞分离与原代培养的方法,为角质细胞的多方面研究提供细胞来源。方法采取两步消化法对皮肤进行消化以获取角质形成细胞,采用无血清培养技术进行角质细胞的体外培养,进行细胞形态学观察以及生长曲线的绘制与分析。结果分离酶和胰蛋白酶联合两步消化法能够很好地分离表皮与真皮,活细胞率高,培养后细胞融合时间短,同时又能够避免成纤维细胞的污染,可获取较多高纯度的角质形成细胞。角质细胞无血清培养可以在体外快速稳定增殖,并在多次传代后保持了正常形态。结论两步消化法和体外无血清培养是一种理想的皮肤角质形成细胞分离培养的方法。     

犬皮肤成纤维细胞的分离、培养及鉴定

目的 探索和建立适用于犬皮肤成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的技术方法.方法 采用组织贴块培养法和胰蛋白酶、胶原酶I联合消化法对犬皮肤成纤维细胞进行体外培养、传代.并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养细胞行波形蛋白免疫荧光染色.结果 倒置相差显微镜下可见长梭形细胞生长,苏木素-伊红染色可见细胞呈漩涡状、平行排列,第5代细胞免疫荧光检测波形蛋白(vimentin)表达阳性.结论 建立了高效快速分离和稳定培养成纤维细胞的方法,为诱导犬心房纤维化提供了充足的种子细胞.     

胎鼠成纤维细胞组织块体外培养方法的改良

目的:建立改良的胎鼠成纤维细胞(MEF)体外培养的简单有效方法,为成功培养胚胎干细胞奠定基础.方法:分别应用传统的消化法和改良的组织块贴附培养法对MEF进行体外培养,倒置显微镜下观察2种培养方法培养的原代和传代培养的MEF的生长形态、结构及细胞数量的变化.结果与结论:改良组织块贴附培养法省去了消化离心过程,简单易行,培养的成纤维细胞具有良好的增殖能力,原代培养成纤维细胞增长快,细胞产出量高,明显优于消化法培养,是MEF体外培养的良好方法.     

不同方法培养SD大鼠心肌干细胞的比较

摘 要：【目的】比较不同方法分离和体外扩增SD大鼠心肌干细胞的特点。【方法】分离出SD大鼠心肌组织，分别采用组织块培养法、改良组织块培养法进行心肌干细胞原代培养；分别采用差速消化法、快速消化洗脱法进行传代。【结果】倒置相差显微镜下对培养细胞进行形态学观察，成纤维样细胞首先从组织块爬出，其后小、圆、亮细胞迁移至成纤维样细胞层上并长成大量集落。改良组织块培养法小、圆、亮细胞较易爬出；快速消化洗脱法传代可去除大量成纤维样细胞混杂。【结论】改良组织块培养法是一种良好的大鼠心肌干细胞培养方法，快速消化洗脱法传代纯化率较高。     

新生大鼠心肌细胞体外培养及其与心肌成纤维细胞形态比较

目的探索一种快速分离和培养新生大鼠心肌细胞的方法,比较心肌细胞和成纤维细胞的形态差异。方法胰蛋白酶消化法分离新生大鼠心肌细胞进行体外培养,差速贴壁法纯化心肌细胞,倒置显微镜跟踪观察心肌细胞的生长及搏动情况,台盼兰负染法检测心肌细胞活力,通过HE染色观察心肌细胞和成纤维细胞的形态学差异。结果接种24 h后细胞全部贴壁,部分细胞开始自发性搏动,48 h后,细胞体积增大,并伸出伪足,形状以三角形和梭形为主,3 d后细胞聚集成片并同步搏动且细胞活力均在90%以上。心肌细胞为梭形或三角形,胞质致密,多为单核细胞;心肌成纤维细胞呈泡状,双核和三核细胞较多,培养过程中不发生搏动。结论胰蛋白酶消化法培养新生大鼠心肌细胞快速有效,差速贴壁法纯化的心肌细胞可用于实验研究。     

人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞的原代培养和鉴定的实验研究

目的建立人皮肤角质形成细胞(keratinocyte)成纤维细胞(fibmblast)原代培养和体外连续培养的模型，为组织工程化皮肤提供充足的种子细胞。方法以5-15岁小儿包皮为材料，胰蛋白酶消化后，分离两种细胞，分别用无血清表皮培养液(K-SFM)、DMEM(10％血清)培养，对年轻细胞(2-4代角质形成细胞，10-40代成纤维细胞)均用倒置显微镜进行大体观察，透射电镜进行超微结构观察，并拍照记录，同时进行免疫细胞化学鉴定。结果消化后得到大量细胞，在培养2周后开始传代，光镜下角质形成细胞呈典型铺路石状，透射电镜下呈多边形，符合角质形成细胞特征；成纤维细胞光镜下呈梭形，放射状或漩涡状排列，电镜证实是成纤维细胞。免疫细胞化学检测：角质形成细胞鼠抗人角蛋白(AE1／AE3)单克隆抗体(mouse anti-cytokeratin)染色阳性；成纤维细胞鼠抗人Ⅰ型，Ⅲ型胶原单克隆抗体(mouse anti-TypeⅠ，ⅢCollagen)和鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(mouse anti-vim-entin)染色阳性。结论用简便易行，经济实用的方法在体外对角质形成细胞和成纤维细胞进行分离、培养和传代，能同时得到足够数量的组织工程皮肤的种子细胞。     

大鼠表皮干细胞的定位、分离和体外培养

目的：定位大鼠的表皮干细胞,探讨表皮干细胞分离和体外培养的方法。方法：用免疫组化法定位表皮干细胞。用胶原酶冷、温消化和胰蛋白酶联合消化新生鼠皮肤,获得单细胞悬液。选取在鼠尾胶原上快速贴壁的细胞为目的细胞,未快速贴壁的细胞为对照组,二者在相同条件下培养,适时传代,测定细胞克隆形成率．免疫学方法鉴定表皮干细胞。结果：毛囊隆突区细胞胞浆表达角蛋白15（K15）随年龄的增长,K15阳性细胞出现在毛母质细胞区和表皮基底层。体外培养的细胞能形成大克隆,克隆形成率为14．06％,传至第4代,细胞形态无明显改变,细胞浆内表达K15。结论：表皮干细胞位于毛囊隆突区,此研究所用的方法可以分离、纯化和培养表皮干细胞。     

不同方法体外培养兔结膜上皮细胞的比较研究

目的比较不同方法体外培养兔结膜上皮细胞的效率，确定体外培养兔结膜上皮细胞的最佳方法，建立兔结膜上皮细胞系，为进一步研究结膜上皮干细胞的鉴别、定位及其增殖分化提供基础。方法分别采用DispaseⅡ消化法、组织块培养法、胰酶／EDTA混合消化法获得兔结膜上皮细胞后进行体外培养，在不同时间观察细胞的形态，并应用免疫组化的方法进行细胞鉴定。结果组织块培养法细胞生长较慢，胰酶／EDTA混合消化法容易有成纤维细胞等污染，DispaseⅡ化法能够获得大量的较纯净的结膜上皮细胞，细胞生长增殖快，免疫荧光pan-cytoeratin染色阳性．部分细胞MUC5AC染色阳性。结论DispaseⅡ消化法是进行体外结膜上皮细胞培养的最佳方法。     

ES细胞源表皮样干细胞与胶原海绵体外构建组织工程化皮肤

【目的】 探讨以ES细胞源表皮样干细胞构建组织工程皮肤的方法，为构建新的组织工程皮肤奠定基础。【方法】 先把成纤维细胞放置于胶原海绵真皮支架内，体外培养2d，再放置ES细胞源表皮样干细胞，体外培养3d，观察其形态和进行免疫组化检测。【结果】 成纤维细胞与ES细胞源表皮样干细胞均在真皮支架内黏附，免疫组化表明ES细胞源表皮样干细胞仍呈Bl整合素强阳性和CK15、CK19阳性。【结论】 结果提示ES细胞源表皮样干细胞在体外构建的组织工程化皮肤内仍维持未分化状态。     

成纤维细胞体外培养过程中超微结构改变的观察

目的 观察正常人成纤维细胞体外培养过程中超微结构的变化规律。方法 将正常人二倍体成纤维细胞进行传代培养，以不同代次的细胞为实验对象，通过倒置相差显微镜与透射电镜对各代细胞进行了观察。结果 45代以内的细胞生长较迅速，45代后的细胞生长逐渐缓慢，65代细胞几乎无增殖趋势。40代以内细胞的超微结构无明显变化，41—65代细胞出现核膜内折，细胞核／浆比例减小，细胞表面突起和微绒毛减少。结论 各代成纤维细胞超微结构改变程度不同。41代后变化明显。     

bFGF基因转染的牙龈成纤维细胞与脱细胞真皮基质复合物的体外构建

目的研究碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因修饰的牙龈成纤维细胞（GFs）与组织工程支架材料脱细胞真皮基质（ADM）复合后的生长、结合情况,为基因治疗与组织工程联合应用于牙周组织缺损再生治疗提供依据。方法将转染bFGF的GFs接种于ADM真皮面,通过荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、透射电镜及组织学检查,观察细胞的生长状况及其与支架材料的复合情况。结果基因修饰的牙龈成纤维细胞复合ADM膜后生长良好,24 h细胞已贴附、伸展。透射电镜可见细胞在支架材料中生长,并与支架材料结合紧密。结论转染bFGF基因的的GFs与ADM膜复合物有望应用于牙周组织工程。     

在动态旋转系统中构建小口径组织工程化血管的实验研究

目的探索在动态旋转系统中构建小口径组织工程化血管的可行性。方法将新型可降解材料聚羟基丁酸酯（PHB）做成多孔状PHB＋胶原包埋管形支架。采用酶消化法和组织块法分别培养人脐静脉血管内皮细胞、人脐动脉血管平滑肌细胞和人成纤维细胞的混合细胞悬液接种于胶原包埋的PHB内腔面,采用动态旋转系统下培养3周,行大体观察和扫描电镜观察。结果在动态旋转系统中构建的小口径组织工程化血管,在细胞结构上形成均匀血管组织。结论在动态旋转系统下构建组织工程化血管是可行的,为下一步行混合种植后行组织工程化血管移植试验打下基础。     

组织工程化血管的种子细胞在体外培养扩增方法的实验性研究

目的为培养组织工程化血管的实验研究提供细胞来源.方法采用酶消化法和组织块法培养人脐静脉血管内皮细胞、人脐动脉血管平滑肌细胞及成纤维细胞,并进行细胞的传代、纯化、鉴定以及形态学观察.结果培养细胞符合血管内皮细胞、血管平滑肌细胞及成纤维细胞的各有形态特征.结论所培养的细胞有望作为体外构建组织工程化血管的应用.     

自体皮肤组织培养的实验研究

本研究应用不同来源皮肤组织进行表皮细胞培养获得成功，其结果证明：应用组织块培养成功率高，接种后２４小时后细胞开始生长，２－３周表皮细胞融合连片，表皮细胞层达５－６层，可用于临床，同时还发现，应用胶原做底层，表皮细胞生长快，融合连片快，在表皮细胞生长的同时成纤维细胞也生长，且生长速度快，阻碍表皮细胞的生长，用０．２５％胰蛋白酶与０．１％ＥＤＴＡ２：１混合液去除成纤维细胞效果较好，是细胞培养获得成功的     

以表皮干细胞与HaCaT细胞为种子细胞构建组织工程皮肤的比较研究

目的 比较人表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)与人永生化角质细胞HaCaT作为种子细胞构建组织工程皮肤的差异.方法 Ⅳ型胶原快速黏附法分选表皮干细胞,无血清培养基DK-SFM培养,取第2代备用;应用DK-SFM培养HacaT细胞,取对数生长期的细胞备用;利用组织工程技术构建真皮等价物(dermal equivalent);将上述备用的两种种子细胞分别接种在真皮替代物的表面,构建组织工程皮肤,先后进行浸没培养和气-液面器官型培养,从形态学、物理特性、HE染色等方面观察比较培养物的差异.结果 以ESCs构建的组织工程皮肤收缩快,分层分化近似于正常皮肤,具有较好的张力和韧性.以HaCaT细胞构建的组织工程皮肤分层少,生长慢,张力韧性较差.两种皮肤的直径都随培养时间的增加而缩短,且在3～7 d各检测时相点间有显著性差异(P＜0.05).结论 ESCs比永生化的HaCaT细胞更适合作为种子细胞构建组织工程皮肤.     

组织工程皮肤用真皮支架细胞相容性的比较研究

目的研究几种真皮支架的细胞相容性，为构建组织工程皮肤提供资料。方法取胶原海绵、明胶海绵、PEGA和PHBV共4种真皮支架，与小鼠成纤维细胞和ES源表皮样干细胞体外培养，观察前者对后者粘附率的影响，及对成纤维细胞增殖的影响，评价真皮支架的细胞相容性。结果成纤维细胞和ES源表皮样干细胞在4种支架材料上均能粘附存活，成纤维细胞能增殖，但在胶原海绵、PHBV和PLGA支架上的增殖率明显高于明胶海绵。结论几种真皮支架的细胞相容性较好，可用于新型组织工程皮肤的构建。     

龙血竭对组织工程皮肤修复皮肤缺损的作用

[目的]观察龙血竭对组织工程皮肤修复皮肤缺损创面的促进作用.[方法]将人成纤维细胞种植入胶原海绵,人角质形成细胞种植在表层,构建组织工程皮肤,并移植入裸鼠皮肤缺损创面;实验动物随机分为4组,选用"活血圣药"龙血竭于移植后2 d分别进行创面外敷、单纯口服、创面外敷+口服治疗,并设空白对照组.组织工程皮肤移植后9 d取材检测,观察创面局部表皮厚度、真皮层中层粘连蛋白(Ln)、Ⅰ型胶原蛋白的表达及毛细血管增生情况.[结果]龙血竭能促进组织工程皮肤移植后表皮的发育及真皮层中毛细血管的增生,增强Ln、Ⅰ型胶原蛋白的分泌,龙血竭外敷+口服组效果最佳.[结论]龙血竭对组织工程皮肤修复皮肤创面有促进作用.     

人工皮肤培养模型的建立

模拟体内生理条件,采用细胞三维培养技术将角朊细胞接种在一活性真皮替代物（即成纤维细胞胶原凝胶）上,然后行气液界面培养,使角朊细胞的一些正常生长和分化的特殊提以再现,从而形成一种能应用于临床的人工皮肤。而且这一培养模型使角朊细胞、成纤维细胞和细胞外基质构成了一有机的整体,因而也是研究表皮分化、其表皮间相互关系的良好模型。     

腺病毒绿色荧光表达载体追踪皮肤组织工程种子细胞的转归

目的：用转基因技术标记组织工程种子细胞，探索一种追踪种子细胞转归的方法。方法：用腺病毒荧光表达载体转染人皮肤成纤维细胞，观察转染率及其荧光表达。再将细胞种植在真皮支架上，活体观察荧光标记的效果和持续时间。结果：所制备的腺病毒荧光表达载体能转染靶细胞，转染率＞95％。转染的细胞经一次传代后，尽管荧光强度降低，细胞轮廓仍清晰可见。细胞种植至真皮支架上，观察2周，可以在荧光显微镜下较清晰地观察到培养物活体上细胞的形态。结论：应用腺病毒荧光表达载体标记皮肤组织工程种子细胞以追踪细胞的转归是方便、可行的。