PCR扩增产物的量化检测技术

随着分子生物学的日益发展及普及，ＰＣＲ产物的定量检测受到了广泛重视。本文将近年国外报道ＰＣＲ扩增产物的量化检测技术的某些方面的原理，特点等作简要的介绍。并着重介绍杂交酶免疫测定法的优点及其广阔的应用前景。     

PCR扩增产物的量化检测技术

随着分子生物学的日益发展与普及，PCR产物的定量检测受到广泛重视。本文将近年国外报道PCR扩增产物的量化检测技术的某些方法的原理、特点等作简要的介绍。并着重介绍杂交酶免疫测定法的优点及其广阔的应用前景。     

扩增曲线异常对荧光定量PCR检测乙肝病毒核酸的影响

乙型肝炎病毒（HBV）DNA准确定量对乙型肝炎病人的治疗监测和预后判断有重要的临床指导意义。实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）是目前测定HBVDNA较为简便、敏感和特异的方法。影响实时荧光PCR准确定量的因素很多．我们在对血清HBVDNA定量检测中发现个别标本的PCR扩增曲线荧光强度增加特别不明显且不规则（以下称“异常扩增曲线”），致检测结果明显偏低，对此我们进行了分析。     

定量PCR技术

聚合酶链反应（ＰＣＲ）是模拟ＤＮＡ体内复制过程,在体外将ＤＮＡ片段加人工扩增的技术,有许多因素都可以影响ＰＣＲ的扩增效率,导致常规ＰＣＲ的特异性不强,准确性不高,为此,大量学者设计了定量ＰＣＲ技术,从克服各种因素对ＰＣＲ扩增的干扰,从而提高ＰＣＲ的特异性及准确性,本文对定量ＰＣＲ技术进行了简要的综述。     

荧光定量PCR在乙型肝炎患者检测中的临床应用

目的　探讨荧光定量 PCR( fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)定量检测血清HBV-DNA的临床应用价值。方法　采用 FQ-PCR和 ELISA法检测 1 76例乙型肝炎患者血清 HBV DNA含量和 HBV血清学标志物 ,并进行比较分析。结果　 HBs Ag、HBe Ag和抗 -HBc三项阳性 ,HBs Ag、抗 -HBe、抗 -HBc三项阳性 ,HBs Ag、HBe Ag两项阳性 ,HBs Ag、抗 -HBc阳性的样品中 ,HBV DNA阳性率分别为 95 .1 %、83 .3 %、1 0 0 .0 %、81 .8% ,DNA拷贝数/ml分别为 2 .2 9× 1 0 7、1 .2 3× 1 0 6 、8.5 1× 1 0 6 、6.61× 1 0 5,其中以抗 -HBc-Ig M阳性组 DNA拷贝数为最高。结论　 FQ-PCR法检测 HBV DNA具有灵敏度高、结果可靠的优点 ,可检测 HBV感染和复制状态 ,对于乙肝的早期诊断、传染性判断和疗效考核具有重要的指导意义。     

定量PCR检测巨细胞病毒在肾移植中的应用

巨细胞病毒（CMV）感染是肾移植受者发病和死亡的重要原因。本文就定量PCR在预测肾移植受者CMV感染的症状发作期及监测更昔洛韦的疗效等方面的价值进行阐述。     

定量PCR

随着分子生物学在医学领域的广泛应用，对检测标本的核酸定量已显得十分必要，ＰＣＲ技术是一种较为理想的方法，本文介绍了近几年国外在这方面的研究进展。     

定量聚合酶链反应测定技术

聚合酶链反应 (ＰＣＲ)现已广泛用于涉及到核酸的科学研究以及临床疾病的诊断和治疗监测。由于ＰＣＲ是对原始待测模板核酸的一个扩增过程 ,任何干扰ＰＣＲ指数扩增的因素都会影响扩增产物的量 ,使得ＰＣＲ扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系 ,通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量。近年来 ,研究人员为克服上述影响因素 ,研究了各种相对准确的定量ＰＣＲ方法[1 3] 。一、ＰＣＲ扩增的理论模式在ＰＣＲ中 ,随着扩增周期的增加 ,模板以指数方式进行扩增。每一扩增周期后产物的量可用下式表达 :Ｙｎ=Ｙｎ - …     

应用生物发光技术检测DNA聚合酶活性

目的　建立一种简便而且快速的检测 DNA聚合酶活性的方法。方法　 DNA聚合酶所催化的反应会产生定量的焦磷酸 ,利用 ATP硫酰化酶将焦磷酸定量转化成 ATP,然后利用虫荧光素酶系统发光检测 ATP,从而确定 DNA聚合酶活性。结果　实验表明焦磷酸量在 ( 1× 1 0 - 9～ 5× 1 0 - 7) mol/L 范围内线性关系良好。结论　本方法是一种操作简便、灵敏度高的检测 DNA聚合酶活性的方法     

定量PCR的研究进展

定量PCR技术是在PCR定性技术基础上发展起来的基因定量技术，克服了原有的PCR技术存在的不足，能准确敏感地测定模板浓度及检测基因变异等。本文就定量PCR技术中的竞争性PCR和荧光定量PCR技术作一综述，以便更好地理解及应用这项技术。     

聚合酶链反应反向斑点杂交快速检测及鉴定念珠菌

目的　研究以非培养为基础的快速检测与鉴定念珠菌的方法。方法　将白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌种特异探针加尾后固定在硝酸纤维素膜上;用氯化苄法提取念珠菌ＤＮＡ,采用真菌特异通用引物ＰＣＲ 扩增ＤＮＡ,在扩增过程中用Ｂｉｏ１１ｄＵＴＰ 标记扩增产物,然后分别与白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌特异探针杂交。结果　对１４ 种念珠菌扩增均为阳性,对３ 种常见细菌扩增均为阴性。３ 种念珠菌只与其对应探针杂交。结论　该方法简便、快速、准确,适于临床实验室快速检测与鉴定念珠菌。     

多重聚合酶链反应鉴别单核细胞增生李斯特菌的研究

目的：建立一种快速有效地鉴定李斯特菌属和鉴别单核细胞增生李斯特菌（Lm)的方法。方法：以具有李斯特菌种、属特异性的iap基因和Lm特异的溶血素基因（hlyA)为靶目标，分别设计双重聚合酶链反应（PCR）和三重PCR鉴别李斯特菌，并比较2种PCR方法的特异性。结果：双重和三重PCR方法检测李斯特菌属和Lm标准株，均具有良好的特异性：进行三重PCR检测，可出现3个条带，其中2条为Lm的特征性条带（700，4200bp)，另1条为其他李斯特菌的iap基因片段（1200bp)，但是双重PCR不能鉴别部分Lm食品分离株，而三重PCR则可以鉴别。结论：建立的三重PCR法可用于李斯特菌属细菌特异性鉴定和混合培养物中Lm的特异性鉴别。     

快速反相杂交法检测HBV DNA

为建立一种简便快速的核酸探针杂交法检测 Ｐ Ｃ Ｒ扩增产物中的 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ,将 Ｐ Ｃ Ｒ 上游引物用生物素标记后进行扩增;核酸探针固定于硝酸纤维素膜上,与带有生物素的 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增产物杂交,杂交信号用链霉亲和素 酶结合物显色检测。结果表明,该法检测的敏感性为 ５ ｆｇ,杂交时间为４０ 分钟。２００ 例临床标本检测的阳性率（２７５％ ）高于琼脂糖电泳法（２４５％ ）。同时具有操作简便的特点,可作为 Ｐ Ｃ Ｒ扩增产物中 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 的常规检测方法。     

HLA—DQB1基因分型技术

报告了简便、快速的ＨＬＡ－ＤＱＢ１聚合酶链反应一序列特异性引物（ＰＣＲ－ＳＳＰ）基因分型技术。比较了基因分型与血清学分型技术的结果，其中３３份标本中６份血清型结果（１８．２％）与基因型不吻合。还讨论了基因分型的意义     

聚合酶链反应检测宫颈癌的前瞻性研究

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）对宫颈癌、宫颈糜烂、正常宫颈组织各５０例进行了人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）的检查。结果提示从宫颈正常组织到癌，ＨＰＶ＿１６、ＨＰＶ＿１８的检出率逐渐升高，尤其ＨＰＶ＿１６呈明显梯度关系，宫颈癌检出率显著高于正常组织及炎症组织（Ｐ＜０．０１）。说明宫颈组织自身ＨＰＶ＿１６的感染率与宫颈癌的发生密切相关，与ＨＰＶ＿１８有一定的联系。通过癌旁组织，宫颈糜烂组织及正常宫颈刮片检测出不同的ＨＰＶ＿１６阳性率的分析，说明ＨＰＶ感染是癌发前的重要因素，指出凡检出ＨＰＶ＿１６阳性者应视为“高危人群”给予长期密切监护治疗。     

聚合酶链反应同时检测五种腹泻致病菌的初步研究

目的探索一种快速、经济、敏感的诊断方法，对常见的腹泻致病菌进行基因检测研究。方法建立一种快速标本处理和多重聚合酶链反应（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ）诊断方法，在一次ＰＣＲ反应中同时扩增５种菌的致病基因：志贺菌及侵袭性大肠埃希菌的侵袭性质粒（ｉａｌ）基因、副溶血性弧菌的热稳定直接溶血素（ｔｄｈ）基因、Ｏ１群霍乱弧菌的霍乱毒素Ａ亚单位（ｃｔｘＡ）基因和产不耐热肠毒素大肠埃希菌的不耐热肠毒素Ｂ亚单位（ＬＴ－Ｂ）基因。扩增产物经电泳，出现与已知阳性对照细菌条带大小一致的条带即判断为该标本阳性。结果对一组常规培养生化鉴定法诊断为霍乱的２６份腹泻患者标本检测后，ＰＣＲ法有２４份检测到ｃｔｘＡ基因，ＰＣＲ阴性的２份为非Ｏ１群；另一组５６份粪标本分别检测到了ｉａｌ、ｔｄｈ、ＬＴ－Ｂ基因，ＰＣＲ法较培养法阳性率高。结论该方法具有简便、快速、特异、经济和不需培养等特点，适于临床应用。     

双温聚合酶链反应检测EB病毒

应用双温循环ＰＣＲ（聚合酶链反应）方法检测鼻咽癌石蜡包埋组织、活检或冰冻组织、患者鼻咽拭子或血液中的ＥＢ病毒（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒｖｉｒｕｓ）ＤＮＡ。模板ＤＮＡ制备方法简便，无需酚提取步骤；双温ＰＣＲ快速（约需１．５小时）、灵敏。目前已用于临床检验。     

小片段PCR产物对布鲁菌种属鉴定的研究

目的 应用小片段PCR产物对布鲁菌进行快速种属鉴定.方法 收集2008年1月至2009年6月在吉林省松原地区从92例布鲁菌病患者血液中分离出的布鲁菌13株,其中羊布鲁菌9株,牛布鲁菌2株,猪布鲁菌2株.根据布鲁菌属细菌重复插入序列IS711及羊布鲁菌、牛布鲁菌及猪布鲁菌种间特异性基因片段设计引物,对3株布鲁菌标准菌株及13株临床分离布鲁菌分别进行PCR反应,获得相应PCR产物.将PCR产物T-A克隆并进行测序分析.对布鲁菌标准菌株DNA模板进行稀释,对每一稀释度的DNA模板分别进行10次PCR扩增,进行灵敏度和稳定性检测.结果 4种PCR反应均可获得特异的小片段PCR产物,片段长度分别为63、67、81和83 bp,T-A克隆测序结果 与目的 基因片段比较,符合率为100%,检测模板的最低DNA浓度为1 μg/L,分别用不同的引物对相应布鲁菌DNA模板进行10次PCR扩增,均得到预期结果 .结论 本研究建立的PCR反应能鉴定布鲁菌种属,具有良好的特异性、灵敏度和稳定性.     

不同PCR方法检测轮状病毒腹泻患儿血中RV基因

目的：探讨不同聚合酶链反应(PCR)方法检测轮状病毒(RV)腹泻患儿血中RVRNA敏感性以及病毒血症的情况。方法：应用2种逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法．对30例轮状病毒腹泻患儿进行外周血血浆和单个核细胞中的RVRNA检测．阳性标本的PCR产物经琼脂糖电泳及测序证实。结果：30例轮状病毒腹泻患儿，在外周血单个核细胞中检出RVRNA 1例，血浆中RVRNA检测均阴性，2种RT-PCR方法检测结果一致。阳性标本的PCR产物经测序结果证实属于人RV VP7片段序列，与G1型相似性为94％,与G9型相似性为75％。检测出RVRNA阳性的病例有肠道外脏器损伤的表现。结论：不同PCR方法可以检测到轮状病毒腹泻患儿血中RV RNA.RV可能通过外周血单个核细胞向肠道外扩散，引起病毒血症造成肠道外脏器损伤。     

复合聚合酶链反应检测恶性疟原虫及混合感染

目的应用一种简易、快速的复合ＰＣＲ扩增系统检测恶性疟原虫及混合感染。方法以间日疟原虫（Ｐｖ）和恶性疟原虫（Ｐ．ｆ）小亚单位核糖体核糖核酸基因（ＳＳＵｒＤＮＡ）特定片段为靶基因，设计并合成引物，建立复合ＰＣＲ扩增系统。采用煮沸法快速制备ＤＮＡ模板研究本系统的敏感性和特异性，并用于临床血样的检测。结果从Ｐ．ｖ和Ｐ．ｆ感染血样中分别扩增出分子量大小为７０５ｂｐ和５７５ｂｐ的特定扩增带。而食蟹猴疟原虫、诺氏疟原虫及正常人血样均无扩增带出现。单独检测Ｐ．ｆ敏感度达到０４７×１０－６（约２虫／μｌ全血），在Ｐ．ｖ存在的情况下，检测Ｐ．ｆ敏感度为０４７×１０－５。检测１０４例疟区门诊患者冻存血标本，８４例与镜检法结果相同，并发现２４例混合感染和２例为镜检虫种鉴别失误。结论本系统敏感性高，特异性强，操作简单，并可在一次扩增中同时检出Ｐ．ｖ和Ｐ．ｆ，具有一定的推广应用价值。